方法文章

通过流式细胞术对大鼠肾脏巨噬细胞进行表型表征

DOI：

10.3791/54599

⸱

2016年10月18日

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种通过流式细胞术对大鼠肾脏中常驻巨噬细胞进行表型和定量分析的详细实验方案。所获得的染色细胞还可用于其他应用，包括细胞分选、基因表达分析或功能研究，从而增加实验模型中获取的信息量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

越来越多的证据表明，炎症以及随之而来的巨噬细胞在肾脏疾病的发生和发展中发挥着重要作用。巨噬细胞是一类异质性细胞，已被证实参与肾脏损伤过程。巨噬细胞可分为两种不同表型：经典活化的巨噬细胞（M1型巨噬细胞），其可释放促炎性细胞因子并促进纤维化；以及替代性活化的巨噬细胞（M2型巨噬细胞），其与免疫调节和组织重塑功能相关。为了明确这些巨噬细胞表型在肾损伤中的作用，必须对它们进行区分和分析。然而，目前关于炎症性肾病模型中巨噬细胞亚型的表型和功能特征的研究尚少，尤其是在大鼠模型中。这一现状可能与大鼠中可用的巨噬细胞标志物有限有关，而小鼠则有更丰富的标志物资源。因此，亟需建立新的策略，以可靠地定量和表征浸润性巨噬细胞在肾脏中的含量。本文详细描述了一种用于大鼠肾脏组织消化及后续通过流式细胞术对肾脏巨噬细胞进行表型鉴定与定量分析的实验方案。简言之，将肾脏组织用胶原酶孵育消化后，通过在活细胞中同时检测CD45（白细胞共同抗原）和CD68（泛巨噬细胞标志物）来鉴定总巨噬细胞群体。随后进行表面标志物染色，包括CD86（M1标志物）和CD163（M2标志物）。实验中采用大鼠腹腔巨噬细胞作为流式细胞术检测巨噬细胞标志物的阳性对照。本方案具有较低的细胞死亡率，并可实现对多种胞内和细胞表面蛋白标志物的检测，从而避免了其他方法中常见的细胞完整性损失问题。此外，该方法所获得的细胞还可用于后续多种技术操作，包括细胞分选、mRNA或蛋白质表达研究等。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肾脏疾病是一个全球性的健康问题，其发病率不断上升，并与较高的发病率和死亡率相关1。参与肾脏损伤进展和发展的重要机制之一是炎症，主要由巨噬细胞引发。巨噬细胞在包括肾脏疾病在内的多种炎症性疾病中发挥关键作用2。因此，在急性肾损伤（AKI）或慢性肾脏病（CKD）患者肾组织活检中，已发现有大量浸润性巨噬细胞的存在3,4。近期研究表明，肾脏疾病的长期预后可能受巨噬细胞调控5,6。巨噬细胞可响应局部微环境而分化为不同表型，执行多样的生物学功能7。目前已有两种明确区分的巨噬细胞表型：经典活化的巨噬细胞（M1型巨噬细胞）和替代性活化的巨噬细胞（M2型）8。M1型巨噬细胞促进炎症反应，而M2型巨噬细胞具有抗炎作用，并参与组织修复9。因此，更深入地了解巨噬细胞的异质性，对于阐明其在肾脏病理过程中的调控机制和作用至关重要，并有助于开发新的治疗策略。

小鼠和大鼠模型已被广泛用于研究肾脏损伤中涉及的分子和细胞机制10。然而，在这些啮齿类动物中用于鉴定巨噬细胞表型的多种标志物之间存在显著差异。因此，一些在小鼠中使用的标志物（如 F4/80 或 Ly6C）并不适用于大鼠，这限制了研究结果在不同物种间的外推。此外，目前可用于描述大鼠巨噬细胞表型的标志物数量有限，这也解释了与小鼠相比，针对大鼠巨噬细胞异质性开展的研究较少。因此，有必要开发新的巨噬细胞亚群表征策略，以深入理解巨噬细胞在大鼠肾脏疾病模型中的作用。

本文描述了一种通过流式细胞术对大鼠肾脏巨噬细胞进行表型和定量分析的实验方案。该技术可进一步用于多种检测，包括细胞分选以及mRNA或蛋白质表达研究，从而深入表征巨噬细胞在肾脏疾病中的作用。

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方案

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本方案已获得当地机构动物护理和使用委员会批准，符合欧洲议会指令2010/63/EU及国家指南53/2013的规定。

1. 试剂与溶液的配制

  1. 在无菌条件下配制所有试剂和溶液，并在超净工作台内使用。将溶液保存在 4 °C。
  2. 配制染色缓冲液（含 2% 胎牛血清（FBS）的 1×杜氏磷酸盐缓冲液）。
  3. 通过将 0.5 mg 胶原酶加入每毫升生理盐水中来配制胶原酶溶液。
  4. 配制氯胺酮/赛拉嗪麻醉溶液（2:1 v/v）。

2. 肾脏灌注与提取

  1. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（75 mg/12 mg/kg 体重）对大鼠进行麻醉。轻轻夹捏一小褶皮肤，以检查动物是否已充分麻醉。随后，用兽用眼膏覆盖眼睛，防止麻醉期间眼睛干燥。注意：本实验使用4月龄的Wistar大鼠。
  2. 待大鼠完全麻醉后，将其仰卧位放置于手术台上。
  3. 用70%乙醇擦拭腹部。
  4. 从耻骨至肋缘沿中线切开腹壁皮肤和腹膜，暴露胸膜腔和腹腔。
  5. 通过腹主动脉注入生理盐水（0.9%），利用灌注系统灌注肾脏，直至肾脏内血液完全清除。在腹部水平剪断主动脉，以帮助血液排出。
  6. 从肾门处（肾静脉、肾动脉和输尿管）切断，将双侧肾脏完整取出。去囊时，用手指轻压肾脏边缘，小心分离肾包膜11。
  7. 将肾脏放入Hanks平衡盐溶液中。

3. 肾脏消化与细胞悬液制备

  1. 用剪刀将半个肾脏剪成小块，并放入1.5 ml离心管中。
    注意：以下所有浓度均按1个样本（半只大鼠肾脏）计算。
  2. 加入1 ml胶原酶溶液，在37 °C孵育30分钟。每5分钟轻轻颠倒混匀一次，确保胶原酶溶液充分接触全部组织。
  3. 收集溶液，借助推杆将液体通过40 µm滤网过滤，并用10 ml染色缓冲液重悬。
  4. 以400 × g离心15分钟。
  5. 将沉淀重悬于1 ml ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液中。室温孵育1分30秒后，加入10 ml染色缓冲液终止反应。
  6. 以400 × g离心10分钟。
  7. 将沉淀重悬于适量染色缓冲液（1 ml）中，并使用30 µm滤网过滤细胞悬液。
  8. 用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数细胞，取200万个细胞加入1.5 ml离心管中用于染色。

4. 细胞染色与流式细胞术分析

  1. 将细胞在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
  2. 用 100 µl 大鼠血清（1:100 稀释）重悬沉淀，在 4 °C 下孵育 10 分钟以阻断 Fc 受体。
  3. 加入 1 ml 染色缓冲液洗涤，然后在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
  4. 将用于细胞表面染色的抗体按每种条件加入 100 µl 染色缓冲液中混匀：CD45 APC-Cy7（1:100）、CD163 A647（4:100）以及用于检测活细胞的溶液（3:1,000）。
  5. 用抗体混合液重悬细胞沉淀，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
  6. 加入 1 ml 染色缓冲液洗涤，在 100 × g 条件下离心 5 分钟。重复此步骤一次。
  7. 加入 600 µl 固定/破膜溶液，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
  8. 用 1 ml 破膜/洗涤缓冲液洗涤两次，在 170 × g 条件下每次离心 5 分钟。
  9. 将用于胞内染色的 CD68 FITC 抗体（35:1,000）加入每种条件的 100 µl 破膜/洗涤缓冲液中。
  10. 用 CD68 抗体溶液重悬沉淀，在 4 °C 避光孵育 50 分钟。
  11. 用 1 ml 破膜/洗涤缓冲液洗涤，在 170 × g 条件下离心 5 分钟。
  12. 用 100 µl 破膜/洗涤缓冲液重悬沉淀，加入 CD86 PE 抗体（35:1,000），在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
  13. 加入 1 ml 破膜/洗涤缓冲液洗涤，在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
  14. 用 100 µl 破膜/洗涤缓冲液重悬沉淀，并转移至流式管中。
  15. 通过流式细胞术分析样品。在侧向散射光/前向散射光（SSC/FSC）门控的活细胞中确定 CD45 染色情况。第二步，在 CD68+ 细胞中分析 CD86 和 CD163 的表达水平。

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结果

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我们分析了与肾脏中浸润性巨噬细胞增多相关的肾损伤炎症实验模型中的巨噬细胞异质性。在该模型中，通过向Wistar大鼠饮用水中联合给予醛固酮（1 mg-1kg-1day）和盐（NaCl 1%）持续3周以诱导肾损伤，该方法此前已有报道12。

实验时间安排如图1所示。首先，采用机械法分离肾细胞，并进一步使用胶原酶进行酶消化处理（图1A）。随后，裂解红细胞，并通过流式细胞术检测肾脏巨噬细胞。细胞与用于膜表面标记的CD45、CD86和CD163抗体以及用于细胞内染色的CD68抗体进行孵育（图1B）。最后，根据图1C所示方案分析巨噬细胞群体的表型。

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讨论

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巨噬细胞是一类异质性细胞，在包括肾脏疾病在内的多种炎症性疾病中发挥重要作用。近年来，人们对肾脏疾病中巨噬细胞亚群的特征日益关注，因为不同的巨噬细胞亚群在肾损伤的发展过程中发挥着不同的作用，这一点已在肾小球肾炎、糖尿病肾病和肾癌的研究中得到报道14-16。在急性肾损伤的早期阶段，主要以M1型巨噬细胞为主，促进肾小管坏死和炎症反应；而在后期阶段，则观察到M2型巨噬细胞比例升高，有助于炎症消退并参与组织重塑。在慢性肾脏病中，M1和M2型巨噬细胞可同时存在，尽管M1型可能占主导地位，从而加剧并持续导致肾脏的炎症性损伤。因此，深入认识巨噬细胞亚型在肾脏疾病中的病理生理作用具有重要意义。免疫组织化学研究难以可靠地确定巨噬细胞亚群的比例17。因此，有必要开发新的技术手段，以定量分析不同表型的巨噬细胞，并阐明这些细胞在肾脏炎症反应中的具体作用。

本文描述了一种通过流式细胞术测定大鼠肾脏巨噬细胞亚群数量及表型的实验方案。在本研究中，通过给予醛固酮建立大鼠肾脏损伤的炎症模型。在此模型中，我们观察到CD45表达升高+ 和 C68...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究获得了来自FIS/FEDER（Miguel Servet项目：CP10/00479、PI13/00802和PI14/00883）、西班牙动脉粥样硬化学会、西班牙肾脏病学会以及Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo（FRIAT）对Juan Antonio Moreno的资助。Jesús Egido获得了FIS/FEDER基金PI14/00386和Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica的资助。Melania Guerrero Hue获得了Fundaciòn Conchita Rabago的资助。Alfonso Rubio Navarro获得了Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo（FRIAT）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
层流罩更快或同等设备
离心机Hettich或同等设备
流式细胞仪（FACSAria）BD Biosciences
胎牛血清BioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
胶原酶Sigma-Aldrich12/1/9001
ACK裂解缓冲液Thermo Fisher ScientificA10492-01
流式细胞术滤网BD Biosciences340626
Falcon细胞滤网Thermo Fisher Scientific352340
流式细胞术管Falcon3520525 ml 聚苯乙烯圆底管
离心管Corning centristar430791
水浴锅Memmert GmbH + Co. KGWNE 737 °C
固定/透化溶液或透化/洗涤缓冲液BD Biosciences554714
Rompum（赛拉嗪）Bayer或同等产品
Ketalar（氯胺酮）Pfizer或同等产品
Hanks’平衡盐溶液Sigma-AldrichH8264-500ML
生理盐水溶液Braun622415
抗CD45抗体（克隆：OX-1）APC-Cy7Biolegend202216稀释比例1:100
抗CD68抗体（克隆：ED1）FITCBio-RADMCA341F稀释比例35:1,000
抗CD86抗体（克隆：24F）PEBiolegend200307稀释比例35:1,000
抗CD163抗体（克隆：ED2）Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342R稀释比例4:100
活/死细胞染料 Molecular ProbesL34955稀释比例3:1,000

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
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