Abstract
Fӧrster resonantie energie-overdracht (FRET) -gebaseerde studies hebben in het onderzoek van GPCR signalering steeds vaker voor. Onze onderzoeksgroep ontwikkelde een intramoleculaire FRET sensor om de interactie tussen Ga subeenheden en GPCRs in levende cellen na agonist stimulatie detecteren. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het detecteren van veranderingen in FRET tussen de β 2 adrenerge receptor en Gαs C-terminus peptide na behandeling met 100 uM isoproterenol hydrochloride zoals eerder gekarakteriseerde 1. Onze FRET sensor is een polypeptide bestaande serie van een full-length GPCR, een FRET acceptor fluorofoor (mCitrine), een ER / K SPASM (systematische eiwitaffiniteit sterkte modulatie) linker, een FRET donor fluorofoor (mCerulean) en een Ga-C terminale peptide. Dit protocol zal detail celpreparaat, transfectie voorwaarden, installeren van apparatuur, uitvoering assay, en data-analyse. Deze experimentele ontwerp detecteert kleine langes FRET indicatief voor eiwit-eiwit interacties, en kan ook worden gebruikt om de sterkte van de interactie tussen de liganden en GPCR-G-eiwit paringen vergelijken. Om de signaal-ruis in onze metingen verbeteren, dit protocol vereist verhoogde precisie in alle stappen, en wordt hier gepresenteerd om reproduceerbare uitvoering mogelijk.
Introduction
G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn zeven-transmembraan receptoren. Het menselijk genoom alleen bevat ongeveer 800 genen die coderen voor GPCR's, die worden geactiveerd door een verscheidenheid aan liganden, waaronder licht, geurstoffen, hormonen, peptiden, geneesmiddelen en andere kleine moleculen. Bijna 30% van alle geneesmiddelen die momenteel op de doelmarkt GPCR's, omdat ze spelen een grote rol in vele ziekten 2. Ondanks tientallen jaren van uitgebreid werk aan deze receptor familie, blijven er belangrijke onopgeloste vraagstukken in het veld, in het bijzonder met betrekking tot de moleculaire mechanismen die GPCR-effector interacties rijden. Tot op heden heeft slechts één hoge-resolutie kristalstructuur gepubliceerd, die inzicht geven in de wisselwerking tussen de β 2-adrenerge receptor (β 2-AR) en de Gs eiwit 3. Samen met een uitgebreid onderzoek in de afgelopen drie decennia, herhaalt hij een specifieke structurele component die is van cruciaal belang in dezeinteractie: de Ga subeenheid C-terminus. Deze structuur is zowel voor G-eiwit activatie van de GPCR 4 en G-eiwit selectie 5-6. Vandaar dat de Ga-C-uiteinde heeft een cruciale schakel tussen ligand stimulatie van GPCR en selectieve G-eiwit activatie.
Onderzoek in de afgelopen tien jaar blijkt dat GPCRs bevolken een brede conformatie landschap, met een ligand-bindend stabiliserende subsets van GPCR conformaties. Hoewel verschillende technieken, waaronder kristallografie, NMR en fluorescentiespectroscopie en massaspectrometrie zijn beschikbaar om de GPCR conformationele landschap besproken, is er een gebrek aan benaderingen hun functionele betekenis effector selectie 7 helderen. Hier schetsen we een Fӧrster resonantie energie-overdracht (FRET) -gebaseerde aanpak van de G-eiwit-selectieve GPCR conformaties te detecteren. FRET steunt op de afstand en de parallelle oriëntatie van de twee fluoroforen met overlappende emissie (donor) eennd excitatie (acceptor) spectra 8. Als de donor en acceptor fluoroforen dichter bij elkaar als gevolg van hetzij conformationele verandering in het eiwit of eiwit-eiwit interactie komen, de FRET hiertussen oplopen en kan worden gemeten met behulp van diverse methoden 8. FRET gebaseerde biosensoren zijn uitgebreid tewerkgesteld GPCR 9. Ze werden gebruikt om veranderingen in de conformatie GPCR sonde door het invoegen van donor en acceptor in de derde intracellulaire lus en C-terminus GPCR; sensoren zijn ontworpen sonderen GPCR en effector interacties door het afzonderlijk labelen van de GPCR en effector (G-eiwit subeenheden / arrestins) met een FRET paar 10; aantal sensoren ook detecteren conformatieveranderingen in het G-eiwit 11. Deze biosensoren hebben het veld nodig om een veelheid aan onopgeloste kwesties, waaronder conformationele veranderingen in de GPCR en effector, GPCR-effector interactie kinetiek en allosterische liganden 12 vragen. Onze groepwas vooral geïnteresseerd in het creëren van een biosensor die G-eiwit-specifieke GPCR conformaties onder-agonist gedreven omstandigheden kon ontdekken. Deze biosensor gebaseerd op een recent ontwikkelde techniek genaamd SPASM (systematische eiwitaffiniteit sterkte modulatie) 13. SPASM omvat tethering interactie eiwitdomeinen met een ER / K linker, die de effectieve concentratie regelt. Weerszijden van de linker met een FRET paar fluoroforen wordt een instrument waarin de stand van de interactie tussen eiwitten 12 kunnen melden. Eerder 1 de SPASM module werd gebruikt om de Ga-C-terminus tether een GPCR en bewaken hun interacties met FRET fluoroforen, mCitrine (in dit protocol ingeleid door de algemeen bekende variant, geel fluorescent eiwit (YFP), excitatie- / emissie piek 490/525 nm) en mCerulean, excitatie / emissie piek 430/475 nm) (als bedoeld in dit protocol door zijn algemeen bekend variant Cyaan Fluorescent Protein (GVB genoemd). Van N- naar C-terminus, tzijn genetisch gecodeerde enkele polypeptide bevat: een volledige lengte GPCR, FRET acceptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker FRET donor (mCerulean / CFP), en de Ga-C-terminus peptide. In deze studie worden sensoren afgekort als GPCR-linkerlengte-Ga-peptide. Alle componenten worden gescheiden door een niet gestructureerde (Gly-Ser-Gly) 4 verbindingsstuk dat vrije rotatie van elk gebied stelt. De gedetailleerde karakterisering van dergelijke sensoren is eerder uitgevoerd met behulp van twee prototypische GPCRs: β 2 AR en opsin 1.
Deze sensor wordt transiënt getransfecteerd in HEK-293T-cellen en fluorometer gebaseerde live cell experimenten meten fluorescentie spectra van het FRET paar op willekeurige eenheden van counts per seconde (CPS) in aanwezigheid of afwezigheid van ligand. Deze metingen worden gebruikt om een FRET verhouding tussen de fluoroforen (YFP max / CFP max) te berekenen. Een verandering in FRET (ΔFRET) wordt dan berekend door de gemiddelde verhouding FRETonbehandelde monsters van de FRET verhouding van ligand behandelde monsters. ΔFRET vergelijkbaar in constructen (β 2 AR-10 nm-Gαs peptide versus ß2-AR-10 nm-geen peptide). Hier hebben we detail het protocol bij deze sensoren in levende HEK-293T-cellen te uiten, hun expressie te controleren, en de opzet, uitvoering en analyse van de fluorometer gebaseerde levende cellen FRET-meting voor onbehandeld versus geneesmiddel behandelde omstandigheden. Hoewel dit protocol is specifiek voor het β 2 AR-10 nm-Gαs peptide sensor behandeld met 100 uM isoproterenol bitartraat, kan worden geoptimaliseerd voor verschillende GPCR-Ga-paren en liganden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Voorbereiding
- Ontwerp sensor bouwt met behulp van een modulaire klonen regeling. Gelieve te verwijzen naar de β 2 AR sensor ontwerp eerder 1 gedetailleerd.
- Bereid DNA volgens commerciële miniprep kit protocol en elueren in 2 mM Tris-HCl, pH 8, in een concentratie ≥ 750 ng / ul, A260 / A280 van 1,7-1,9, A 260 / A 230 van 2,0-2,29.
2. Cell Culture Voorbereiding
- Cultuur HEK-293T-Flp-n-cellen in DMEM bevattende 4,5 g / l D-glucose, aangevuld met 10% FBS (warmte geïnactiveerd) (v / v), 1% L-glutamine supplement, 20 mM HEPES, pH 7,5 bij 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Behandel cellen in biologische veiligheid kap voor vervolgstappen.
- Sta cellen groeien tot een confluente monolaag voordat passage in zes putjes. Tijd om confluentie te bereiken, hangt af van de eerste plating dichtheid. Gebruik platen diekomen tot samenvloeiing binnen 1-2 dagen in de platen zes-well platen. Een confluente 10 cm weefselkweek-behandeld schotel heeft celdichtheid van ongeveer 4 x 10 6 cellen / ml. Zie figuur 1 voor het van celkweek groei.
- Was de cellen met 10 ml PBS, en trypsinize met 0,25% trypsine (zie Discussie, paragraaf 2). Plaat 8 x 10 5 cellen / putje in 2 ml medium in weefselkweek behandelde zes putjes en laat zich voor 16 - 20 uur.
3. Transfectie Voorwaarden
- Wankelen transfecties voor constructies die verschillende bedragen van de tijd nodig om optimale expressie te bereiken (tussen 20-36 uur). Synchroniseer voorwaarden voor een uniforme experiment tijd. ook een ongetransfecteerde controlewell onder gelijkwaardige celdichtheid te worden gebruikt voor achtergrondruis en verstrooiing aftrekken tijdens de analyse.
- Breng transfectie reagentia op kamertemperatuur: verminderde serum media, DNA, transfectie reagens.
- In eenbiologische beschermkap combineren reagentia in een steriele microcentrifugebuis in deze volgorde: meng 2 ug DNA met 100 ul gereduceerd serum medium. Spike 6 ul van transfectiereagens in media / DNA mix zonder het aanraken van het oppervlak van het mengsel of de zijkant van de buis. Opzetten van een reactie transfectie per putje. Transfectie omstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd (1-4 ug DNA, 3-6 pl transfectiereagens) vaste expressieniveaus te bereiken. Zie tabel 1 voor meer optimale verhoudingen.
- Incubeer mengsel bij KT in biologische veiligheid kap voor 15-30 min. Gebruik geen reactie als links incuberen meer dan 30 min.
- reactie op cellen in een druppelsgewijze manier toe te voegen heel goed en schud zes goed om grondig mengen te garanderen. Voeg één reactie per well.
- Na 20 uur van meningsuiting, de monitor fluorescentie met behulp van weefselkweek fluorescentiemicroscoop. Beoordelen van de bevolking expressie met 10x objectief en eiwit lokalisatie in een cel op 40x. Observe voor eiwitexpressie bij plasmamembraan (PM). Als er geen wezenlijke internalisatie wordt opgemerkt, bewaken transfectie tot een significante expressie wordt gedetecteerd bij PM.
4. reagentia en apparatuur voorbereiding
- Bereid 100 mM drug voorraden en bewaar bij -80 ° C: isoproterenol bitartraat (100 mM in dH 2 O bevattende 300 mM ascorbinezuur). Maak op ijs / in koude kamer, en flash-vries onmiddellijk. Monsters kunnen worden gemaakt en gebruikt worden tot één jaar.
- Bereid Cell Buffer (~ 2 ml / conditie) en op te slaan in een 37 ° C waterbad. Maak fris elke dag. Referentie tabel 2 voor Cell Buffer bestanddelen.
- Bereid Drug buffer (10 ml) en bij kamertemperatuur geroerd. Referentie tabel 2 voor Drug Buffer bestanddelen.
- Zuur wassen cuvetten met geconcentreerd HCl. Neutraliseren met een zwakke basis (1 M KOH), en grondig cuvettes met dH 2 O.
- Bereid werkplek rond fluorometer met een aantaldozen van 10, 200 en 1000 ui pipet tips, een timer in te stellen met een 10 min countdown, een toegankelijke vacuüm lijn met tips voor cuvette reinigen, delicate taak doekjes, en spuit fles met ultrapuur H 2 O.
- Verhit externe waterbad fluorometer en warmte blok naar 37 ° C.
- Schakel fluorometer; set fluorescentie collectie programma voor het GVB-collectie tot 430 nm, bandpass 8 nm excitatie; emissie van 450 nm - 600 nm, bandpass 4 nm. Voor YFP collectie als sensorregeling (zie Discussie) set excitatie tot 490 nm, bandpass 8 nm, emissie range 500-600 nm, bandpass 4 nm. CFP verzameling instellingen worden gebruikt om een FRET spectrum in dit experiment krijgen.
- Plaats twaalf 1,5 ml microcentrifugebuizen in verwarmingsblok zoals weergegeven in figuur 2 hieronder. Deze buizen zijn houders voor cel hoeveelheid tubes (500 pl microcentrifugebuizen.) Plaats een klein stukje weefsel in de houders 1 en 7 van de cuvettes hier geplaatst vangen.
Opmerking: Gebruik aparte cuvetten voor onbehandelde aandoening en geneesmiddel voorwaarde om kruisbesmetting te voorkomen.
Figuur 2. microcentrifugebuis Set Up en Position Reference in Heat Block Cuvette voor onbehandelde monsters in de stand. 1; cel aliquot buizen zijn op posities 2 - 6. cuvette geneesmiddel behandelde monsters in positie 7; cel hoeveelheid buizen zijn in de posities 8 - 12. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Vul houders 2-6 en 8-12 met ~ 750 ul water om een mini 37 ° C waterbad maken.
- Plaats tien 500 pl microcentrifugebuizen voor mobiele fracties in mini-waterbaden (houders 2-6, 8-12). Elke buis wordt een individuele herhaling van de aandoening (5 untreated, 5 geneesmiddel behandelde).
- Monitor cellen voor expressie (zie stap 3.6).
5. Experiment & Data Collection
Figuur 3. Experimentele Schematische. Een gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor experimentele opstelling en uitvoering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Referentie Figuur 3 voor experimentele schema. Wanneer cellen zijn klaar om geoogst te worden, op basis van eiwit expressie gedetecteerd met fluorescentie microscoop (zie Discussie, paragraaf 4): in biologische veiligheid kap, verwijder voorzichtig ~ 1 ml media, resuspendeer cellen in hun cultuur met een P1,000 en overdragen resuspensie in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
Opmerking: Gebruik trypsine zoals de N-terminus kunnen verteren en /of binding zak van de GPCR sensor. - Aantal cellen de juiste celdichtheid in resuspensie waarborgen. Optimaliseren resuspensie volume 4 x 10 6 cellen / ml.
- Spin cellen in swinging bucket centrifuge bij kamertemperatuur 290 g gedurende 3 min. Verwijder supernatant na centrifugeren.
- ZACHT resuspendeer cellen in 1 ml celbuffer (bewaard bij 37 ° C) en herhaal stap 5,3. Tijdens de tweede rotatie, het verzamelen van 100 mM drug voorraad hoeveelheid van -80 ° C. Maak 1: 100 verdunning in Drug buffer voor 1mM werkvoorraad en houden bij RT.
- Na de tweede centrifugering verwijderd supernatant en voorzichtig resuspendeer cellen in 1 ml celbuffer (4 x 10 6 cellen / ml). Maat OD 600 van het monster in de spectrofotometer 1 ml cellen en 1 ml celbuffer als blanco. Verdeel cellen in een wegwerp plastic cuvet en transfer terug naar een microcentrifugebuis onmiddellijk na spectrofotometrie.
- Voor een controle ongetransfecteerde cell voorwaarde spectrum, zacht resuspendeer ongetransfecteerde cellen in 1 ml Cell Buffer met P1,000 pipet, voeg 90 ul van cellen aan de cuvet en het verwerven van FRET spectrum bij excitatie 430 nm, bandpass 8 nm, emissie 450-600 nm, bandpass 4 nm. Verzamel 3-5 repeat spectra met verse 90 ul van cellen. Houd voorraad van de cellen bij 37 ° C tussen de specs, mengen voorzichtig met P1,000 tussen elk monster portie, en spoel cuvette met ultrapuur H 2 O tussen de monsters.
- Voor experimentele omstandigheden aliquot 90 ul van getransfecteerde cellen voor elk van de 500 pi buizen in houders 2-6, 8-12 in het verwarmingsblok. Voorzichtig resuspendeer voorraad van cellen met P1,000 pipet tussen elke portie.
- Na de cellen zijn in porties verdeeld, voeg 10 ul van Drug Buffer buizen 2-6 voor onbehandelde aandoening monsters.
- Begin experiment door het toevoegen van 10 pi van 1 mM oplossing van geneesmiddel in de buis 8, start de timer aftellen van 10 min en meng buis met P200 pipet. Sluit de buis en terug te keren naar 37° C warmte-blok.
- Onmiddellijk pick-up buis 2, meng voorzichtig met P200 (gebruik een nieuwe tip), voeg 90 ul van celsuspensie onbehandelde toestand cuvette, en plaats in de fluorometer.
- Acquire FRET spectrum bij excitatie 430 nm, bandpass 8 nm, emissie 450-600 nm, bandpass 4 nm.
- Op 9 min - 10 sec, spike buis 9 met 10 ui 1 mM drug oplossing, meng met een P200 (gebruik nieuwe tip), en terug te keren naar de buis blok te verwarmen.
- Herhaal stap 5,10-5,11 met buis 3 en 5.12 met buis 10.
- Herhaal stap 5,10-5,13 op 1 min intervallen (08:10, 07:10, etc.) totdat spectra worden verzameld voor alle onbehandelde conditie samples, en drug is toegevoegd aan alle drug conditie monsters. Gebruik een nieuwe tip voor elke pipet stap om kruisbesmetting te voorkomen.
- Op 5 min - 10 sec, beginnen mengpijp 8 (drug conditie) voorzichtig met P200 pipet, voeg 90 ul van celsuspensie afzonderlijke cuvette voor drug behandelde monster en plaats in de fluorometer.
- verwerven FRET spectrum (zie stap 5.11 voor instellingen).
- Herhaal stap 5,15-5,16 op 1 min intervallen (04:10, 03:10, etc.) voor de resterende drug voorwaarde monsters (tubes 9-12).
- Na het experiment is beëindigd, sparen projectdossiers, grondig wassen cuvettes met ultrapuur H 2 O, en re-voorraad buizen voor de volgende conditie. Zorg ervoor dat kruisbesmetting in de wasstap te voorkomen. Wijzig de tip over het H2O fles als de vacuümleiding tussen wasbeurten.
6. Data Analysis
- Opslaan en exporteren van gegevens in bestanden SPC te formatteren om te worden gebruikt voor analyse. Analyse programma's zijn beschikbaar om te downloaden uit de Sivaramakrishnan Lab publicatie website.
- Maak pad bestanden voor analyse software die de analyse programma's (v9, v15), ongetransfecteerde monsters bestanden (zie stap 5.6 voor ongetransfecteerde cel spectrum collectie), OUTPUT databestand en komma's gescheiden waarden (CSV) bestanden voor het invoeren van gegevens op te nemen.
- Voer volgende informatienaar CSV-bestand (zie voorbeeld in tabel 3) en wijzen respectieve voorwaarden voor elk monster, waaronder:
bestandsnaam - individuele SPC grafiek bestanden
Receptor - aanwijzen die GPCR construct werd getest (bijv Β2)
Binder - aanwijzen welk peptide variant van het construct werd getest (bijvoorbeeld, S)
Agonist - aanwijzen onbehandeld (N) of geneesmiddel behandelde (D) voorwaarden
Directory - het pad van de map waarin de SPC-bestanden worden opgeslagen, meestal georganiseerd op datum
OD - opgenomen optische dichtheid van het monster van de spectrofotometer - Voer bestandsnamen voor ongetransfecteerde monsters (stap 5.6) naar buffer en verstrooiing lawaai van monsters af te trekken.
- Voer voorwaarden in analyseprogramma.
- Programma's uitvoeren om monsters binnen de individuele omstandigheden (versie 9) en over de omstandigheden (v15) te analyseren.
- Uitsluiten voorbeeld bestanden die duidelijk uitschieters in de dataset zijn, of aan te passen voor aftrekken door verhoging of verlaging OD-waarde van inddubbele bestanden.
- Gegevens exporteren naar output-bestand voor toegang tot de berekende FRET-ratio's (525 nm / 475 nm).
- Bereken ΔFRET door het aftrekken van de gemiddelde FRET-ratio voor onbehandelde toestand van het individu FRET verhoudingen voor behandeld (drugs) omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een algemeen schema van het experiment opgezet en uitvoering wordt beschreven in Figuur 3.
Om een FRET verandering in de smalle dynamisch bereik van de sensor op te sporen, is het essentieel om zich te houden aan de nuances van het systeem worden nageleefd. Cell kwaliteit is noodzakelijk om eiwitexpressie en consistentie in monstername. Figuur 1 kenmerken afbeeldingen gekweekte cellen groeien in een consistente monolaag (10X) die optimaal is voor zes putjes plating en transfectie Figuur 1 (a) en cellen groeien in geklonterd patronen die leiden tot dendritische vormen Figuur 1 (b) die niet wordt aanbevolen voor consistente plating. Transfectie condities kunnen ook worden geoptimaliseerd om reproduceerbare expressie te bereiken. Verscheidene omstandigheden zijn geoptimaliseerd voor de aanbevolen transfectiereagens hier gebruikt. Tabel 1 gegevens deze omstandigheden gereduceerd serum medium. DNA en transfectie reagent verhoudingen.
Nadat alle gegevens zijn verzameld en gegevens in het CSV-bestand ingevoerd voor analyse (zie voorbeeld in tabel 3), de gegenereerde resultaten Raw FRET spectra uit figuur 4 lijken (a) en de genormaliseerde, gemiddelde FRET spectra getoond in figuur 4 (b). In figuur 4 de rode spectra de onbehandelde monsters en blauw zijn de met geneesmiddel behandelde monsters. Alle ruwe FRET spectra in Figuur 4 (a) voldoende signaal-ruis bereik voor consistente data-analyse (bijv., Cps bij 450 nm ten opzichte van CPS bij 475 nm). Met dit gamma, de spectra zijn gladder en het water piek van het monster (Raman piek ligt bij 500 nm) is ook minimaal. Lage expressieniveaus leidt tot een opvallende waterpiek veroorzaken die de gegevensanalyse. De gegevens worden genormaliseerd op 475 nm gemeten, de CPS van deze waarde 1,0 (Figuur 4 (b)). In deze dataset voor de β 2 AR-10 Nm-Gαs peptide sensor, is er een significante verandering in de 525 nm te lezen tussen de onbehandelde (rood) en behandeld (blauw) monsters. De ΔFRET verandering wordt berekend uit de FRET verhoudingen (525 nm / 475 nm) van deze datasets en zijn toegankelijk via de output file.
Als eiwitexpressie laag is, is er slechte transfectie-efficiëntie of lage celdichtheid in de cuvet op fluorescentie lezing spectra luidruchtiger weergegeven, zie figuur 5. In vergelijking met figuur 4 (a) de signaal-ruis bereik van deze gegevensset is niet ideaal, ongeveer 1,0 -. 1,6, met CPS maximum van 4 x 10 5 Dit lage expressieniveau bijdraagt aan de puntige spectra zien in de ruwe gegevens Figuur 5 (a), maar de gegevens vast en kan worden genormaliseerde Figuur 5 (b). Hoewel het water pieken (~ 500 nm) niet line-up volledig tussen de datasets Figuur 5 (b) deze experiment is nog steeds bruikbaar voor analyse. In figuur 6 is representatief voor een experiment dat niet toereikend is voor de analyse. Terwijl de signaal-ruisverhouding van het monster is ongeveer 2-3 voor behandelde (blauw) en onbehandelde (rood) monsters, celdichtheid in de cuvet in monsters te laag (450 nm waarde van 1 x 10 5) Figuur 6 ( a). Dit creëert een probleem op achtergrond subtractie en normalisatie figuur 6 (b) en de spectra niet in lijn. Aftrekken kan worden aangepast voor monsters juist af OD in tabel 3. Zelfs bij lage celdichtheid, de waterpiek (~ 500 nm) wordt veel groter en luidruchtiger figuur 6 (c) en remt deze dataset van verdere analyse.
Figuur 1. Voorbeeld van gekweekte celgroei. Cellen groeien in een monolaag (a) Zijn ideaal voor consistente plating en transfectie. Cellen die lijken te groeien in bosjes of met dendritische patronen (b) niet consistent plaat zes-putjes, kan slechte transfectie-efficiëntie in, en kunnen inconsistenties in amplitude van de FRET spectrum. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve Data-analyse voor β 2 AR-10 nm-Gαs Peptide ± Drug. Representatief beeld van ruwe data (a) en genormaliseerd, gemiddelde gegevens (b) moeten de β 2 AR-10 nm-Gαs peptide sensor met onbehandelde (rood) en monsters behandeld (blauw) samples na 5 minuten incubatie met 100 uM isoproterenol bitartraat. GVB max emissie bij 475 nm, YFP max emissie bij 525 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Analyse van Poor Protein Expression met rauwe en genormaliseerde Data. Noisy ruwe data spectra (a) zijn een gevolg van de lage expressie niveaus, lage celdichtheid per monster, en / of een slechte transfectie-efficiëntie van construct. Deze dataset is nog interpreteerbaar als genormaliseerd (b), maar het is niet ideaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Analyse van Low Density Cell in Fluorometer Cuvette met rauwe en genormaliseerde datasets. De lage celdichtheid per monster, gezien in ruwe data (a) bemoeilijkt water / achtergrond aftrekken (b, c) en maakt deze dataset te interpreteren. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Staat | 0.5x | 0.7x | 1x | 2x | 2x * |
| DNA | 1 ug | 1.4 ug | 2 ug | 4 ug | 4 ug |
| Verminderde serum media | 100 gl | 70 ul | 100 gl | 100 gl | 200 gl |
| transfectiereagens | 3 gl | 4,2 pl | 6 pl | 6 pl | 12 ul |
| * Opmerking: aanbevolen voor buitengewoon moeilijk construct. Voorzichtigheid moet worden genomen, omdat deze aandoening induceert hoge celdood. | |||||
Tabel 1. Transfectie condities. In deze tabel zijn de geoptimaliseerde omstandigheden van reagentia voor transfecties in 2 ml putjes van HEK-293T-cellen met de aanbevolen transfectiereagens.
| celbuffer | ||
| Volume | Reagens | Comments |
| 9 ml | ultrapuur DNase / RNase vrij water | |
| 1 ml | HBS (10x), pH 7,4, bewaren bij 4 ° C: | |
| 200 mM HEPES | ||
| 50 mM KCl | ||
| 450 mM NaCl | ||
| 20 mM CaCl2 - H 2 O | ||
| 10 mM MgCl2 - H 2 O | ||
| 100 gl | 20% D-glucose | |
| 15 ul | aprotinine (1 mg / ml in dH 2 O) | degradatie te voorkomen |
| 15 ul | leupeptine (1 mg / ml in dH 2 O) | degradatie te voorkomen |
| 100 gl | ascorbinezuur (100 mM in dH 2 O) * | stabiliseren agonist |
| * Toe te voegen onmiddellijk voor het begin van assay | ||
| drug Buffer | ||
| Volume | Reagens | Comments |
| 9 ml | ultrapuur DNase / RNase vrij water | |
| 1 ml | HBS (10x), pH 7,4, bewaren bij 4 ° C: | |
| 200 mM HEPES | ||
| 50 mM KCl | ||
| 450 mM NaCl | ||
| 20 mM CaCl2 - H 2 O | ||
| 10 mM MgClz <sub> 2 - H 2 O | ||
| 100 gl | ascorbinezuur (100 mM in dH 2 O) * | stabiliseren agonist |
| * Toe te voegen onmiddellijk voor het begin van assay | ||
Tabel 2. Buffer bestanddelen. Deze tabel worden de reagentia gebruikt om zowel Cell Buffer and Drug Buffer maken voor gebruik in het experiment. Maak beide buffers fris elke dag van het experiment; Cell Buffer opslag bij 37 ° C, and Drug buffer bij kamertemperatuur.
Tabel 3. Voorbeeld CSV-bestand voor analyse. Dit monster databestand wijst op de set na één experiment binnenkomst. Meerdere experimenten kan in hetzelfde CSV-bestand worden opgenomen en kan onder de kolom 'additief' onderscheiden worden indien nodig. Elkrij moet worden ingevuld met de volgende informatie:
Bestandsnaam - individuele SPC grafiek bestanden Receptor - aanwijzen die GPCR construct werd getest (bijv Β2)
Binder - aanwijzen welk peptide variant van het construct werd getest (bijvoorbeeld, S)
Agonist - aanwijzen onbehandeld (N) of geneesmiddel behandelde (D) voorwaarden
Directory - het pad van de map waarin de SPC-bestanden worden opgeslagen, meestal georganiseerd op datum
OD - opgenomen optische dichtheid van het monster in spectrofotometer
Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De strakke dynamische bereik van FRET metingen in dit systeem versterkt de noodzaak gevoelige kwaliteitscontrole bij elke stap van dit protocol. De belangrijkste stappen voor een succesvolle FRET experiment waarborgen 1) celcultuur, 2) transfectie 3) eiwitexpressie en 4) tijdige, nauwkeurige coördinatie bij de test uitvoeren.
Cel gezondheid en onderhoud / plating kwaliteit kan een aanzienlijke invloed op de signaal-ruisverhouding van het experimentele systeem en slechte gezondheid cel kan het onmogelijk om consistente verandering in FRET te detecteren. Conservatief, cellen zijn gezondste ongeveer 20 passages, maar dit kan variëren, afhankelijk van cellijn, behandeling en kweekomstandigheden. Zodra cellen hebben moeilijk om te groeien als een confluente monolaag, of begin consequent groeien in meer dendritische patronen (zie figuur 1 (b)), zal experimentele achtergrondgeluid negatief worden beïnvloed. Zorgvuldig cel onderhoud, met inbegrip van routine medieen wijzigingen en regelmatig verwijderen van niet-hechtende cellen en afval van onderhoud platen, zal de kwaliteit van cellen verbeteren zes-well platen en transfecties. Celklonten zouden namelijk transfectie-efficiëntie, kan effectief worden gescheiden in individuele cellen met trypsine onderhoud platen: behandeling 10 cm confluente schalen met 10 ml 0,25% trypsine gedurende 30 sec, verwijder trypsine maar ongeveer 200 pl, plaats schotel 37 ° C incubator gedurende 2-3 min. Cellen schakelt als vanzelf gerecht en zijn minder gevoelig voor klonteren.
Het is cruciaal om de transfectiestap voor dit experiment geoptimaliseerd. 80% confluent voor transfectie efficiënte en optimale expressie - zes-putjes moeten idealiter 60 zijn. Als er te weinig cellen hebben gehouden (<60%), wacht ongeveer 2-6 uur te transfecteren, of tot ten minste 70% van de cellen gehecht. Zes-putten die zijn over-confluent (> 80%) zal ook een vermindering van transfectie-efficiëntie. Transfecteren bij lagerecel confluentie verhoogt celdood tarief. DNA-concentratie en zuiverheid zijn ook van cruciaal belang (zie stap 1.2). Met behulp van een lage concentratie en / of slechte kwaliteit DNA-preparaten een negatieve invloed hebben transfectie-efficiëntie Transfectie omstandigheden kan worden aangepast per construct, zie tabel 1 voor meer informatie.
Nauwkeurige en consistente toezicht op eiwitexpressie met behulp van een weefselkweek fluorescentiemicroscoop is een cruciale stap in dit proces. Hoewel deze stap individueel moet arrest, is het mogelijk andere technieken, zoals microscopie, om expressie in de tijd kwantitatief volgen, hoewel zij hier niet beschreven. Voor constructies hebben we met succes in ons systeem getest, expressie duurt ongeveer 18-36 uur tot optimale expressie te bereiken. In onze ervaring, construeert die vertoning slechte uitdrukking in deze tijd venster zelden te verbeteren na 40 uur. De constructen die we hebben met niet hebben aangetoond tekenen van degradatio gepubliceerdn, maar dit kan een probleem voor sommige GPCRs zijn. In onze testen sensor afbraak mogelijk transfectie malen 30 uur. Sensor integriteit kan worden getest met behulp van YFP / GVB-ratio's: 525 nm lezen van de YFP-aangeslagen (490 nm) spectrum, en 475 nm lezen van GVB-aangeslagen (430 nm) spectrum. Voor instellingen, zie stap 4.6. Aanbevolen YFP / CFP verhoudingen in het bereik van 1,7-2,0, met een ideale verhouding van 1,8. Deze waarde is afhankelijk van de geschatte tweevoudige grotere helderheid van YFP opzichte CFP14. Een geïntegreerde sensor met minimale degradatie zal derhalve zowel fluoroforen bevatten en YFP: CFP verhouding van ongeveer 2: 1. Nadat kwaliteit sensor is bevestigd is belangrijk eiwit lokalisatie en expressie te bevestigen op het plasmamembraan. Significante intracellulaire expressie kan het gevolg zijn van afbraak van eiwitten, opname of continue transport van het eiwit. Monitor bouwt na verloop van tijd om te zien of expressie wordt versterkt op het plasmamembraan. De volgende critical uitdaging in expressie is transfectie-efficiëntie. Ongeveer 70% + transfectie efficiëntie moeten voldoende signaal-ruis detectie in de fluorometer systeem. Als minder cellen worden getransfecteerd, kan de hoeveelheid signaal-ruis nog steeds waarneembaar maar zal veel minder consistent tussen monsters per FRET experiment. Hierdoor wordt een nauwkeurige analyse belemmeren in het klein dynamisch bereik van het systeem. Expressieniveaus ook een belangrijke hindernis vormen voor het bereiken voldoende signaal-ruis tijdens het experiment. Voor expressie detectiegrens van de fluorometer, de verhouding van signaal tussen 475 nm en 450 nm (cel verstrooiing) van 1,5 is voldoende voor het detecteren van een verandering in FRET zal echter optimale expressie een verhouding van ongeveer 2.0 + hebben. Ter referentie is de β2-AR data verzameld in een signaal-ruis bereik van 4 x 10 5 CPS (450 nm) tot 1 x 10 6 CPS (475 nm), signaal-ruisverhouding van 2,5. Deze verhouding zal helpen bij het bedrag van de variabiliteit te verminderenteit tussen de monsters, die ook gegevensanalyse kunnen beïnvloeden. Deze uitdrukking levels zijn ook onderworpen aan de gevoeligheid en een optimale afstemming van de fluorometer optica; andere systemen kunnen verschillende parameters voldoende signaal-ruis optimalisatie vereisen.
Cellen zijn uiterst gevoelig voor tijd en temperatuur. Zodra de experimentele procedure is begonnen, voorzichtige behandeling essentieel om celdood te voorkomen. Specifieke logistieke maatregelen kunnen worden genomen om het proces te versnellen en te voorkomen dat tijdige fouten met inbegrip van de voorbereiding van de werkplek, zorg ervoor dat alle apparatuur naar behoren functioneert, en de planning van de doelstellingen van het experiment vooraf. Het is ideaal om cellen te gebruiken binnen 30 minuten van de oogst, en in ons systeem, wordt dit protocol uitgevoerd binnen 20 min. Zodra de techniek beheerst, specifiek transfectie optimalisatie en de handigheid van de oefening zelf, dit experiment kan worden gebruikt om verschillende constructen in vergelijking met elkaar, genereren dosis-rerespons krommen en de sensor kan worden uitgebreid tot de volledige lengte G-eiwit.
Hoewel de FRET sensor hier gebruikt is een unieke ontwikkeling in GPCR FRET sensoren wordt dit specifieke experimentele opstelling gedetailleerd een goed gekarakteriseerd assay voor de uitvoering van de sensor. De fluorometer-gebaseerde test kan een grote populatie van cellen in elk experiment worden beoordeeld en niet gebaseerd op gezuiverd eiwit of membraan preps, handhaaft derhalve een in vivo omgeving. Deze proefopzet is ook geoptimaliseerd om zeer kleine veranderingen waargenomen in het systeem na agonist stimulatie van de GPCR detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
RUM werd gefinancierd door de American Heart Association Pre-doctorale Fellowship (14PRE18560010). Onderzoek werd gefinancierd door de American Heart Association Wetenschapper Development Grant (13SDG14270009) en de NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) naar SS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to RT before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to RT before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at RT |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
References
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Alexander, N. S., et al. Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release. Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Conklin, B. R., et al. Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation. Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).
- Onaran, H. O., Costa, T. Where have all the active receptor states gone. Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells. Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).
- Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
- Stumpf, A. D., Hoffman, C. Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value. Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).
- Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
