一种测量方法RNAñ 6 -methyladenosine细胞和组织修改

Summary

中描述了RNA测定N ⁶ -methyladenosine（M ⁶ A）修改的改进RNA印迹法。当前的方法可以检测在各种实验设计在不同的RNA修改和控制。

Abstract

N⁶-甲基腺苷 （m⁶A） RNA 修饰在真核生物中是多种多样且普遍存在的。它们存在于 mRNA、rRNA、tRNA 和 microRNA 中。最近的研究表明，这些可逆的 RNA 修饰会影响 RNA 剪接、翻译、降解和定位。多种生理过程，如昼夜节律、干细胞多能性、纤维化、甘油三酯代谢和肥胖也受 m⁶A 修饰控制。免疫沉淀/测序、质谱和改良的 Northern 印迹是通常用于测量 m⁶A 修饰的一些方法。在此，我们提出了一种用于测量 m⁶A 修饰的东北印迹技术。目前的方案为 RNA 提供了良好的大小分离，为各种实验设计提供了更好的适应和标准化，并在各种 RNA 来源中清晰地描绘了 m⁶A 修饰。虽然已知 m⁶A 修饰对与昼夜节律和肥胖相关的人类生理学有至关重要的影响，但它们在其他（病理）生理状态中的作用尚不清楚。因此，对 m⁶A 修饰的研究具有为分子生理学提供关键见解的巨大可能性。

Introduction

动态和可逆 RNA 修饰在 RNA 稳态中起重要作用。四十年前，发现 N⁶-甲基腺苷 （m⁶A） 修饰在真核转录组中含量丰富¹。它们在信使 RNA （mRNA）、核糖体 RNA （rRNA）、小核仁 RNA、转移 RNA 和 microRNA² 中具有不同的功能。mRNA 的 m⁶A 修饰影响它们的剪接³、翻译⁴、降解⁵ 和定位²。此外，它们还会影响核糖体生物发生和 microRNA 功能⁶。在单细胞细菌到多细胞人类中观察到 m⁶A RNA 修饰的进化保守性⁷。目前正在广泛探索 m⁶A 修饰的作用描述。这些努力有望为转录控制提供新的见解。最近的研究表明，mRNA⁸ 的其他化学修饰在 RNA 代谢中也起着关键作用。

昼夜节律⁹、干细胞多能性¹⁰、甘油三酯代谢⁴、纤维化¹¹、肥胖¹² 和重度抑郁症¹³ 是已知 m⁶A 修饰控制结果的几个例子。许多生物钟基因转录本具有 m⁶A 位点¹⁴。m⁶A 甲基化酶或去甲基化酶的调节会引起昼夜节律变化¹⁵。Mettl3 是一种 m⁶A 转移酶，是干细胞多能性的调节因子。Mettl3 的缺陷导致胚胎早期致死和植入后阶段的异常谱系启动¹⁰。脂肪细胞中脂肪量和肥胖相关 （FTO） 的缺乏，一种 m⁶A 去甲基化酶，通过 Angptl 的转录后调节影响脂肪酸动员和体重 ⁴。这些研究表明，m⁶A 不仅控制 mRNA 加工，而且在胚胎发育和病理生理学中起关键作用。m⁶A 修饰的功能对未来的治疗考虑具有重要意义。

有几种方法可用于测量 RNA^16-18 的 m⁶A 修饰。传统上，薄层色谱 （TLC） 和高效液相色谱 （HPLC） 用于研究 m⁶A 在几种 RNA 中的分布^19,20。质谱法是检测 RNA 中 m⁶A 修饰的灵敏工具。然而，在质谱分析之前，需要用 RNase 将 RNA 切除成短片段²¹。甲基 RNA 免疫沉淀和测序 （m⁶A-Seq）²² 使用 m⁶A 特异性抗体免疫沉淀片段化的 RNA，并进行平行 RNA 测序。这种方法生成转录组范围的 m⁶A 景观。m⁶A 单核苷酸分辨率交联和免疫沉淀 （miCLIP） 的高分辨率映射进一步以单核苷酸分辨率绘制 m⁶A 修饰²³。两种方法都提供了整个转录组中 m⁶A 修饰的详细信息，以及特定基因的信息。然而，如果实验需要比较多种条件，则两种方法的定量和标准化都很困难。此外，m⁶A-Seq 的 RNA 片段化会改变原始 RNA 结构，这可能会影响天然 m⁶A 水平。为了检测 RNA 的全局 m⁶A 修饰及其在不同实验条件下的变化，我们报道了一种采用改良的 northern 印迹方案的方法。该方法使用凝胶电泳¹⁸ 通过分子量分离 RNA。该程序为涉及多个条件或样品的实验提供了更好的标准化和定量。它还为不同的 RNA（无论是 rRNA、mRNA 还是 microRNA）提供特异性 m⁶A 修饰信息。

Protocol

注:总RNA米⁶ A级包括rRNA基因，基因，和其他小RNA。由于核糖体RNA具有丰富的米⁶一修改，m的测量⁶ A水平将需要考虑这一事实。

1. RNA分离

1. 使用核糖核酸酶净化解决方案（喷在纸巾），擦拭移液器和实验室工作台表面。无核酸酶水的湿纸巾，再次擦拭移液器和实验室工作台表面。
2. RNA提取
   1. 总RNA分离
      1. 用顶置式搅拌器，均化50-100毫克组织或5-10×10 ^6个细胞在1mL的RNA分离溶液保持在4℃。
         注:更多组织（100-150毫克）可能需要从因为较低的RNA浓度在其中的小鼠脂肪组织样品。样品从小鼠心脏，肝脏，骨骼肌，肺，脑来源，和巨噬细胞先前已经采用^4。
      2. 在cubate样品匀浆在室温下5分钟。
      3. 添加100μL的每1毫升样品匀浆1-溴-3-氯丙烷（BCP）的。摇晃试管剧烈15秒，然后继续根据制造商的说明²⁴总RNA分离。
   2. 从分离的总RNA多腺苷酸mRNA纯化
      1. 净化用可获得的试剂盒或协议多腺苷酸的mRNA。
         1. 摇彻底重新暂停各通过以下方法解决:2倍的结合溶液，寡（dT）的聚苯乙烯珠和洗涤溶液。确保寡（dT）在使用前珠温至室温。
         2. 传输的每制备洗脱溶液120微升成管并加热至70℃的加热块中。
         3. 吸取到的总RNA的500微克到离心管中。无核酸酶的水，将音量调节到250微升。
         4. 添加的2倍结合液250微升总RNA所以lution和涡简单地混合内容。
         5. 添加低聚15μL（DT）珠和涡彻底混合。
         6. 孵育在70℃下该混合物3分钟。
         7. 除去来自加热块的样品，并让它在室温下放置10分钟。
         8. 离心在15,000rpm xg离心2分钟。
         9. 小心取出上清液，留下约50微升。
         10. 加的洗涤液500微升重新悬浮，通过移液沉淀。
         11. 移液器悬挂到自旋过滤/收集管套。
         12. 离心在15,000rpm xg离心2分钟。除去从收集管色谱柱和丢弃流过。返回列至收集管。
         13. 吸取500微升洗涤液到旋转过滤器。
         14. 离心15,000× 克2分钟。
         15. 转移自旋过滤到一个新的收集管。
         16. 移液器50的洗脱液μL加热至70℃到旋转过滤器的中心。
         17. 在70℃孵育2-5分钟。离心在15,000rpm xg离心1分钟。
         18. 吸管至70℃洗脱溶液加热额外的50微升到旋转过滤器的中心。
         19. 重复步骤1.2.2.1.18。
      2. 加入100微克/毫升糖原，0.1体积的3M乙酸钠缓冲液（pH 5.2）和2.5体积的无水乙醇中。在-80℃沉淀过夜。
      3. 离心机以15,000 xg离心在4℃下25分钟。弃去上清液。
      4. 用1mL的75％乙醇洗涤沉淀。离心机以15,000 xg离心在4℃下15分钟。小心地取出乙醇。
      5. 干燥空气中为3-5分钟。
      6. 加的不含核酸酶的水10μL的以溶解沉淀。
      7. 储存于-70℃。
3. RNA定性和定量
   1. 使用分光光度计，确定由NotI位RNA浓度纳克在260nm和280nm的吸光度。在A ₂₆₀ / A ₂₈₀的比例应为1.8-2.2。
   2. 检查用0.8％琼脂糖凝胶电泳²⁵的RNA样品的质量。
      注:完整的真核细胞的总RNA应该表现出强烈的28S和18S rRNA的乐队。 28S的18S与rRNA基因带强度有一个良好的RNA制备的比率是〜2。

2.凝胶电泳和转让

注:缓冲液配制协议在表1中给出。

1. 甲醛凝胶制备（1％）
   1. 冲洗所有电泳设备酸二乙酯（DEPC）水。
   2. 熔融2.5克在215毫升DEPC水的琼脂糖完全在微波炉。
   3. 加12.5毫升10×3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）缓冲液和22.5毫升37％的甲醛。
   4. 倒入用1.5毫米厚的梳子的电泳装置。
   5. 消除泡沫或推Ť下摆凝胶用干净的梳子的边缘。
   6. 使凝胶在室温下固化。
2. 样品制备
   1. 混合样品缓冲液中的1-10微克总RNA和11.3微升。
   2. 混合RNA标记（1微克/微升）的2微克的样品缓冲液11.3微升。
   3. 不含核酸酶的水从2.2.1和2.2.2添加到样本以16微升的总体积。
   4. 热，在60℃进行5分钟，然后在冰上冷却。
   5. 混合来自2.2.3样品16微升与4微升跟踪染料，其含有0.1微克/微升的溴化乙锭在冰上。
      注意:如果吸入溴化乙锭可能是致畸和毒性。阅读溴化乙锭安全技术说明书。
3. 电泳
   1. 加入200毫升的10倍MOPS缓冲至1800毫升的DDH ₂ O，使一个1X MOPS运行缓冲液。
   2. 使用1×MOPS运行缓冲液冲洗凝胶的孔中。
   3. 预RUN T给他凝胶在20 V 5分钟。
   4. 加载RNA样品到凝胶的孔中。
   5. 用铝箔纸覆盖，避免光线照射。在35 V大约17小时运行（过夜）
   6. 检查和UV光下拍摄的凝胶。
4. 转让
   1. 切胶删除未使用的部分。
   2. 制备500毫升的10×SSC缓冲液（250毫升20×SSC缓冲液和250mL DEPC处理的水）。
   3. 用10倍的SSC缓冲液中以50rpm摇动洗凝胶两次20分钟。
   4. 切1滤纸片大到足以用作灯芯纸，它从传送盘（ 图1）吸收转移缓冲液。
   5. 切4张该滤纸的尺寸相同的凝胶。
   6. 切成1片带正电荷的尼龙膜，以相同的尺寸的凝胶。
   7. 标记在凝胶上的凹口和膜作为标记，以确保正确的方向。
   8. 在2×SSC缓冲液浸泡的膜15分钟。
   9. 倒入500毫升邻˚F10X SSC缓冲到传输托盘。
   10. 铺设横跨玻璃板的大滤纸片并用转移缓冲液浸湿的滤纸。
   11. 推出用吸管任何气泡。
   12. 浸泡2片预先切割的滤纸在转移缓冲液，并将其放置在滤纸上的从步骤2.4.5的中心。删除任何气泡。
   13. 莱凝胶顶面朝下放在滤纸。
   14. 躺在凝胶的顶端膜上。对齐凝胶和膜的槽口。
   15. 放置在膜的顶部2个预切割滤纸和湿用转移缓冲液的滤纸上。
   16. 取出层之间的任何气泡。
   17. 应用保鲜膜凝胶周围，以确保毛巾只吸收缓冲器通过凝胶和膜。
   18. 堆叠在滤纸的顶部的纸毛巾。
   19. 将一个超大的玻璃板上的毛巾上。
   20. 放置一个重量上堆叠的顶部。
   21. 保持过夜以允许所述RNA从凝胶转移到膜上。

3. N ⁶ -methyladenosine检测

1. 交联膜
   1. 保持该膜在2×SSC缓冲液潮湿。
   2. 将浸有10X SSC缓冲到UV交联剂滤纸2张。
   3. 放置在滤纸上的顶部的膜，与所述RNA吸附面朝上。
   4. 选择"autocrosslink模式"（120,000μJ），并按下"开始"按钮启动照射。
   5. 检查在膜和凝胶用UV凝胶图像捕获器，以确认从该凝胶中的RNA转移到膜上。
2. 免疫印迹
   1. 1小时阻断与吐温20（TBST）缓冲的Tris缓冲盐水在室温下，在5％非脂肪牛奶的膜。
   2. 用TBST缓冲液三次洗15分钟。
   3. 孵育膜M ⁶ A（隔夜<青霉> N ⁶ -methyladenosine）抗体溶液（1:4℃在5 1,000％非脂肪牛奶的TBST缓冲液）。
   4. 用TBST缓冲液三次洗膜15分钟。
   5. 孵育在HRP标记的驴抗兔抗体溶液（1:2,000，在5％非脂肪牛奶的TBST缓冲液）的膜1小时在室温下。
   6. 用TBST缓冲液三次洗膜15分钟。
   7. 应用增强的化学发光底物（每膜厘米² 0.125毫升）。
   8. 捕捉与数字成像器的最佳设置的化学发光，根据制造商的说明^26。
3. 米⁶的量化
   1. 测量使用ImageJ的软件相对米⁶化学发光强度。
      1. 根据ImageJ的软件菜单中，选择"文件"选项打开相关文件。
      2. 从ImageJ的"矩形"工具和周围画一个框的信号。
      3. 如果核糖体RNA不是实验的重点，避免用于计算的18S和28S核糖体RNA米⁶ A频带。
      4. 点击"命令"和"1"来确认所选择的车道。
      5. 按"命令"和"3"以显示所选的情节。
      6. 点击"直线"工具，画线分割区分开。
      7. 点击"棒"工具来记录测量。
      8. 导出数据。
      9. 规范化M ⁶ A的水平与来自溴化乙锭染色的18S核糖体RNA带。

Results

后在正常光暗昼夜阶段14天，野生型小鼠被放置在不断的黑暗。从肝脏中的RNA在4小时的时间间隔进行采样，并与修改的Northern印迹分析。个rRNA，mRNA的和小RNA的甲基化被清楚地检测（ 图2）。不同的24小时时间之间（CT）的比较可以与18S rRNA的标准被精确地计算。有在rRNA基因的mRNA和小RNA米⁶ A水平的稳健昼夜振荡。

以避免的rRNA递上的干扰，多聚腺苷酸化的RNA可以被纯化，如在步骤1.2.2。纯化后，rRNA基因可以大大消除，以允许其它RNA（ 图3）的更好的可视化。

g>的图1:装配印迹传送装置。用于印迹的RNA与膜中的毛细管转移单元被示出。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:在C57BL / 6J小鼠的M ⁶ A水平的昼夜节律。该图示出了第m ⁶从野生型小鼠的肝脏总RNA的印迹上的暗暗相位的第一天处死后的正常光黑暗阶段的14天内，在4小时的间隔。量化是使用M ⁶ 18S和28S rRNA基因之间的图像密度差完成。 m个⁶的丰度，从底部的甲醛凝胶归到18S rRNA条带。等="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图3:M ⁶一个印迹带或不带rRNA基因。代表m总RNA和从野生型小鼠的肝脏中聚腺苷酸化RNA的⁶的印迹被示出。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1:缓冲器和解决方案。

1	10X MOPS缓冲液（pH 7.0，避光）
	MOPS			41.85	G	0.2M的
	醋酸钠			4.1	G	0.05M的
	EDTA，二钠盐			3.7	G	0.01M的
	DEPC水
	总			1	大号
	在室温下搅拌
2	20×SSC缓冲液（pH7.0）中
	氯化钠			175.3	G	3米
	柠檬酸钠			88.3	G	0.3M的
	DEPC水
	总			1	大号
	在室温下搅拌，然后高压灭菌
3	示踪染料
	10X MOPS缓冲液			500	μL	1X
	聚蔗糖400			0.75	G	15％
	溴酚蓝			0.01	G	0.2％
	二甲苯青			0.01	G	0.2％
	DEPC水
	总			五	毫升
	储存在-20°C
4	DEPC水
	在1比例稀释:DEPC 1000在DDH 2 O
	在室温下搅拌过夜，然后高压灭菌
五	样品缓冲液（避光）
	10X MOPS缓冲液			200	μL
	37％的甲醛			270	μL
	甲酰胺			660	μL
	储存在-20°C

Discussion

RNA的修饰在细胞功能和生理学中起着重要作用。目前对这些修饰的调节、功能和稳态的理解仍在探索和扩展中⁸。因此，需要一种精确的金标准方法来评估RNA的修饰。改良的北方印迹法可精确定量 RNA 修饰，并清晰地描绘不同 RNA 中的修饰。虽然该方法至少需要3天，但可以标准化，可用于各种实验设计。此外，使用不同的抗体，它可以检测不同的RNA修饰²⁷。

在分析 RNA 修饰时分离不同的 RNA 非常重要。核糖体RNA占RNA总量的很大一部分^28,29。仅分析总RNA中的RNA修饰的结果将主要代表rRNA的变化。rRNA 的甲基化和其他此类修饰可能会掩盖其他 RNA 的变化。通过凝胶分离程序，可以更准确地分析 mRNA 和其他小 RNA 的修饰。

通过 m⁶A 免疫沉淀和测序进行全转录组图谱，可以详细了解每种类型 RNA²² 的修饰。它提供有关特定 RNA 的信息和大约 80-120 bp 的分辨率。尽管m⁶A-Seq可以比较不同实验条件之间的修饰，但很难为此类实验选择适当的标准品和对照¹⁸。免疫沉淀很难复制，重复序列之间通常存在显着差异。此外，m⁶A-Seq 需要在免疫沉淀和测序之前对 RNA 样品进行片段化³⁰。片段化过程可能会对原始 RNA 修饰产生不当影响。如果实验不需要特定基因的信息，但需要不同的条件进行比较，则当前方法为不同的实验设置提供了更好的可视化和控制。

RNA的修饰是调节转录控制的重要步骤³¹。然而，不同生理领域下各种RNA修饰的稳态和调控机制仍不清楚。使用目前改良的北方印迹方法，可以定量和比较不同的RNA修饰。此外，可以更详细地研究RNA修饰的变化和调控。未来，还可以结合来自经典 Northern 印迹和改良 Northern 印迹方案的实验数据，从而为 RNA 生物学提供更深入的见解。

决定改良的 Northern 印迹方案成功的最重要因素是 RNA 样品的完整性。具有一定降解量的 RNA 可能会产生良好的经典 Northern 印迹结果，但这可能会对修饰的 Northern 印迹结果产生重大影响。不同组织或细胞系中RNA的修饰也可能有很大差异。在进行最终实验之前，测试不同组织的合适 RNA 样品上样量非常重要。

由于印迹程序传统上以南方博士和不同的地理方向命名，因此我们建议将当前技术命名为“东北”印迹。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNaseZap 溶液	Ambion	AM9782	方案 1.1
TRI 试剂溶液	Ambion	AM9738	方案 1.2.1.1
1-溴-3-氯丙烷 （BCP）	Sigma	B9673	方案 1.2.1.3
乙醇	JTbaker	8006	方案 1.2.1.3
异丙醇	Sigma	I9516	方案 1.2.1.3
GenElute mRNA 小量制备试剂盒	Sigma	MRN70	实验步骤 1.2.2.1
糖原	Ambion	AM9510	实验步骤 1.2.2.2
乙酸钠	Fluka	71183	实验步骤 1.2.2.2
无核酸酶水	Ambion	AM9930	实验步骤 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	实验步骤 2.1.1
琼脂糖	JT Baker	A426	实验方案 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	实验方案 2.1.3
37% 甲醛溶液	Sigma	F8775	实验方案 2.1.3
EDTA、二钠盐	JT Baker	8993	实验方案 2.1.3 10x MOPS 缓冲液
甲酰胺	Sigma	F7503	实验方案 2.2.1
RNA 千年标志物	Ambion	AM7150	方案 2.2.2
溴化乙锭	Amresco	X328	方案 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	方案 2.2.5 示踪染料
溴酚蓝	Sigma	114391	方案 2.2.5 示踪染料
二甲苯青 FF	Sigma	X4126	方案 2.2.5 示踪染料
氯化钠二水合	JT Baker	3624	方案 2.4.2 20x SSC 缓冲液
酸三钠	Sigma	S1804	方案 2.4.2 20x SSC 缓冲液
Hybond 印迹纸	GE Healthcare	RPN6101M	方案 2.4.4
GE Hybond-N+ 膜	GE Healthcare	RPN303B	方案 2.4.6
Stratalinker UV 交联剂 2400	Stratagene	400075	方案 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT 技术	Gel Catcher 1500	实验方案 3.1.5
抗 m6A （N6-甲基腺苷）	突触系统	202003	实验方案 3.2.3
Amersham ECL 抗兔 IgG，HRP 偶联全抗体	GE Healthcare	NA934	实验方案 3.2.5
ChemiDoc MP 系统	BIO-RAD	1708280	实验方案 3.2.8