Summary
En detaljert prosedyre for syntese av en 125 I-merket azid og radiomerking av dibenzocyclooctyne (DBCO) -gruppe-konjugerte, 13-nm-størrelse gull nanopartikler ved hjelp av et kobberfritt klikk-reaksjon er beskrevet.
Protocol
Forsiktig: oksidert form av radioaktivt jod er ganske ustabil og må behandles med tilstrekkelig bly skjold og bly ampuller. Alle radiokjemiske trinn skal utføres på et godt ventilert trekull-filtrert hette, og de eksperimentelle prosedyrer må følges opp av radioaktivitet detektorer.
1. Utarbeidelse av kjemikalier og omvendt fase Cartridge for syntese av den 125-merket Azid
- Fremstilling av reagenser i oppløsningen
- Oppløs 1 mg av azidet forløperen (2) i 150 ul absolutt etanol (figur 1).
MERK: En detaljert syntetisk prosedyre for azidet forløperen (2) ble rapportert i forrige papiret 22. - Oppløs 1 mg kloramin T i 20 ul av 1 x fosfatbuffer saltvann (pH = 7,4).
- Løs opp 2 mg natriummetabisulfitt i 20 mL H 2 O.
- Oppløs 1 mg av azidet forløperen (2) i 150 ul absolutt etanol (figur 1).
- forberedelsesjon av kassetten
- Vask tC18 patron med 10 ml absolutt etanol etterfulgt av 10 ml H2O Ikke tørk matrise av kassetten med luft.
2. radiosynthesis av 125 I-merket Azid Prosthetic Gruppe
- Radiojodering reaksjon av forløperen
- Tilsett azidet forløper-løsning (1 mg i 150 ul absolutt etanol) og eddiksyre (10 ul) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Legg 150 MBq av [125I] Nal i 0,1 M NaOH (50 ul) til reaksjonsblandingen.
- Legg til en kloramin-T-løsning (1 mg i 20 pl 1 x fosfatbuffer saltløsning) og lukke mikrosentrifugerør inneholdende reaksjonsblanding.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 15 min inntil Radiojodering reaksjonen er fullført.
- Legg til en natrium-metabisulfitt-oppløsning (2 mg i 20 pl H to O) til reaksjonsblandingenfor å stanse Radiojodering reaksjonen.
- Trekke tilbake 0,2 ul av det urene produkt, og deretter fortynnes den med 100 ul av oppløsning (H2O / CH3CN, 1: 1) for HPLC-analyse.
NB: For alle eksperimentene HPLC ved å bruke 0,1% maursyre inneholdende H2O (løsningsmiddel A) og 0,1% maursyre inneholdende acetonitril (løsningsmiddel B) som elueringsmidler. - Analyser fortynnet urene produktet ved anvendelse av en revers-fase analytisk radio-HPLC (C18 omvendt-fase kolonne; strømningshastighet: 1 ml / min; eluent gradient: 20% løsningsmiddel B i 0-2 min, 20-80% løsningsmiddel B for 2-22 minutter, 80-100% løsningsmiddel B i 22-23 minutter, og 100% løsningsmiddel B i 23-28 minutter, retensjonstid: 16,4 min) (figur 2).
- Rensing av det urene produkt med en preparativ HPLC
MERK: La det være nok bly skjerming rundt HPLC deler som injektor, kolonne, detektor, samling ampuller, og den beholder i hvilken avløpsvannet samles.- Uttak the hele reaksjonsblandingen over i en HPLC hetteglass. Skyll reaksjonsrøret med acetonitril (0,5 ml) og tilsett skylle i samme hetteglass. Fortynn samlet løsning med H 2 O (1 ml).
- Injiser det urene produkt på en preparativ radio-HPLC (C18 omvendt-fase kolonne; strømningshastighet: 10 ml / min; eluent gradient: 20% løsningsmiddel B i 0-2 min, 20-80% løsningsmiddel B i 2-22 min, 80-100% løsningsmiddel B i 22-23 minutter, og 100% løsningsmiddel B i 23-28 min).
- Samle det radioaktive topp som representerer det 125 I-merkede azid (1) (t-R under disse HPLC-betingelser er 17,8 til 18,8 min) i et prøverør av glass (figur 2).
- Måle den radiokjemiske utbyttet av fraksjonen ved hjelp av en radioaktivitet dosekalibratoren i henhold til produsentens protokoll.
- Injiser rensede produkt på en analytisk radio-HPLC ved anvendelse av de samme HPLC-betingelser for å bestemme den radiokjemiske renheten av produktet.
- Fastfase-ekstraksjon av produktet
- Fortynn fraksjonen inneholdende det ønskede produkt (1) med 40 ml ren H 2 O.
- Legg den fortynnede løsningen i en preconditioned tC18 patron.
- Vask kassetten med ytterligere 15 ml H 2 O.
- Eluere produktet (1) fast i patronen med 2 ml aceton, inn i et 10 mL hetteglass som er beskyttet av en blyskjerm. Måle radioaktiviteten av det eluerte produktet ved hjelp av en radioaktivitet dosekalibratoren i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Dimetylsulfoksid (DMSO) eller absolutt etanol kan også anvendes for eluering av produktet fra patronen. Omtrent 5-10% av radioaktiviteten som normalt holder seg til patronen, og den gjenværende radioaktivt merkede produkt kan ikke fullt ut eluert ved bruk av overskuddsmengder av organisk løsningsmiddel. - Fordamp aceton med en strøm av nitrogen eller argongass.
- Oppløse residue med DMSO (100-200 pl) for den neste radiomerkingstrinnet.
3. Syntese av DBCO-gruppe-konjugert Gold Nanopartikler
- Overflatemodifikasjon av 13-nm-størrelse gull nanopartikler med DBCO-gruppe-inneholdende polyetylenglykol
- Fremstille natrium-citrat-stabilisert gull nanopartikler (3) (midlere størrelse = 13 nm) i henhold til en tidligere rapport 24.
- Legg til en vandig oppløsning av Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) til citrat-stabilisert gull nanopartikler (10 nM, 15 ml). Rist løsningen i 20 min på en orbital shaker.
- Legg til en vandig oppløsning av DBCO-gruppe-inneholdende polyetylenglykol tiol (gjennomsnittlig molekylvekt = 5000, 100 uM, 1,5 ml). Rist løsningen for 2 timer på en orbital shaker.
- Rensing av DBCO-gruppe modifisert gullnanopartikler
- Rense DBCO gruppemodifisert gull nanopartikler (4) </ Strong> med påfølgende sentrifugering (11 400 xg, 15 min x 3).
- Dekanter supernatanten og legge til rent vann for oppvirvling av gull nanopartikkel pellets.
4. Radiomerking av DBCO-gruppe-modifisert gull nanopartikler via kobber-free Klikk Reaction
- Syntese av 125 I-merkede gull nanopartikler ved hjelp av 125 I-merket azid (1)
- Forbered en konsentrert løsning av DBCO-gruppe modifisert gullnanopartikler ved hjelp av sentrifugering (11 400 xg, 15 min), og justere konsentrasjonen av gull nanopartikler til 2 mikrometer.
- Legg 4.1 MBq av 125 I-merket azid (1) i DMSO (5 mL) til en suspensjon av gull nanopartikler (4) (2 uM, 50 ul).
- Inkuber den resulterende reaksjonsblanding ved 40 ° C i 60 min.
- Ta ut en alikvot (0.2 ul) av det urene produkt og anvende den på et silisiumdioksyd-corerte tynnsjiktskromatografi (TLC) plate.
- Utvikle TLC-platen ved hjelp av etylacetat som en mobil fase.
- Plasser TLC plate på en radio-TLC scanner og kjøre skanneren for å overvåke radiomerking reaksjon (figur 3) i henhold til produsentens protokoll.
- Rensning av råproduktet
- Rense reaksjonsblandingen som inneholdt de 125 I-merket gull nanopartikler (4) ved sentrifugering (11 400 xg, 15 min).
- Dekanter supernatanten og legge til rent vann for oppvirvling av gull nanopartikkel pellets.
- Ta ut en alikvot (0.2 ul) av det rensede produkt og anvende den på en silika-belagt TLC-plate.
- Utvikle TLC-plate ved anvendelse av etylacetat som den mobile fase.
- Plasser TLC plate på en radio-TLC scanner og kjøre skanneren for å bestemme radiokjemiske yield og radiokjemiske renheten av 125-merket gold nanopartikler (4) (figur 3) i henhold til produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Radiojodering reaksjon av stannylated forløperen (2) ble utført ved anvendelse av 150 MBq av [125I] Nal, eddiksyre, og kloramin T ved romtemperatur i 15 min for å tilveiebringe det radioaktivt merkede produkt (1). Etter preparativ HPLC-rensing av det urene blandingen, ble det ønskede produkt oppnådd med 75 ± 10% (n = 8) av radiokjemisk utbytte. Analytisk HPLC viste at den radiokjemiske renheten av 125 I-merket produkt var mer enn 99% (figur 2), og den observerte spesifikke radioaktivitet av produktet 1 er 40,7 MBq / pmol. Fastfase-ekstraksjon av fraksjonen inneholdende det rensede produkt ved hjelp av kassetten anordnet en acetonløsning av 1. Ved hjelp av en strøm av nitrogen eller argongass, kan det organiske løsningsmiddel fordampes, og deretter ble resten kan oppløses på nytt i DMSO eller absolutt etanol for den neste stes.
For 125 I-merking av polyetylen-glykol-modifisert gull nanopartikler ble DBCO-gruppe-modifisert gull nanopartikler fremstilt ved fremgangsmåten vist på figur 1. En overskuddsmengde av polyetylenglykol tiol (MW 5000) med DBCO grupper ble omsatt med citrat, stabiliserte 13 nm-gull nanopartikler. Etter at modifikasjonstrinnet, ble produktet renset ved suksessiv sentrifugering for å gi DBCO-funksjonaliserte gull nanopartikler (3). I det radiomerking trinn ble 3,7 MBq av en tilsatt til 2 uM av 3 (~ 400 pM av DBCO-grupper), og merkingsreaksjonen ble utført ved 40 ° C i 1 time. Radio-TLC-analyse viste at mer enn 95% av 1 ble omsatt med DBCO-gruppe-funksjonaliserte gull nanopartikler (3) i løpet av 60 min. Reaksjonen ble utført i 60 minutter, og deretter ble råproduktet ble pursert ved sentrifugering. 125 I-merket gull nanopartikler (4) ble oppnådd med> 99% (n = 4) radiokjemisk utbytte som bestemt ved radio TLC (figur 3).
Figur 1. radiosynthesis av 125 I-merket azid (1) og 125 I-merkede gull nanopartikler (4). Reagenser og betingelser: (a) [125I] Nal, eddiksyre, kloramin T, RT, 15 min, 75 ± 10% (n = 8) radiokjemisk utbytte; (B) DBCO-PEG-SH (MW 5000), H 2 O, RT, 2 t; ~ 40 ° C, 60 min,> 99% radiokjemisk utbytte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
t = "Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg" />
Figur 2. Analytisk HPLC-kromatogram av 125 I-merket azid (1). (A) Radiochromatogram av råproduktet. (B) Radiochromatogram av det rensede produkt. (C) UV kromatogram (254 nm) av det rensede produkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Radio TLC resultatene av 125 I-merkede gull nanopartikler (4) (R f av 4 = 0,05, Rf i 1 = 0,45, elueringsmiddel: etylacetat) (a) etter en 60 minutters reaksjon, og (b) etter rensing./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt er den observerte radiokjemiske utbyttet av det rensede 125 I-merket azid (1) var 75 ± 10% (n = 8). Radiomerkings ble gjennomført med 50-150 MBq av radioaktivitet, og den radiokjemiske resultatet er svært like. Hvis [125I] Nal (t 1/2 = 59,4 d) som gjennomgikk radioaktiv nedbrytning i mer enn en måned ble anvendt i Radiojodering reaksjonen ble observert radiokjemiske utbyttet av 1 til å være noe redusert (53-65%). Derfor anbefales det at [125 I] Nal brukes så snart det er fremstilt, eller er levert til laboratoriet for å oppnå optimal radiokjemisk utbytte. I tillegg bør en nylaget kloramin T-løsning også anvendes i reaksjonen for å oppnå den ønskede radiokjemiske utbyttet.
På grunn av at forløperen (2) var ganske hydrofob, bør 150 ul absolutt etanol tilsettes for å oppløse 1 mg av
Før bruk av preparativ HPLC for rensing av det urene produkt inneholdende 1, må revers fase HPLC-kolonne for å bli vasket med løsningsmidler A og B (strømningshastighet: 10 ml / min; eluent gradient: 100% løsningsmiddel B i 0-10 min, 100 -0% løsningsmiddel B i 10-25 minutter, og 0% løsningsmiddel B i 25-30 min) for å fjerne spormengder av forurensninger fra systemet. Deretter blir reversfase-HPLC-kolonne ekvilibrert med 20% løsningsmiddel B i 80% oppløsningsmiddel A i minst 20 minutter for å oppnåkonsekvent retensjonstid på en.
Fraksjonen som inneholdt rensede en må fortynnes med mer enn 4 ganger volumet av H2O i den fastfase-ekstraksjon prosedyre. Hvis ikke, noe av det rensede produkt kan ikke bli fanget i den tC18 patronen. Når aceton benyttes for å eluere renset en fra patronen, kan det endelige volum reduseres ved avdampning av aceton med en strøm av nitrogen eller argon ved omgivelsestemperatur.
Blant flere radioaktive iodines, 125I ble valgt og anvendt i dagens forskning. Ulike typer av jod-radioisotoper trenger å bli testet ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte i andre biologiske og medisinske studier (for eksempel 124 I for PET-avbildning, 131 I for terapeutiske formål).
Så vidt vi forstår, er den nåværende radiomerkingsprotokollen den første rapporten som beskriver detaljert synthetic trinn for en radiojod-merket azidgruppe. Nylig publiserte vi en annen azid protese gruppe, som har en annen struktur 23. Men den radiomerkede azid (1) i den gjeldende metoden gitt litt bedre radiokjemiske resultater enn andre når det gjelder radiomerking effektivitet med DBCO-gruppeholdige molekyler. Eksisterende protese grupper (dvs. N-hydroksysuccinimid og maleimide) for merking av radioaktivt jod kunne ikke gi site-spesifisitet. Imidlertid demonstrerer den foreliggende fremgangsmåte enkle radiomerkingseffektivitet sammen med utmerket bioorthogonality. Siden azidet funksjonelle gruppe er kjent for å være meget stabil i fysiologiske betingelser og in vivo-miljøer, kan det radioaktivt merkede produkt (1) anvendes i pre-målrettede in vivo bildediagnostikk. Vi regner med at denne fremgangsmåten vil bli effektivt brukt både in vitro og in vivo jod radioisotop laBeling av biomolekyler og nanomaterialer som inneholder en anstrengt cyclooctyne struktur.
Med utgangspunkt i den spesifikke radioaktiviteten til en, er den beregnede molare forhold av 125 I og gull nanopartikler ~ 1. 1 125 I-merkede gull nanopartikler (4) kan benyttes i molekylær avbildning og biofordelingsstudier nanomaterialer. Den nåværende metoden kan også anvendes for radioaktiv jod merking av forskjellige størrelser og former av gull nanomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
- Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
- Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
- Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
- Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
- Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
- Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
- Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
- Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
- Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
- Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
- Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
- Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
- Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
- Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
- Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
- Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
- Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
- Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
- Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).
