Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay

Published: September 6, 2016 doi: 10.3791/54573
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Products, CBER, Food and Drug Administration

Abstract

Antistoffer mot neuraminidase (NA), det andre mest tallrike overflateprotein på influensavirus, bidra til beskyttelse mot influensa. Tradisjonelle metoder for å måle NA inhibering (NI) antistofftitere er ikke praktiske for rutinemessig serologi. Denne protokollen beskriver enzymbundet lectin assay (Ella), et praktisk alternativ metode for å måle NI titere som er utført i 96-brønners plater belagt med et stort glykoprotein substrat, fetuin. NA kløyver terminal sialinsyrer fra fetuin, utsette den nest siste sukker, galaktose. Jordnøttagglutinin (PNA) er et lektin med spesifisitet for galaktose og derfor utstrekningen av desialylering kan kvantifiseres ved hjelp av et PNA-pepperrot-peroksidase-konjugat, etterfulgt av tilsetning av et kromogent substrat peroksidase. Den optiske densitet som måles er proporsjonal med NA-aktivitet. For å måle NI antistofftitere, blir seriefortynninger av serum inkubert ved 37 ° CO / N på fetuin-belagte plater med et fast beløp of NA. Den resiproke verdi av den høyeste serumfortynning som gir ≥50% inhibering av NA-aktivitet er angitt som NI antistofftiter. Den ELLA gir et praktisk format for rutinemessig evaluering av humane antistoffresponser etter influensainfeksjon eller vaksinasjon.

Introduction

Neuraminidase (NA) er et glykoprotein som uttrykkes på overflaten av influensavirioner. Dets enzymaktivitet er nødvendig for frigjøring av nylig dannede viruspartikler fra infiserte celler 1,2. Antistoffer som hemmer NA aktivitet redusere Virustitere og sykdomssymptomer i dyremodeller 3 og korrelerer med motstand mot sykdom hos mennesker 4. En økning i NA hemming (NI) titer etter vaksinasjon kan derfor tjene en indikator på vaksinens effekt, men mange tidligere influensa immunogenisitetsstudier ikke inkluderte dette endepunktet fordi den tradisjonelle analysen for å måle NI antistofftiter er upraktisk for rutine serologi.

Den tradisjonelle metoden for å måle NI titere er basert på å kvantifisere mengden av sialinsyre som spaltes fra glykokonjugater av NA 1. Denne metode er ofte referert til som tiobarbitursyre (TBA) metode, bruker farlige kjemikalier for å konvertere sialinsyre acid til en kromofor som kan kvantifiseres ved spektrometri. Analysen er ikke egnet for testing av stort antall prøver, fordi de enkelte glass-rør blir brukt, noe som gjør det tungvint analysen. Miniatyrisering av analysen til en 96-brønners plater gir en mer praktisk format 5, men dette assay krever fortsatt bruk av giftige kjemikalier og er derfor ikke ideelt.

En alternativ analyse for å måle NI antistofftitere ble utviklet av Lambre et al. 6. Denne analyse kvantifiserer enzymaktivitet ved å måle mengden av det nest siste sukker av glykoproteiner, galaktose, som blir eksponert når sialinsyre er utgitt av NA. Siden peanøtt-agglutinin (PNA) binder seg spesifikt til galaktose, kan en PNA-pepperrot peroksydase (HRPO) konjugat anvendes for å oppnå en kolorimetrisk utlesning. Den optiske densitet som måles er derfor proporsjonal med NA-aktivitet i prøven. NI-titere blir målt ved å bestemme den høyeste fortynningenav serum som inhiberer minst 50% av NA-aktivitet. Dette enzym-bundet lektin assay (Ella) blir utført i 96-brønners plater belagt med fetuin, et sterkt glykosylert serumprotein, som substratet for NA.

En viktig faktor for analyser som måler NI titere, er kilden til NA. Dette er fordi sera fra vaksinerte eller infiserte individer inneholde antistoffer mot hemagglutinin (HA), så vel som antistoffer mot NA. Antistoffer som binder til HA kan forstyrre NA aktivitet, og derfor, for å unngå ikke-spesifikk inhibering av HA-spesifikke antistoffer, renset NA eller hel virus inneholdende et antigent-særpregede HA skal brukes i analysen. Disse virusene kan genereres av klassisk reassortment eller revers genetikk; målet er å redde et virus som inneholder HA av en undertype som ikke er relatert til målet belastning, og NA av viruset som blir studert. Analysen beskrevet i denne artikkelen, benytter influensa A-virus som er generert av revErse genetikk å inneholde HA av subtype H6 og målrettet NA fra influensa A-virus, subtyper H1N1 og H3N2 5.

Resultater generert av Ella og miniatyriserte TBA analyser viser disse metodene er sammenlignbare med tilsvarende subtype spesifisitet og sensitivitet 7. ELLA krever ikke bruk av farlige kjemikalier, og derfor er den foretrukne metode for å måle NI titer. Det er lett å utføre, med bare noen få trinn (figur 1): prøver fortynnes og overført til en fetuin-belagt plate til hvilken virus (kilden til NA) tilsettes. Platen inkuberes O / N og vasket før tilsetning av PNA-HRPO. Etter en 2 timers inkubering, er platen vasket og peroksidasesubstrat ble tilsatt; fargereaksjonen er stoppet, og endelig den optiske tettheten målt og den resiproke verdi av den prøvefortynning som resulterte i minst 50% inhibering av NA-aktivitet er rapportert som den 50% sluttpunkt titer. En intra-laboratorium studie for å vurdere reproducibility til Ella, viste at plate-til-plate variabilitet er minimal og operatør til operatør repeterbarhet resulterte i ikke mer enn to gangers forskjell i titer 7. En etterfølgende inter-laboratoriet studie av ELLA variasjon viste at analysen har god reproduserbarhet når utført i forskjellige laboratorier, og at inkludering av en standard kan ytterligere redusere variasjon i resultatene 8. Ella er egnet til å måle NI antistofftitere i serum paneler fra prekliniske og kliniske studier influensavaksine 7 og kan også brukes til å evaluere antigene forskjeller mellom NAS av influensavirus, 9.

Protocol

Alle levende reassorterte virus med avian komponenter må håndteres ved hjelp av biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) -enhanced praksis i et laboratorium som er godkjent for bruk av United States Department of Agriculture (USDA) og den institusjonelle biosikkerhet komiteen.

1. Fremstilling av reagenser og utgangsmaterialet

Merk: Se Materials tabell for å få kilden til alle reagenser.

  1. Fetuin-belagte plater
    1. Forbered belegg buffer ved å blande 10 ml 10x belegg buffer med 90 ml avionisert H 2 O.
    2. Forbered en stamløsning av fetuin ved 25 mg / ml i 1x belegg buffer og butikk i 500 mL alikvoter ved -20 ° C.
    3. Fremstille en arbeidsløsning av fetuin (25 ug / ml) umiddelbart før beleggplater ved å fortynne stamløsningen 1000-ganger i 1 x belegg buffer.
    4. Bruke en multikanal pipette for å dispensere 100 ul av arbeidsoppløsningen av fetuin i all brønner i en 96-brønns plate som har høyt protein-bindingskapasitet.
    5. Dekk hver plate med en plate forsegler deretter stable platene i grupper på 10 og pakk dem i folie.
    6. Plassere platene i et kjøleskap (2-8 ° C) i minst 18 timer før man utfører en analyse.
      Merk: Platene kan belegges på forhånd og lagres med beleggløsningen ved 2-8 ° C i opp til 2 måneder.
  2. fortynningsmidler
    1. For å fremstille fortynningsmiddel for å gjøre virus og prøvefortynninger (2- (N -morpholino) etansulfonsyre (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl2, 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Tween 20), blande 94.2 ml 1X MES, pH 6,5 med 2 ml CaCl2 (10 mg / ml), 3,3 ml 30% BSA og 0,5 ml Tween 20.
    2. For å fremstille den fortynner for PNA-HRPO (MES, pH 6,5 med 20 mM CaCl2 og 1% BSA), blande 94,7 ml 1 x MES, pH 6,5 med 2 ml CaCl2 (10 mg / ml), og 3,3 ml 30% BSA .
  3. Neuraminidase (NA)
    Merk: H6Nx virus reassortants (disse har HA av H6 subtype og NA av interesse), genereres følgende publiserte metoder 5,10. Be ampuller med inaktivert reassortant virus fra en samarbeidspartner dersom de ikke er tilgjengelige i huset. Ved bruk av inaktivert virus, bekrefter at preparatet er egnet for bruk i ELLA gjennom demonstrasjonen at inaktive prosessen ikke har en betydelig innvirkning på NA aktivitet.
    1. Culture et lager av H6Nx virus i embryonerte kyllingegg 11 og lagre 0,5 ml porsjoner av ren allantoinvæske ved -80 ° C.
    2. Bruke en ny porsjon av virus for hver analyse. Ikke fryse og tine porsjoner.
  4. Serumprøver og kontroller
    1. Varme inaktivere alle sera (testprøver for eksempel, pre- og post-vaksinasjon sera, såvel som kontroller, f.eks prøve med kjent titer NI) i et vannbad ved 56 ° C i 45-60 min. Oppbevar sera ved -20 til -70 ° C før eller etter varmebehandlingen. Hvis SAMPles skal bli testet gjentatte ganger, må flere aliquoter før frysing, slik at prøven ikke blir gjentatte ganger frosset og tint.
    2. Bruk Ella å måle NI titere av humant serum som er tilgjengelige i rimelig mengde (> 5 ml) for å identifisere minst en med lav titer og en annen med en høy titer. Lagre 100 ul alikvoter som ≤-20 ° C, slik at den samme prøven kan brukes som en kontroll i mange analyser for å spore analyseytelse.
  5. Jordnøttagglutinin (PNA) -Horseradish peroksidase (HRPO)
    1. Forbered PNA-HRPO fortynningsmiddel (MES, pH 6,5 med CaCl 2 og 1% BSA).
    2. Fremstille et PNA-HRPO lagerløsning ved å oppløse 1 mg av PNA-HRPO i 1 ml fortynningsmiddel. Oppbevar 20-200 ul porsjoner ved -20 ° C.
    3. Før bruk av en ny PNA-HRPO masse, test 1: 500, 1: 750, 1: 1000 og 1: 2000-fortynninger av denne reagens for å identifisere den mengde som resulterer i maksimal OD med den positive kontroll (bare virus) og en bakgrunn ( ingen virus) tHatten er <10% av det positive signal.
      1. Gjør kvadruplikeres virus fortynninger som beskrevet i kapittel 2.1.
      2. Overfør fortynninger til en fetuin-belagt plate, som beskrevet i avsnitt 2.2 og inkuber platen ved 37 ° C.
      3. Vask platen 16-18 timer senere og legge til 1: 500, 1: 750, 1: 1000 og 1: 2000 fortynninger av PNA-HRPO (100 ul / brønn) for å duplisere rader av platen.
      4. Fullfør analyse som beskrevet i trinn 2.3.4 til 2.3.9.
      5. Gjennom dataene for å velge den fortynning som resulterte i en maksimal signal som er> 10 ganger bakgrunnen.
    4. Umiddelbart før bruk, forberede optimal fortynning av PNA-HRPO identifisert i 1.5.3.
  6. Fremstille et stort volum av vaskebuffer (0,01 M fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Oppbevar ved romtemperatur.
  7. Klargjør peroxydasesubstrat (o-fenylendiamindihydroklorid (OPD)): Merk: alternative peroksydasesubstrater som 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB), kan benyttes
    1. Fremstille fosfat-citrat-buffer ved å oppløse en kapsel i 100 ml dH 2 O på dagen for analysen.
    2. Oppløse en tablett OPD (10 mg) i 20 ml fosfat-citratbuffer umiddelbart før bruk.
  8. Klargjør stopp løsning (1 NH 2 SO 4): legg til 27,2 ml lager 98% H 2 SO 4-973 ml dH 2 O. Bland og deretter lagre ved RT.

2. Bestemmelse av mengden av NA skal bruke i ELLA

  1. Forbered Virus fortynninger i en 96-brønns plate
    1. Tilsett 120 ul prøve fortynning (§ 1.2) i kolonner 1-11 av fortynning plate.
    2. Til kolonne 1, legge til en ekstra 96 ​​mL prøve fortynning.
    3. Tine og deretter vortex hetteglasset med virus før du legger 24 mL å duplisere brønner i kolonne 1. Dette gir en 1:10 fortynning av virus.
    4. Gjør serie to-fold fortynninger av virus i prøven fortynningsmiddel, ved å overføre120 ul fra en brønn til neste bruker rene pipettespisser for hver fortynning.
  2. Overfør Virus fortynninger til en Fetuin belagt Plate
    1. Vask fetuin-belagt plate 3 ganger med PBS-T (avsnitt 1.6), og deretter blot hver plate på absorberende papirhåndkle for å fjerne eventuelt overskudd av vaskebuffer.
    2. Tilsett 50 ul prøve fortynningsmiddel (avsnitt 1.2.1) til hver brønn i kolonner 1 til 11 av fetuin-belagt plate.
    3. Tilsett 100 ul prøve fortynning til kolonne 12 (disse brønnene er negativ kontroll).
    4. Overføre 50 ul av fortynnet virus fra kolonnene 1-11 av fortynningen platen til de tilsvarende brønner av fetuin-belagte plate.
    5. Dekk platen med en plate forsegler og deretter plassere den i en fuktet inkubator ved 37 ° C.
    6. Legg merke til tidspunktet for når resten av trinnene vil bli utført (16-18 timer senere).
  3. Fullfør NA Fastsettelse
    1. Når inkuberingen er fullført (16-18 timer), overføreplate til benken og fjern platen sealer.
    2. Vask platen 6 ganger med PBS-T (seksjon 1.7) og deretter inverteres og klapp på absorberende papirhåndkle for å sikre at all væske er blitt fjernet fra brønnene.
    3. Tilsett 100 ul / brønn HRPO-PNA-løsning (ved fortynning bestemt i 1.5.3) til alle brønner og inkuber platen i 2 timer ved RT.
    4. Mindre enn 15 minutter før inkuberingen er til ende, fremstilling av OPD-oppløsning som beskrevet i avsnitt 1.7.
    5. Vask prøveplatene 3 ganger for å fjerne den PNA-HRPO og blot tørr før tilsetning av 100 ul av OPD-substrat til hver brønn.
    6. Inkuber platen i nøyaktig 10 minutter ved RT.
    7. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 ul / brønn av 1 N svovelsyre.
    8. Bruk en plateleser for å måle optisk tetthet (OD) ved 490 nm i 0,1 sek.
    9. Lagre og eksportere alle datafiler.
  4. Velg Virus fortynning som vil bli brukt for serologi
    1. Tegn en graf som plotter OD 490 nm (dvs. lineære område av kurven).
    2. Velge viruset fortynningen som gir ca 90% av det maksimale signal og er innenfor det lineære området. Bekrefte at OD ved den valgte fortynning er minst ti ganger høyere enn bakgrunnssignalet. Bruk den valgte virus utvanning for alle analyser som benytter dette viruset lager.
      Merk: Du kan også måle NA aktivitet av viruset og bruke ~ 15-20 uU NA aktivitet / ml i ELLA.

3. Enzyme-linked lektin analyse

Merk: Figur 2 shows oppsettet av utvannings og analyseplater.

  1. Gjør prøvefortynningene
    1. Plasser varmeinaktiverte prøvene på is.
      Merk: 8 sera kan fortynnes i hver plate.
    2. For en satt opp ved hjelp av fortynninger starter på 01:10 på tvers av platen, tilsett 120 mL prøve fortynning til alle brønnene i kolonner 3-11.
    3. Til kolonne 2, tilsett 216 mL prøve fortynning og 24 mL av hver prøve. Bland prøven i brønnen ved å pipettere opp og ned 3 ganger og deretter overføre 120 mL til neste kolonne.
    4. Etter å ha endret pipettespisser, bland innholdet i godt ved å pipettere opp og ned og deretter overføre 120 mL til neste kolonne.
    5. Gjenta trinn 3.1.4 inntil prøven har blitt overført til kolonne 11, og de resterende 120 pl kastet.
  2. Legg Prøver og virus til Fetuin belagt Plate
    1. Tine en ampulle med virus, Vortex og resuspender viruset i fortynningsmiddel (avsnitt 1.2) ved fortynning som ble valgt i trinn 2.4.2. Tilberede minst 5 ml virus for hver analyseplate. Hold fortynnet virus på is inntil platene er vasket og serumprøver har blitt lagt til platen.
    2. Bestem deg for hvor mange Fetuin-belagte plater som er nødvendig for analysen (gjelder generelt fire sera per plate). Vask Fetuin belagt plate 3 ganger med PBS-T og deretter snu hver plate og blot på absorberende papir håndkle for å fjerne overflødig vaskebuffer.
    3. Bruke en multikanal pipette for å overføre 50 ul av hver serumkontroll eller prøvefortynning fra fortynningen platen i to brønner i kolonnene 2-11.
    4. Tilsett 50 ul fortynnet virus til alle brønner bortsett fra den negative kontrollen (kolonne 12).
    5. Tilsett 50 ul prøve fortynningsmiddel til brønnene i kolonne 1, og tilsett 100 ul prøve fortynningsmiddel til kolonne 12.
    6. Dekk til brønnene med en plate forsegler og bland ved å banke sider av platen eller plassere på en plate shaker ved moderat hastighet i 10 sek.
    7. Sett platen i en humidifert inkubator ved 37 ° C i 16-18 timer.
  3. Legg PNA-HRPO og fullføre analysen som beskrevet i kapittel 2.3

4. Data Analysis

  1. Avgjøre gyldigheten av analyseresultatene
    1. Bekrefte at bakgrunnsverdiene (uten virus) er mindre enn 10% av den positive kontrollen (virus og uten serum).
    2. Bekrefte at titere av kontrollsera med ballen i forskjellige analyser ved anvendelse av de samme betingelser er mindre enn 2-ganger av den middels titer.
    3. Bekreft at OD målinger av kontrollbrønner er konsistente (≤20% forskjellig), og at OD målinger av dupliserte prøvebrønner er konsistente (≤10% forskjellig).
    4. Bestem årsaken til ugyldige resultater og gjenta analysen dersom kriteriene nevnt i 4.1.1, 4.1.2 eller 4.1.3, ikke er oppfylt. Vurdere hvilke faktorer som er presentert i tabell 1 når du prøver å feilsøke.
  2. Tildele en 50% sluttpunkt Titer
    1. For hver analyseplate, subtract gjennomsnittlig bakgrunnen (uten antigen lagt til brønner) fra alle målinger.
    2. Beregn prosent inhibering ved hver serumfortynning med formelen: 100 x (OD virus bare kontroll - OD testprøve) / OD-virus bare kontroll.
    3. Identifisere den høyeste fortynning som resulterte i minst 50% inhibering av den maksimale signal.
    4. Rapport gjensidige av denne fortynningen som 50% end-point titer.
      Merk: Hvis 50% inhibering ikke ble oppnådd ved en hvilken som helst fortynning, er det titer mindre enn den første fortynning testet, for eksempel <10 når 1:10 er den første fortynning testet.
  3. Beregn 50% hemmende konsentrasjon (IC 50)
    1. Bruk fire parameter logistikk regresjoner å bestemme IC 50 titer som følger: trekke gjennomsnittet bakgrunn fra alle målinger og deretter overføre resultatene til et program som utfører regresjonsanalyse.
    2. Bruke ikke-lineær regresjon, med maksimalt innstilttil viruset bare styre og minimums satt til null, for å bestemme fortynningen som tilsvarer nøyaktig 50% inhibering.
    3. Rapporterer den resiproke verdi av denne fortynningen som IC50 titer.

Representative Results

Analysen presentert i dette manuskriptet er vist skjematisk i figur 1. Figur 2 viser den 96-brønners plate layout, og indikerer at seriefortynninger av serumprøvene blir fremstilt i en fortynning plate før de overføres til den fetuin-belagte plate. En kritisk parameter av analysen er mengden av neuraminidase som blir benyttet i analysen; Dette bestemmes ved titrering av den reassortant viruset. Eksempler på H6N1 og H6N2 virus titreringer er vist i figur 3. Hos 1:10, 1:20 og 1:40 fortynninger av H6N1, den optiske densitet var like, noe som indikerer at forholdene var slik at en maksimal avlesning ble oppnådd. Ved en 1:80 fortynning, det utlesning var omtrent 90% av det maksimale, og derfor er denne fortynning av virus ble anvendt i etterfølgende analyser. Eksempler på serum titrering er vist i figur 4. Figuren viser en human serumprøve som var titrated mot H6N1 og H6N2 virus. Hvert datapunkt viser den prosentvise inhibering av NA-aktivitet som ble oppnådd ved seriefortynninger av serum; den første serumfortynningen i H6N1 analysen var 1:80; den første fortynning av serum i H6N2 analysen var 5. Siden den høyeste fortynning som resulterer i ≥50% inhibering er NI antistofftiter, titeren av serumet vist i dette eksemplet er 640 mot NA av NC / 99 (N1) og 160 mot NA av WI / 05 (N2).

Figur 1
Fig. 1. En skjematisk av Ella protokollen (A) Bestemmelse av fortynning av antigen (virus) som skal brukes i den analysen (trinn 2 i protokollen): Virus fortynninger ble tilsatt til en fetuin belagt plate og NA-aktivitet målt ved hjelp kvantifisere terminale galaktoseresiduer gjennom binding av PNA-HRPO som beskrevet i trinn 2.3 i protokollen; (B g>) Bestemmelse av serum NI antistofftiter (trinn 3 i protokollen). Prøvene blir fortynnet og deretter overført til en fetuin-belagt plate hvor viruset er tilsatt. Platen inkuberes O / N før du legger PNA-HRPO og fullføre de nødvendige trinnene for å generere en farge reaksjon. Til slutt blir den fargereaksjonen stoppet og den optiske tetthet måles. Den gjensidige av prøven fortynning som gir minst 50% hemming av NA aktivitet er rapportert som 50% end-point titer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Diagram for å vise den Ella plate-oppstilling. Serielle fortynninger av serumprøver er tatt opp i en fortynning plate og deretter overført til en fetuin-belagt plate. 3fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på H6N1 og H6N2 virus titreringer. Serielle fortynninger av H6N1 BR / 07 (NA A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) som er vist i blå symboler) og H6N2 UR / 07 (NA av A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) vist i røde symboler) ble inkubert i 18 timer i fetuin-belagte plater, og reaktiviteten med PNA-HRPO bestemt som beskrevet. Gjennomsnitt OD 490 nm av 2 brønner er plottet mot den resiproke verdi av den fortynning viruset. Fortynningen av H6N1 velges for bruk i Ella var 1:80 og fortynning av H6N2 valgt var 01:40 fordi disse fortynninger resulterte i omtrent 90% av den maksimale optiske tetthet og var innenfor det lineære området.3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Titrering av serum mot NA av N1 (røde symboler) og N2 (blå symboler) subtyper. NA hemming titer ble målt mot reassorterte virus H6N1 NC / 99 (inneholder NA A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) og H6N2 WI / 05 (inneholder NA A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). Prosent hemning for enzymet seriefortynninger av serum er vist med den stiplede horisontale linjen som angir 50% inhibering. Na hemming titer mot NAs av A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) og A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) var to 9.3 (640) og to 7,3 ( 160), henholdsvis. klikk her for å se et større version av dette tallet.

Problem Mulige årsaker) Løsning
Svakt signal eller ikke noe platå nås på virus titrering i) lav NA enzymaktivitet
ii) virus lager ikke lagres under optimale forhold 		i) bekrefte at fortynningsmidlet har en pH som er optimal for NA-aktivitet; hvis pH er optimal, utarbeide et nytt virus lager eller konsentrere virus
ii) regrow og delmengde lager; snap-fryse ampuller på tørris før lagring ved -80 ° C
Svak eller ingen farge i positive cellekontrollbrønner i) Virus fortynning feilaktig tildelt
ii) Vial-til-ampulle variasjon i frosne alikvoter virus
iii) PNA- HRPO denaturert eller fortynnet for mye
iv) OPD feil forberedt 		Jeg); Gjenta virus titrering
ii) Titrer flere små flasker fra den samme sats for å sikre at det ikke er noen variasjon. Dersom betydelig variasjon, forberede ferske porsjoner
iii) Bruk optimal virus fortynning til retitrate PNA- HRPO
iv) Gjenta med frisk utarbeidelse av OPD
Svak eller ingen inhibering av positive kontrollsera i) For mye virus som brukes i analyse
ii) Serum forverret 		i) Gjenta virus titrering
ii) Skaffe nye sera Sjekk lagringsforhold
Inhibering av negative kontrollsera i) Utilstrekkelig varmebehandling av serum
ii) For lite virus som brukes i analyse 		i) Gjenta varmeinaktivering av serum
ii) Gjenta virus titrering
høy bakgrunn i) Mulig forurensning av plater
ii) PNA- HRPO konsentrasjon for høyt / lavt 		i) Gjenta bruker fersk belagte plater
ii) Titrer PNA-HRPO å identifisere riktig fortynning å bruke
Virus-titrering viser tydelig inhibering av NA-aktivitet ved lave fortynninger i) allantoinvæske kan inneholde substrat for NA ii) Anvendelse virus som har blitt pelletert gjennom en pute sukrose

Tabell 1. årsaksanalyse av metoder som ikke oppfyller ytelseskriteriene. Denne tabellen gir mulige årsaker og løsninger på problemer som kan oppstå når du utfører ELLA.

Discussion

Den enzym-bundet lektin-analysen er en praktisk metode for å måle NI antistofftitere i sera. Selv om ELLA ble beskrevet av Lambre et al., I 1990, har sin aksept som en standard serologiske testen vært nyere, med en rekke laboratorier som utfører analysen for å måle NI antistofftitre av kliniske prøver 12-16. Enkelte modifikasjoner kan gjøres til protokolltrinn uten en stor innvirkning på NI titere som måles. For eksempel kan PBS brukes som fortynningsmiddel, men det er svært nyttig å sammenligne virus titrering kurver i den anbefalte buffer (MES, pH 6,5) og PBS før en beslutning er tatt, som noen NA subtyper har redusert enzymaktivitet betraktelig på pH> 7,0. Når den optimale pH-verdien ikke er i bruk, kan den maksimale signal virus bli redusert, noe som resulterer i bruk av en overdreven mengde av antigen (dvs. virus) i analysen; under disse betingelser, kan analysen har redusert følsomhet.

noen non-spesifikk inhibering observeres når ubehandlet sera testes i Ella. Dette fjernes ved varmebehandling (56 ° C i 45 min), noe som indikerer nærværet av termolabile p-inhibitorer. Andre ikke-spesifikke inhibitorer (α og γ-klasse) av influensa HA er blitt beskrevet, spesielt i forhold til H3N2 virus hemagglutinering og infektivitet. Faktisk er ikke-spesifikk hemming også observert i Ella da H3N2 virus anvendes som kilde for NA; denne hemming fjernes ved behandling av serumprøvene med en liten mengde av sialidase 9.

Som for andre serologiske analyser, bør negative og positive kontroller inkluderes i hver analyse for å tilveiebringe et middel for å evaluere analyseytelse. Når analysen ikke har møtt akseptkriterier, bør årsaken identifisert. Tabell 1 gir en oversikt over mulige trinn i analysen som kan tas opp for å feilsøke problemer.

Den ELLA protokollen provided i denne rapporten benytter reassorterte virus som inneholder HA som stammer fra en avian virus, som kilde til NA. Dette presenterer en begrensning for å utføre analysen fordi det kreves tillatelse for å arbeide med lave patogene fuglevirus. H6Nx reassorterte virus kan deles mellom laboratoriene etter at de har blitt inaktivert. Derfor analysen kan skje gjennom samarbeid når laboratoriet genererer reassortant viruset har vist at inaktiveringen er fullført, og ved fremstillingen har beholdt sin NA aktivitet. Begrensningen av å bruke H6Nx reassorterte virus kan overvinnes ved hjelp av ikke-infeksiøse kilder til NA. For eksempel har noen laboratorier brukt renset rekombinant NA 17, mens andre har brukt viruslignende partikler (VLP) 15. Men verken rekombinant NA eller VLP er lett tilgjengelig, og derfor fortsetter vi å bruke influensavirus med et antigent feilaktige avian HA.

den tradisjonelleFremgangsmåten for å måle NI antistofftitere er ikke praktisk av flere grunner; av mest interesse er de skadelige kjemikalier som er nødvendig for å produsere en fargereaksjon. I tillegg er store volumer av prøve nødvendig, og analysen er tungvint å utføre. I motsetning til dette er Ella enkel å utføre og er i et format som tillater titrering av et rimelig antall prøver. Data fra studier som undersøkte ELLA variasjon viser at metoden gir reproduserbare resultater 7,8. Ella har derfor laget rutine måling av NI antistofftitre mulige, og det er forventet at det vil bli brukt oftere ved laboratorier gjennomføre serologiske studier.

Det er flere viktige skritt som må tas i betraktning når du utfører ELLA. For det første må ikke-spesifikke inhibitorer av NA-aktivitet fjernes. Disse inhibitorer er generelt termolabile og blir ødelagt ved varmebehandling ved 56 ° C i 45 minutter. Varmebehandling er tilstrekkelig til å fjerne ikke-spesific inhibitorer fra prøver når H6 reassorterte virus benyttes som kilde for NA, men når H3N2 virus anvendes i Ella, serumfaktorer som binder til hemagglutinin også forstyrre Ella og bør fjernes ved behandling med en liten mengde av sialidase før varmebehandling 9. For det andre, en overdreven mengde av antigen, dvs. reassortant H6Nx virus, bør ikke brukes, da dette reduserer sensitiviteten av analysen. Forsiktig titrering av virus er derfor et viktig skritt; mengden av antigen anvendt i hver analyse må gi et signal som ligger godt over bakgrunnen, og må være innenfor det lineære området av titreringskurven, dvs. må signalet (optisk densitet) være proporsjonal med viruset fortynning.

I tillegg til rutine serologi kan ELLA brukes til å vurdere antigene forskjeller mellom NAS i sesongens influensavirus. Denne informasjonen kan være svært nyttig når du velger virusstammer for inkludering ens vaksinekandidater og vil legge til rette for en større forståelse av immun press som fører til antigen drift av NA. I tillegg kan antigene analyse av NAs fra svin eller fugleinfluensa virus gi viktig informasjon i å bestemme pandemisk potensial for nye stammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coating buffer  KPL 50-84-01
 fetuin Sigma F3385
5x MES, pH 6.5  KD-Medical PBS-0134
CaCl2 Sigma C7902
30% BSA Sigma A8327
Tween 20 Sigma P1379
Lectin PNA-HRPO Sigma  L7759
PBS-T Sigma P3563-10PAK
o-Phenylenediamine dihydrochloride Sigma P8287
Phosphate-citrate buffer Sigma P4922
Sulfuric acid Sigma 258105
96-well  Maxisorp plates NUNC 439454
96-well round bottom well plates NUNC 267245
Plate sealers Thermo Scientific  14-245-192B
Chicken eggs Charles River Laboratories 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs
Multichannel pipette Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf 8 or 12 channel manual pipette 50-250 µl volume
Pipette tips Depends on pipettor brand Depends on pipettor brand
Plate reader, with 490 nm filter Perkin Elmer Victor V
Water bath set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models
Water bath set to 56 °C Variety of suppliers  Variety of models
Refrigerator set to 4 °C Variety of suppliers  Variety of models
Incubator set to 37 °C Variety of suppliers  Variety of models

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase. J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).
  2. Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus. J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).
  3. Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).
  4. Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man. N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).
  5. Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens. Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).
  6. Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).
  7. Couzens, L., et al. An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera. J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).
  8. Eichelberger, M. C., et al. Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity. Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).
  9. Westgeest, K. B., et al. Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses. J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).
  10. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  11. WHO. Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).
  12. Cate, T. R., et al. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects. Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).
  13. Couch, R. B., et al. Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).
  14. Fritz, R., et al. Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients. Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).
  15. Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine. N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).
  16. Monto, A. S., et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).
  17. Fritz, R., et al. A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies. J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).

Tags

Immunologi influensa vaksine serologi neuraminidase antistoff hemming
Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger,… More

Gao, J., Couzens, L., Eichelberger, M. C. Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay. J. Vis. Exp. (115), e54573, doi:10.3791/54573 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter