Summary
توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة عن المظهرية والتحليل الكمي الضامة المقيمين من الكلى الفئران عن طريق التدفق الخلوي. الخلايا الملون الناتجة يمكن أن تستخدم أيضا لتطبيقات أخرى، بما في ذلك فرز الخلايا، تحليل التعبير الجيني أو الدراسات الوظيفية، وبالتالي زيادة المعلومات التي تم الحصول عليها في النموذج التجريبي.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل المحلية المؤسسي رعاية الحيوان واللجان استخدم التالية التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي الصادر عن البرلمان الأوروبي والإرشاد القومي 53/2013.
1. إعداد الكواشف وحلول
- إعداد جميع الكواشف والحلول تحت ظروف معقمة وتستخدم تحت غطاء تدفق الصفحي. حافظ على الحلول في 4 درجات مئوية.
- إعداد عازلة تلطيخ (2٪ مصل بقري جنيني (FBS) في برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و).
- يعد حل كولاجيناز بإضافة 0.5 ملغ من كولاجيناز لكل مل من المياه المالحة.
- يعد حل التخدير الكيتامين / زيلازين (2: 1 ت / ت).
2. الكلى الإرواء واستخراج
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين (75 ملغ / 12 ملغم / كغم من وزن). بعناية قرصة أضعاف صغيرة من الجلد، للتأكد من أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية. ثم، وتغطية العينين مع مرهم بيطري لمنع جفاف بينما تحت التخدير. ملاحظة: 4-مونوتستخدم الفئران ويستار عشر من العمر في هذا الاختبار.
- مرة واحدة يتم تخدير الفئران تماما، ووضعه على طاولة العمليات الجراحية في موقف ضعيف.
- تطبيق 70٪ من الإيثانول في البطن.
- جعل شق المركزي من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق، من العانة إلى القفص الصدري، لفضح تجاويف الجنبي والبطن.
- حقن محلول ملحي (0.9٪) في الشريان الأورطي البطني ليروي الكلى باستخدام نظام نضح حتى تتم إزالة كل الدم من الكليتين. قطع الشريان الأورطي على مستوى البطن للمساعدة في الافراج الدم.
- إزالة كل من الكليتين من الفئران عن طريق قطع من نقير كلوي (الوريد الكلوي، الشريان والحالب). لdecapsulate الكلى، اضغط على حافة الكلى باستخدام الأصابع، التي تفصل بعناية كبسولة 11.
- وضع الكلى في محلول ملحي متوازن هانكس ".
الهضم 3. الكلى وتعليق خلية
- قطع نصف الكلى مع مقص الى قطع صغيرة وضعتقطع في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: يتم احتساب جميع التركيزات التالية ل1 عينة (الكلى 1/2 فأر). - إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. مزيج من قبل انعكاس كل 5 دقائق للتأكد من أن الحل كولاجيناز بالوصول إلى الأنسجة بأكملها.
- جمع الحل وتمريرها من خلال مصفاة (40 ميكرون) بمساعدة الغواص، و resuspend في 10 مل من العازلة تلطيخ.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 15 دقيقة.
- إعادة تعليق بيليه في 1 مل ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) الناشر العازلة. بعد 1 دقيقة و 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة، إضافة 10 مل من العازلة تلطيخ لوقف التفاعل.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إعادة تعليق بيليه في حجم كاف من تلطيخ عازلة (1 مل) وتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة (30 ميكرون).
- حساب عدد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات وإضافة 2 مليون خلية إلى أنبوب 1.5 مل لستاining.
4. خلية تحليل تلطيخ والتدفق الخلوي
- خلايا الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من مصل الفئران (المخفف 1: 100) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لمنع مستقبلات لكرة القدم.
- غسل بإضافة 1 مل من العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي 100 x ج لمدة 5 دقائق.
- مزيج الأجسام المضادة لتلطيخ سطح الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل حالة: CD45 APC-Cy7 (1: 100)، CD163 A647 (4: 100)، والحل للكشف عن الخلايا الحية (3: 1000).
- إعادة تعليق بيليه خلية في مزيج الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل بإضافة 1 مل من العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة.
- إضافة 600 ميكرولتر من التثبيت حل / Permeabilization لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- اغسل 2 مرات مع 1 مل العازلة Permeabilization / غسيل وأجهزة الطرد المركزي في 170 x ج لمدة 5 دقائق.
- إضافة الجسم المضاد CD68 FITC (35: 1000) لintracelتلطيخ lular إلى 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل لكل حالة.
- إعادة تعليق بيليه في حل CD68 الأجسام المضادة واحتضان 50 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- تغسل مع 1 مل العازلة Permeabilization / غسيل وأجهزة الطرد المركزي في 170 x ج لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل، إضافة CD86PE الأجسام المضادة (35: 1000)، واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل بإضافة 1 مل من Permeabilization / غسيل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل وتمريرها إلى التدفق الخلوي أنبوب.
- تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. تحديد تلطيخ CD45 في الخلايا الحية مسور في ضوء / الضوء المتناثرة إلى الأمام، متناثرة الجانبية (/ FSC SSC) نافذة. في الخطوة الثانية، وتحليل CD86 والتعبير CD163 في خلايا CD68 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتحليل بلعم عدم التجانس في نموذج تجريبي من التهاب الإصابة الكلوية يرتبط بزيادة جود تسلل الضامة في الكلى. في هذا النموذج، وكان المستحث تلف الكلى من قبل إدارة الألدوستيرون (1 ملغ -1 كغم -1 اليوم)، بالإضافة إلى الملح (كلوريد الصوديوم 1٪) في مياه الشرب لمدة 3 أسابيع في فئران ويستار، كما ذكرت سابقا 12.
يظهر الجدول الزمني للتجاربنا في الشكل 1. أولا، تم عزل خلايا الكلى باستخدام الطرق الميكانيكية ومزيد من الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز (الشكل 1A). بعد ذلك، تم هي lysed الكريات الحمراء وتم الكشف عن الضامة الكلى باستخدام التدفق الخلوي. وحضنت الخلايا مع أجسام مضادة لCD45، CD86 وCD163 للكشف الغشاء وCD68 لتلطيخ الخلايا (الشكل 1B). وأخيرا، فإن النمط الظاهري من البلاعم صتم تحليل opulations وفقا لمخطط أظهرت في الشكل 1C.
تم تحليل محتوى بلعم الكلوي عن طريق تحديد الخلايا مع الإيجابية المزدوجة للCD45 و CD68 (الشكل 2A). باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، زيادة في + / CD68 + CD45 الضامة لوحظ في الفئران المعالجة الألدوستيرون مقارنة مع مجموعة السيطرة (0.57 ± 0.16 مقابل 0.25 ± 0.02،٪ CD45 + / CD68 + الضامة في مجموع الخلايا الكلوية) ( الرقم 2، انظر إدراج الجدول). بقاء الخلية من CD45 + / CD68 + الضامة، على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي تلطيخ مع صبغة اللون البنفسجي، وبشكل روتيني أكبر من 95٪ (لا تظهر البيانات) .Thereafter، وجرى تقييم CD86 (M1 علامة) وCD163 (M2 علامة) التعبير بين CD45 + / CD68 + الخلايا. زادت إدارة الألدوستيرون محتوى CD45 + / CD68 + / CD86 + M1الضامة (2.87 ± 2.3 مقابل 1.36 ± 0.68،٪ CD45 + / CD68 + / CD86 + الضامة في مجموع CD45 + / CD68 + الخلايا) (الشكل 2). ومع ذلك، عدد قليل من CD45 + / CD68 لوحظت الضامة + / CD163 + M2 في كل من المجموعات المعالجة الألدوستيرون والسيطرة. تحليل ما إذا كان مرتبطا التعبير CD163 الأقل إلى سفك بروتين خلال بروتوكول تجريبي، كررنا هذا الإجراء، بما في ذلك عملية الهضم كولاجيناز، في الضامة معزولة عن البريتوني الفئران، كما هو موضح سابقا (13). وكما ورد في الشكل 2B، كان CD45 + / CD68 + الضامة البريتوني إيجابية لكلا CD86 وCD163 والتأكد من صحتها فائدة الأجسام المضادة المحدد وتأكيد فعالية بروتوكول لدينا لتوصيف الضامة M1 / M2 في الكلى الفئران.
للتحقق من صحة هذه النتائج،تمت دراسة الاستجابة الالتهابية المرتبطة تلف الكلى في النماذج التجريبية المذكورة أعلاه من قبل المناعية وفي الوقت الحقيقي PCR. وكما ورد في الشكل (3)، وقد لوحظت CD68 + الضامة في الألدوستيرون + ملح الفئران المعالجة، بالمقارنة مع السيطرة المتزايدة. ثم، تم تحديد علامات النمط الظاهري بلعم لتوصيف الكلوي توزيع بلعم M1 / M2. وقد لوحظ زيادة التعبير مرنا من iNOS وIFN-γ (علامات M1) بعد الألدوستيرون + الملح العلاج، في حين ARG1 أو IL-10 التعبير مرنا (M2 علامات بلعم) لم يتغير بعد إدارة الألدوستيرون. معا، وتؤكد هذه النتائج أن الألدوستيرون + إدارة الملح يتوسط التهابات M1 النمط الظاهري بلعم في الجسم الحي.
الشكل 1: بروتوكول لالكلوي خلايا عزل وكشف بلعم بواسطة التدفق الخلوي. (A) وكشف بلعم التدفق الخلوي (B). مخطط تمثيلي من الظواهر بلعم مختلفة وفقا لتوزيع مختلف لCD45، CD68، CD86 وعلامات CD163 (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: M1 و M2 بلعم علامات في الكلى من الألدوستيرون الفئران المعالجة بواسطة التدفق الخلوي التمثيلية دوت قطع CD45 تلطيخ في الخلايا الحية مسور في ضوء / الضوء المتناثرة إلى الأمام، متناثرة الجانبية (/ FSC SSC) نافذة (A، غادر. ) من تعليق الكلى في السيطرة والألدوستيرون + معاملة الحيوانات الملح. مربع داخل المؤامرات نقطة يحدد الخلايا الحيةمعربا عن CD45. وقد تم تحليل الخلايا المدرجة في هذا المربع لتحديد CD86 والتعبير CD163 في CD68 + الخلايا (A، يمين). مؤامرة نقطة لالضامة البريتوني كما تحكم إيجابية للكشف عن CD45، CD68، CD86 وCD163، وتطبيق نفس الاستراتيجية المستخدمة سابقا. يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): استجابة التهابية بعد إدارة سولت الألدوستيرون +. (A) صور الممثل CD68 تلطيخ و (ب) التحليل الكمي لمستويات مرنا تقاس RT-PCR لعلامات M1 (iNOS وINFγ) وعلامات M2 (arg1 و IL-10) في السيطرة والألدوستيرون + الفئران المعالجة الملح. البيانات صريحةإد يعني كما ± SEM. * ف <0.05 سيطرة مقابل. شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الضامة هي خلايا غير المتجانسة التي تلعب دورا مهما في الأمراض الالتهابية المختلفة، بما في ذلك اضطرابات الكلى. وهناك اهتمام متزايد في توصيف الضامة فرعية في أمراض الكلى لأن كل حيوانية بلعم يساهم بطريقة مختلفة لتنمية إصابة الكلى، كما ورد في التهاب كبيبات الكلى، اعتلال الكلية السكري وسرطان الكلى 14-16. في المراحل الأولى من الإصابة الكلوية الحادة، ويلاحظ غلبة الضامة M1، وتعزيز نخر أنبوبي والالتهابات. ومع ذلك، في مراحل لاحقة لوحظ ارتفاع محتوى الضامة M2 لحل التهاب والمشاركة في إعادة تشكيل الأنسجة. في أمراض الكلى المزمنة، سواء M1 و M2 الضامة تتعايش في وقت واحد، على الرغم من M1 قد يكون السائد، وبالتالي زيادة وإدامة تلف الكلى التهابات. لذلك، من المهم لزيادة معرفتنا دور المرضية في جسم المريض من أنواع فرعية البلاعم في أمراض الكلى. لا يمكن لدراسات المناعى تحديد النسبة المئوية لمجموعات فرعية بلعم بطريقة قوية (17). وبالتالي، فمن الضروري تطوير تقنيات جديدة لتحديد الكمية الظواهر بلعم مختلفة وفهم دور هذه الخلايا على الاستجابة للالتهابات الكلى.
توضح هذه المخطوطة بروتوكول لتحديد عدد والنمط الظاهري من مجموعات فرعية الضامة الكلى عن طريق التدفق الخلوي في الفئران. في دراستنا، وتعرض الفئران لنموذج التهابات الضرر الكلوي من قبل إدارة الألدوستيرون. في هذا النموذج، لاحظنا زيادة CD45 + وC68 + تسلل بلعم على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي وأكد المناعية. وعلاوة على ذلك، مما يؤدي إلى إثراء الضامة M1 (CD68 + / CD86 +)، ولكن ليس M2 بلعم، لوحظت في الفئران المعالجة الألدوستيرون. وتأكدت هذه النتائج مزيدا من تحديد التعبير مرنا من M1 (iNOS وIFN-γ) و M2 macrophعلامات سن (ARG1 أو IL-10). تحليل التدفق الخلوي وذكرت وفيات خلية منخفضة خلال بروتوكول العزلة. هناك العديد من العوامل التي قد تؤثر على بقاء الخلية وعلامات سطح الكشف، مثل مستوى تفارق الأنسجة وكذلك مدة ونوع من الهضم الأنسجة (الأنزيمية، ميكانيكي، وما إلى ذلك). الهضم المفرط يزيد من وفيات الخلايا وتنشيط البلاعم ويقلل التعبير سطح علامة، في حين أن تأثير معاكس قد تنجم عن انخفاض التفكك الكلى. ومع ذلك، عندما أجريت بروتوكول لدينا في الضامة معزولة عن البريتوني الفئران، ولوحظ وجود معزز للCD86 وCD163 في هذه الخلايا.
وقد تم تحسين بروتوكول لدينا لتحديد التباين بلعم في الكلى من الفئران مع ارتفاع ضغط الدم بوساطة الألدوستيرون، وبالتالي، يمكن استقراء نماذج مرض الكلى التهابات أخرى. ومع ذلك، يمكن تكييفها هذا الإجراء لكل حالة تجريبية ليعدل التهابسلامة الأنسجة، مما يؤثر على معدل الهضم الأنسجة عن طريق كولاجيناز.
من المهم أن نلاحظ أن لتقدير المحتوى الكلي للبلعم، تم إصلاح الخلايا وpermeabilized للسماح وضع العلامات الخلايا مع CD68 الأجسام المضادة 18. تضمن البروتوكول لتثبيت واستخدام الفورمالدهيد التي قد تؤثر مترافق fluorochromes إلى الأجسام المضادة الأولية، وخاصة فيكوإيريترين. لحل هذه المشكلة، تم إجراء الحضانة مع CD86-PE الأجسام المضادة بعد إضافة التثبيت / حل Permeabilization ومزيد من CD68 تلطيخ. من ناحية أخرى، من المهم أن نلاحظ أن الفورمالديهايد قد تتداخل أيضا مع المقايسات الأخرى التي يمكن أداؤها بعد الضامة العزلة، مثل فحوصات التعبير مرنا. ومع ذلك، هناك مجموعات التجارية المتاحة لعزل مرنا من خلايا الفورمالديهايد الثابتة.
وباختصار، يصف هذا البروتوكول وسيلة لتوصيف المظهري الضامة الكلى في quantitatiلقد الطريقة باستخدام التدفق الخلوي. وعموما، فإن بروتوكول الموصوفة هنا هو سهل الاستخدام، قابلة للتكرار، ومفيدة لتمييز السكان بلعم مختلفة من الكلى الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S.
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
