Abstract
NK細胞の細胞傷害性は、NK細胞機能の外部の介入の効果を決定するために広く使用される尺度です。しかし、このアッセイの精度および再現性があるため、ユーザのエラーのため、または実験的操作にNK細胞の感受性のいずれか、不安定と考えることができます。これらの問題を解消するために、最小限にそれらを減少させるワークフローを確立し、ここで提示されています。例示するために、我々は、運動の激しい試合に提出されたランナー（N = 4）から、様々な時点で、血液サンプルを得ました。まず、NK細胞は、同時にCD56のタグ付けと磁気ベースの選別を経て、直接全血からと1ミリリットル限り少ないから同定および分離されています。ソートされたNK細胞は、任意の試薬またはキャッピング抗体から除去されます。これらは、血液1ミリリットル当たりの正確なNK細胞数を確立するために計数することができます。第二に、ソートされたNK細胞（エフェクター細胞またはE）は、3,3'- Diotadeと混合することができます5 T：cyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）をアッセイ最適1でK562細胞（標的細胞またはT）をタグ付けされたE比、および各イベントの可視化および任意の偽陽性の排除を可能にするイメージングフローサイトメーターを用いて分析しましたまたは（例えばダブレットまたはエフェクター細胞など）偽陰性。このワークフローは、約4時間で完了し、さらにはヒト試料での作業は非常に安定した結果を可能にすることができます。ご利用の際は、研究チームは、ヒト対象にいくつかの実験介入をテストし、データの整合性を損なうことなく、いくつかの時点全体の測定値を比較することができます。
Introduction
ナチュラルキラー細胞は、自然免疫系の重要な構成要素です。それらは非常に規制されているが、それらは認識し、細胞間接触を介して前活性化1せずに異常な細胞を除去する能力を有します。そのようなものとして、それらは、感染に対する防御の迅速なラインを形成します。特に激しい運動は、一過性免疫系2、3、4、5を抑制することが示されています。 NK細胞は、効果的に疾患に高感度のウィンドウを作成し、この効果4、 図6、 図7を特に受けやすいです。したがって、前の介入の研究は、NK細胞機能への影響を削減するという目標との間または後の激しい運動は、運動選手のポスト競技の幸福のために特に重要です。
1％、8まばらです。 2）NK細胞はストレスに非常に敏感であり、実験中に生存可能で安定した状態を維持するために生理学的条件に一定の暴露に依存しています。 3）標準的なアッセイは、フィコール勾配9として、NK細胞の細胞毒性を決定し、アッセイ10を解放するために、信頼できないと矛盾しています。ヒト試料の固有の変動は、これらの問題を配合します。介入の間に収集され、新鮮なヒトサンプルは、少なくとも動物サンプルまたは不死化細胞株と比較した場合、入手がかなり規制が困難です。これは、実験を繰り返したり、統計的な有意しきい値に到達するために研究コホートに参加者を追加する機会を減らすことができます。まとめると、これらの問題はfoを可能にする合理化されたプロトコルの必要性をサポートrの両方のハイスループットおよびヒト試料中のNK細胞溶解活性の高い信頼性解析。
無関係な要因への曝露を最小限に抑えながら、我々は、ヒト全血から識別するために必要な時間を短縮し、ワークフロー、隔離し、テストNK細胞を確立しました。減少またはNK細胞の細胞毒性の増加の検出を可能にするE比：方法は2楽器、磁気ベースのセルソーターとイメージングフローサイトメーター、およびアッセイ特異的な、最適化されたTの使用を最適化します。
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Protocol
注：すべての血液採取手順は、アパラチア州立大学（ASU）治験審査委員会（IRB）によって定められたガイドラインに従って行いました。
1.全血のコレクション
- 認定瀉血専門医は、世界保健機関（WHO）のガイドラインに従って血を引く必要があります。
- 二カリウムエチレンジアミン四酢酸（K 2 EDTA）を含む1 4ミリリットル採血管に血液を描画します。製造業者の指示に従って採血管を反転させます。分離までベンチトップロッカー上で室温で採血管を保管してください。
DIO標識標的細胞の調製
- 細胞の健康を確保するために、アッセイの前に数週間のために、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリンストレプトマイシンを補充した完全イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中でK562細胞を増殖させます。 concentratを調整細胞数と細胞のその後の通過の完了を経て、毎日3×10 5細胞/ mLの細胞のイオン。 2〜3日ごとに完全な培地交換を行います。
- 1血球計数器：アッセイの日に、1を用いて細胞数を実行します。
- K562フラスコから10μLを削除し、1.5 mLのチューブに配置します。
- 1：1の希釈係数に同じ1.5ミリリットルチューブにトリパンブルー色素の10μLを追加します。
- K562細胞およびトリパンブルー色素を混合する優しくフリックチューブ。
- K562細胞をトリパンブルー色素は、室温で1分間インキュベートすることができます。
- チューブから染色されたK562細胞の15μLを削除します。
- 細胞数のための血球計数器上にピペット。
- 四隅の四角内の細胞だけでなく、5乗の合計真ん中の正方形を数えます。
- 式を用いて細胞数を計算します。
総細胞/ mL =総細胞カウントX（希釈係数/正方形の数）X万/ mLの
- 染色されていないK562標的細胞の場合、10×10 6 K562細胞の合計1×10 6細胞/ mLの密度で1 15 mLチューブにK562標的細胞の10 mLを加え。使用するための準備ができるまで、5％CO 2で37℃のインキュベーターに配置します。
- DIOはK562標的細胞を染色するために、K562の10ミリリットルを追加すると、10×10 6 K562細胞の合計1×10 6細胞/ mLの密度で1 15 mLチューブに細胞を標的とします。
- DIO染色し、穏やかにボルテックスに指定された15mlチューブに細胞懸濁液1mL当たり1μLDIOの細胞標識溶液を追加します。例えば、1×10 6細胞/ mLの容量で10×10 6 K562細胞/ mlにDIO細胞標識溶液10μLを追加します。
- 15mlチューブ中で、5％CO 2で37℃で20分間インキュベートK562-DIO溶液。
- 続きますインキュベーションる、15mlチューブを含むK562-DIO溶液に室温でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を3mlを加えます。
- 室温で135×gで10分間遠心します。
- 慎重千μlのボリューム調整可能なピペットを用いて細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
- 細胞ペレットを含む15 mLチューブをする新鮮なIMDMの10 mLを加え。
- 穏やかにボルテックスチューブは、細胞を再懸濁します。
- 繰り返しは2.7 2.10にさらに2回繰り返します。
- 5％CO 2で37℃インキュベーターに保管セル使用直前まで。
注：細胞は、最大24時間、インキュベーター中で保存することができるが、同じ日にそれらを使用することが好ましいです。
コントロールの調製
- 独立したと適切に標識された1.5ミリリットルチューブに以下を転送します。
- 1.5 mLチューブにラベルされた「ダブルポジティブ」に再懸濁DIO標識K562細胞を含む新鮮なIMDMの500μLを追加。
- 「DIOのみ」1.5 mLチューブをラベル付けに再懸濁DIO標識K562細胞を含む新鮮なIMDMの500μLを追加します。
- 「唯一のヨウ化プロピジウム（PI）、「1.5 mLチューブをラベル付けに再懸濁させた非標識K562細胞を含む新鮮なIMDMの500μLを追加します。
- 5分間55℃の水浴中で二重陽性およびPIのみチューブを置きます。
- 5分が経過した後、チューブを除去し、70％エタノールで拭いてください。
- 二重陽性およびPIのみ1.5 mLチューブにPIの10 Lを追加します。
- 30分間37℃のインキュベーター中で3つのすべてのK562標的細胞のコントロールを配置。
- 30分間のインキュベーションは、163×gで2分間、遠心分離、3つすべてのK562標的細胞対照を経過した後。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
- 新鮮なIMDM細胞培養培地の20μLの各制御を再懸濁し、そして少なくとも5％CO 2で37℃のインキュベーターに残します最適なDIO信号のための30分。
注：コントロールは今イメージングフローサイトメーターを介して実行する準備ができています。
4. NK細胞の自動分離
- 電池セパレータの電源を入れ、起動サイクルが完了することができます。
- すべての液体のボトルのイルミネーションが緑と廃液ボトルが空であることであることを確認してください。
- 室温15 mLチューブ用ラックを取得します。
注：選択は、サンプル容量に基づいています。例えば、以下3mlを15mlチューブのラックを使用するボリュームの以上3 mLを50 mLチューブのラックを使用するボリュームに対して。 - それに応じてラベルのサンプル管（サンプル/参加者1名につき、繰り返し）：参加者1全血試料;参加者1陰性画分;参加者1陽性画分。
- 静かに「全血試料」15 mLのチューブにステップ1.2からの全血を1.5mLをピペット。
- ステップ4.5から適切に標識された15 mLの「全血試料」チューブを配置し、15 mLの「陰性画分」と表示し、チューブのラックのステップ4.4から「ポジティブフラクション "チューブ。行（R1）A：thefollowingの検体ラックのセットアップを使用して、全血試料、行（R2）B：陰性、非標識画分、行（R4）C：正、磁気標識された部分を。
- autolabelingのためMiniSampler上にセパレータラックを挿入します。
- メニューの「試薬」を選択し、バイアルを分離ラックに置かれる位置を強調表示します。
- 2次元コードリーダを有効にするには「試薬を読む」を選択します。
- コードリーダカバー0.5〜2.5センチメートル間の2次元コードリーダの前に適切な試薬バイアルを置きます。
注：例えば、NK細胞の分離のために必要な試薬はCD56です。 - 最適な読書のための2次元コードリーダの前の角度で試薬バイアルを保持します。
- 適切なセパレータラック位置に試薬バイアルを置きます。
- 画面上の分離]タブの下で所望の位置を強調表示します。
- ラベリングサブメニューから、AUを割り当てますtolabelingプログラム。
- ポジション1、2、3、および4をラックする細胞分離試薬CD56マイクロビーズを割り当てます。
- 「posselwb「分離プログラムを選択します。
- 「すすぎ」洗濯プログラムを選択します。
- テンキーを使用して「ボリューム」サブメニューで1,500μLのサンプル容量を挿入します。
- キーパッド上の「入力」オプションを選択します。
- 細胞分離を開始するには、「ファイル名を指定して実行」を選択します。
- 十分なバッファはすべてのサンプルを処理するために利用可能であることを確認し、「OK」を選択します。
5. NK細胞数に続いて細胞分離
- すぐに電池用セパレータを用いた細胞分離後、陽性画分を取得します。室温のままにしておきます。この画分は、所望の純粋なNK細胞集団が含まれています。
- 各個々のサンプルについて、ステップ2.2に従って血球計数器を用いて細胞数を実行します。
- 計算した後、細胞数を記録します。
6.細胞毒性アッセイサンプル調製
- 準備し、それに応じて、各サンプル/参加者のために1.5 mLのチューブにラベルを付けます。
- ピペットを各チューブにNK細胞およびDIO-標識さK562細胞の割合を所望します。
注：例えば、K562標的細胞及びNKエフェクター細胞の所望の比は1：5。 - 135×gで5分間遠心分離します。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
- 再懸濁NK-DIOは、インターロイキン-2（IL-2）及び2-メルカプトエタノール（2-ME）（不完全なNK細胞培地）なしでNK細胞培地500μL中のK562細胞の混合物を標識。
注：不完全なNK細胞培養培地は、L-グルタミン、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドなしに、重炭酸ナトリウムとの最小必須培地イーグルです。 - 各チューブにPIの5μLを追加します。
- 163×gで2分間遠心分離します。
- 2時間37℃で細胞をインキュベートします。
- 2時間のインキュベーションに続いて、centrifu163×gで2分間、GE。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
- 25μL不完全なNK細胞培養培地中で細胞を再懸濁し。
自発的（「S」）サンプルの7の準備
- ピペット1.5 mLのチューブにDIO標識K562細胞（1×10 6細胞/ mLの濃度）を500μl。
- 各チューブにPIの10μLを追加します。
- 163×gで2分間遠心分離管。
- 2時間37℃で細胞をインキュベートします。
- 2時間のインキュベーション、163×gで2分間遠心分離した後。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
- 25μlの不完全アルファ最小必須培地（α-MEM）細胞培養培地中で細胞を再懸濁し。
イメージングフローサイトメーター8.データ集録
- 楽器をオンにするためにフローサイトメトリーイメージングのフロントドア内側の緑のボタンを押してください。
- アルをオンにしますイメージングフローサイトメーターに関連付けられリットルコンピュータ。
- ソフトウェアサイトメーター撮影フローを起動します。
- システムをフラッシュし、サンプルラインを準備する「スタートアップ」ボタンをクリックします。
- 「スタートアップ」完了すると、「キャリブレーション」ウィンドウを閉じます。
- チャンネルを割り当てます。トップ左側に、それらを割り当てるために、各チャンネルをクリックしてください。
- Area_M06対生マックス・ピクセル_MC_6、Area_M02対生マックス・ピクセル_MC_2、AspectRatio_M01対Area_M05とFieldArea_M01対生の最大ピクセル_MC_5：右側には、4散布図を作成するために、散布図ボタンをクリックしてください。
- 最初の"ダブルポジティブ」コントロールを使用して、サンプルの分析を開始。
- クリックして「ロード」。
- サンプルローダーに3.9へのステップ3.4から「ダブルポジティブ」サンプルで1.5ミリリットルチューブを置きます。
- 「倍率」タブの下に対物レンズ40倍を選択します。
- 405 mWの電源をオンにし、642 mWのレーザー。
- 「明」のチャンネルをオンにします。
- クリックして「選択強度。」
- 検出器が過負荷にならないように、「ダブルポジティブ」コントロールサンプルに基づいて、405 mWのレーザーのための所望の強度を決定します。
注：例えば、この実験のための最適な強度は、11ミリワットとしました。
- 所望のセットアップが達成された後、データを取得します。
- 「取得ファイル」タブで、カスタムファイル名のテキストで入力します。データファイル（複数可）を保存するためのフォルダを選択します。
- 「収集」の横に取得するセルの数を入力します。典型的には、この数は、1,000〜10,000の間で変化します。
- クリックして「獲得。」
注：細胞の所望の数が取得されると、データファイルが自動的に以前に選択したフォルダに保存されています。
- DIOのみ制御-買収が完了したら、次のコントロールサンプルをロードします。
- クリックして「ロード」。
- サンプルローダーに「DIOのみ」のサンプルと1.5 mLのチューブを置きます。
- 選択した「倍率」タブの下に対物レンズ40倍にしておきます。
- 405 mWのレーザーがオンになったままにしておきます。
- 642 mWのレーザーと「明」のチャンネルをOFFにしてください。
注：ここで、所望のセットアップが達成されたことを、データを取得することができます。 - 「取得ファイル」タブで、カスタムファイル名のテキストで入力して、データファイル（複数可）を保存するフォルダを選択します。 「収集します。」の横に取得するセルの数を入力します。典型的には、この数は千です。
- クリックして「獲得。」
注：細胞の所望の数が取得されると、データファイルを自動的に以前に選択したフォルダに保存されています。
- 「PIのみ」対照試料を繰り返し手順8.10。実験試料は今収集する準備ができています。
- remainiハンドル以下のように「自発的な 'S'サンプル」を含む実験サンプルを、ngの：
- 選択した「倍率」タブの下に対物レンズ40倍にしておきます。
- 405 mWの642 mWのレーザーをONにしてください。
- 「明」のチャンネルをONにしてください。
- クリックして「設定強度。」
- 「取得ファイル」タブで、カスタムファイル名のテキストで入力して、データファイル（複数可）を保存するフォルダを選択します。カスタムファイル名のテキストで入力します。
- 横に取得するセルの数を入力し、「収集します。」
- 「取得」ボタンをクリックします。
注：細胞の所望の数が取得されると、データファイルを自動的に以前に選択したフォルダに保存されています。
- すべての実験サンプルのための手順を繰り返し8.12。
- すべての実験データやファイルが収集された後、システムを滅菌する「シャットダウン」ボタンをクリックします。
9.イマジングラムフローサイトメーターのサンプル分析
- 解析ソフトウェアアプリケーションサイトメーター撮影フローを開きます。
- 「ファイル」の下で、実験的.RIFファイルを開きます。
- ソフトウェアサイトメーターイメージングフローの報酬タブの下に「新しいマトリックスを作成」を選択する（ステップ8.10と8.11の間に作成されたDIO-のみの制御とPI-のみの制御）単色.RIFファイルを使用して、新しいマトリックスを作成します。
注：ソフトウェアは、それはチャネル補償を適用するために選択される、単一色のファイルを選択するためのプロンプトを表示し、マトリックスファイル（.ctmファイル拡張子）を作成するためにそれらをマージします。 - ソフトウェアの「ビルディングブロック」機能を使用して、ドットプロットを作成します。
- ゲートにフォーカスされたセルをドットプロット（周波数対BrightFieldGradient_RMS）を作成します。 「フォーカス」（ 図1A）ゲートを呼び出します。
- 「フォーカス」ゲートを使用して、gの明視野アスペクト比対明視野エリアのドットプロットを作成します一重の細胞を食べました。 「シングル」（ 図1B）のゲートを呼び出します。
- "シングル"ゲートを使用して、Intensity_MC_Ch5対Intensity_MC_Ch02のドットプロットを作成します。 DIO陽性細胞のみ（ターゲット、生きている）とPI-DIO二重陽性細胞（標的、死んだ）（ 図1C）を識別し、ゲートには、このプロットを使用してください。
注：すべてのプロットはステップ9.4.1、9.4.2に記載され、9.4.3は、ソフトウェアの「ビルディングブロック」機能を使用して作成することができます。
- 各ゲートの細胞数にアクセスするには、ドットプロットの統計機能をクリックします。
- 次の式を使用して、自発的なサンプル中の死者の標的と実験サンプルの割合を計算します。
サンプル中の％死ん目標=（#deadターゲット×100）/（＃ライブターゲット+ #deadターゲット） - 以下の式を用いて細胞毒性を計算します。
％細胞毒性= [（実験デッド自発死んだ）/（100-自発死ん）]×100
図1：細胞傷害活性分析のための代表的なヒストグラム、散布図や画像。 （A）フォーカス細胞分析。 （B）単一細胞分析。 （C）標的細胞染色解析。全ての測定は、各イベントに添付された画像を使用して作製されます。これは、単にグラフ上のイベントをクリックすることによって解析ソフトウェアでアクセスすることができます。 （D）ダブレットイベントの代表画像、アポトーシスNK細胞と生K562標的を示します。 CH01、明。 CH02、DIO。 Ch05、PI。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Representative Results
NK細胞数の決意
全血におけるNK細胞数の激しい走行の効果は、図2に記載の運動プロトコルを用いて、測定されました。血液サンプルは直ちに運動、運動後1.5時間、および初期採血後、最終的に24および48時間後に、運動前に描かれました。全血1ミリリットル当たりNK細胞の濃度は、各ランナー（ 図3A）および各時点の平均（ 図3B）で測定しました。
我々の結果（ 図3A）、1 2ランナーショー、そして4本の直前にゆっくりと24および48時間後に正常に戻って、急激な減少が続い運動後のNK細胞数のわずかな増加と同様のパターン。この傾向は、ランナーのグループに対するNK細胞の平均値をプロットすることにより、特に見られなかったが、有意差はから運動前のレベルが検出されました。ランナー3は、最初は非常に高い数を提示し、それが急激にゆっくりと24および48時間後に正常に戻る前に、運動や運動後1.5時間後に減少しました。平均では、NK細胞数（ 図3B）は、（非有意ではあるが）運動後1.5時間に減少したが、24時間後に戻ってほぼ正常レベルにありました。
NK細胞の細胞毒性の決意
NK細胞数を算出した後、NK細胞は、直ちにプロトコルのセクション6で説明したように、それらの細胞傷害活性を決定するために設定しました。結果を図4Bは、平均NK細胞傷害性を示すと共に、各個別のランナーは、 図4Aに示されています。我々の結果は、平均のNK細胞毒性は（非有意ではあるが）運動と運動後1.5時間後にわずかに減少したが、大幅に24時間後に増加したことを示しています。 NK細胞傷害性は、前に比べて高いまま（一部起因し、このパイロットプロジェクトの参加者の数が少ないに）-exerciseレベル、非有意ではあるが。
図2： 運動プロトコル 。血液は、n = 4ランナーで実施した（赤矢印）描画します。
図3：NK 細胞は事前トレーニング、ワークアウト後、1.5時間および21時間後にワークアウトをカウントします。 （A）は、各個々のランナーのための全血1ミリリットル当たりNK細胞数。 （B）全血1ミリリットル当たり平均NK細胞数。 N = 4。スケールバー=標準誤差。
図4：NK細胞の細胞傷害性プレワークアウト、ワークアウト後、1.5時間および21時間後にワークアウト。各個々のランナー用（A）NK細胞の細胞毒性（死んだ標的細胞の割合として表されます）。 （B）平均NK細胞の細胞毒性（死んだ標的細胞の割合として表されます）。 N = 4。スケールバー=標準誤差; *：P <0.05; **：P <0.005。
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Discussion
本研究に記載された方法は、直接的（この特定の場合、長時間の運動で）刺激に応答して個々のNK細胞の特異的活性を測定します。典型的に、NK細胞は、マーカーの組み合わせを使用して選別密度勾配または細胞を使用して1つの血液から単離されます。これらの方法が広く使用されているが、それらは多くの欠点を持っている：彼らは、時間がかかり、複数の操作を伴い、かつ重くユーザー依存しています。その結果、過度の応力を実験する実験から増加変動をもたらすことができる、単離されNK細胞上に配置された、あるいは同一の実験の範囲内です。本稿では、磁気ベースの分離を利用したプロトコルを説明しました。血液またはNK細胞の操作を最小限に抑えながら、これは、個体の全血におけるNK細胞の高い数の迅速な、かつ信頼性の選別を可能にします。
この方法は、サンプルが疎であるヒトの研究に特に適しているが、あまりにも多くのサンプルを一緒に処理する必要がある場合フリップサイドに方法はかなり困難になります。実際に、細胞傷害性アッセイのための買収の窓は、私たちの経験では、最大で一度に5つのサンプルに変換インキュベーションの終了後、通常、30分以内でなければなりません。多くのサンプルが処理される場合には、フローサイトメトリー取得のための十分な時間を可能にする驚異的なスケジュールを設定することが重要です。この方法の別の欠点は、かなり高く、血液のより多くの量がより高いNK収率のために処理されている場合は速やかに消費することができる試薬のコストである可能性があります。しかし、我々はこれらのコストが節約される時間のかなりの量でバランスが取れていると考えています。
このプロトコルでの重要なステップは、変更に最も開いているものです。室温で血液を維持し、NK細胞のストレスを回避するために、描画時間以内に処理することが重要です。単離後、細胞数のために非常に重要です結果の精度は、そのようにカウントする方法が一定でなければならない：トリパンブルーアッセイのために、たとえば、複数の正方形は血球計数器で計数されていることを確認し、ユーザーやラボが同じ識別パラメータを使用していること。ここで紹介するプロトコルは、Tで血液とテストNK細胞の細胞毒性の1.5ミリリットルを使用しています：1のE比：5は、しかし、これらのパラメータは、所望のアッセイおよび血液の利用可能量の応じて最適化することができる：以下の血はそれ利用可能である場合依然として妥当な取得時間を有するように3：4、あるいは1：1などのより低い比率を使用することが可能です。我々の経験ではより低い比は、適切な細胞傷害活性を可能にするには不十分かもしれません。また、なぜならサンプル変動は、NK細胞の数が予想よりもはるかに低いことが起こります。実験を通してE比応答では、同じTを維持するために、反応管中の標的細胞の量を下げる必要があります。結果解析時には、最も重要なステップは、に必要な限り多くの時間を費やすことです良い行列を求めます。細心の注意は、プロトコルのステップ3に記載のコントロールを調製するために取られる場合にのみ得られます。ステップ9で説明したようにゲートが確立されると、ファイルが一緒にバッチ処理とはほとんど変化と直列に分析することができます。疑わしい場合は、ユーザーは常に、任意のイベントをクリックすることで、画像ギャラリーを参照する必要があり、すべての適切なイベントが適切なゲート内に含まれていることを確認するために、（ 図1Cに見られる）グラフ上にプロット。
図2Aの代表的な結果は、4のうち3ランナーは同様のパターンを提示したことを示しました。 4 番目のランナーのパターンは、おそらくその個人に特異的であり、誤った測定値を表すものではありません。この個々のためのNK細胞数は、ヒト全血運動前および48時間の運動後の両方で認められた範囲の上端でした。これは、この論文では、NK Cに記載の方法の強みの一つを示していますellsを正確に求めることができます。また、単一の標識工程を通じてネイティブ細胞を得る能力は、NK細胞に最小限の応力および変形を可能にします。 NK細胞の細胞傷害性は、生理的ストレス条件下で測定されているとき、これは特に重要です。
単離後、NK細胞の細胞傷害性は、典型的には、フローサイトメトリーまたは放射性放出アッセイ（例えばクロムアッセイ）によって決定されます。放出アッセイは、ゴールドスタンダードと考えられているが、それらは非常に高価であり、放射性同位体および関連機器の使用に依存しています。また、放射性物質の使用、廃棄のための規制は、時間効率と精度を必要とする実験に複雑さを追加します。フローサイトメトリーのアプローチの使用は理にかなっているが、一般的な注意事項は、レーザーの設定、および蛍光色素補償とゲーティングを含む従わなければなりません。細胞の2種類がSAである場合、これは特に真実でありますmple、それは、細胞傷害性アッセイの場合のように。しかし、私たちの場合には、撮像フローの使用は、サイトメーター画像をイベントごとに捕捉することができ、サイズ比パラメータは、単一の細胞からの二重の分離を可能にします。細胞傷害性アッセイは、エフェクターとターゲットとの間の物理的な接触に依存しているため、これは重要なポイントです。非常に多くの場合、細胞のこれらの2種類がまだ結果に偽の二重陽性を導入し、流量測定の際に一緒になります。この非常にポイントは（死んで、PI陽性）、NK細胞、および（ライブ、DIO正、PI陰性）K562細胞によって形成されたダブレットを示し、図1Dに示されています。従来のフローサイトメトリーでは、このイベントは、K562細胞死数に追加されるだろうが、実際には偽陽性です。データを削除することは、実際に問題となることが、しかし、それは、それが一貫して行われている場合でないと（この場合、「アスペクト比」パラメータ）を実験する実験からの非常に厳格なパラメータを使用して。リターンでは、得られたデータは、はるかに安定します。さらに、すべてのイベントを可視化することは、伝統的にコントロールを使用して確立されており、それは考慮にで発生する可能性があります自然な "データドリフト」を取ることはありません剛体のゲートに依存することなく、色パラメータに基づいて、各イベントの正確なゲーティング（とカウント）を可能にしますフローサイトメトリー。取得時にすべての単一の対象イベントを画像化する追加機能は、（DIOが唯一、生きた標的細胞を表す）は、単一および二重染色人口（DIO + PI染色し、死んだ標的細胞を表す）の改良されたゲーティングを可能にします。
さらに、ここに提示ワークフローを考慮し、全血におけるNK細胞の不足および正確な結果のために必要性を取るために最適化しました。従来のNK細胞の細胞毒性アッセイは、いくつかのTでの溶解活性を調査中：E比は、いくつかの理由で非実用的である：1）全血から入手可能なNK細胞の量が限られており、非常にVariableおよび2）分析に必要な標的細胞の量は、データのかなり迅速な取得を可能にするのに十分な大きさでなければなりません。 5 T：4×10 4 T / 2×10 5 Eに変換するE比、最適なバランスを与え、偉大な再現を可能にし、異なる比率（ないここに示されている）で、いくつかのテストでは、1があることを示しました。様々な個人（ここでは図示せず）からのサンプルで繰り返しアッセイに基づいて、この比はまた、介入の効果を測定するためのウィンドウの上や下に重要なを提供している、正常サンプル50〜70％と予想される細胞傷害活性を提供します。
NK細胞数は、他の作品11、12、13で見出されたものと同様であり、インライン血液14のNK細胞の頻度の許容範囲。しかし、この新しいワークフローの利点は、我々が検出し、図3Bに示されています同じ時点で低い（有意ないが）平均したNK細胞数にもかかわらず、プレワークアウトレベルと比較して24時間後にNK細胞の細胞毒性の有意な増加を編この結果は、細胞傷害性のレベルは、事前にワークアウトのレベルとほぼ同じ（あるいはそれ以下）であった他の公開された研究とは異なります。これは、代わりに、時間運動後の長い期間にわたって押されの、NK細胞の細胞毒性は、「リバウンド」、わずか21として時間後に運動後にさらに高いレベルにことができるかもしれないことを示唆しています。純粋な、健康なNK細胞を有する新規の方法論を用いて、この観察は、フォローアップ研究で確認された場合、重い運動が免疫抑制であることを現在の視点を変更する可能性を有します。 NK細胞は、フィコール勾配またはフローサイトメトリーベースのソートを使用して得られた場合、得られた集団は、他の細胞型との混合のいずれかで、変更した応答を有する複数の損傷したNK細胞及び/又はNK細胞を含みます。これらの結果はconsi予想されます長さ、厳しさ、および/または前述の方法の不正確さをdering。これらの問題を削除し、すべての時点で、生理的条件に近い滞在し、実験結果に生体内挙動における NK細胞のより代表をリードします。
要約すると、我々は、他の方法と関連した制限のいくつかを回避する小さなヒト血液サンプルからのNK細胞の細胞毒性の迅速で正確な分離および検出を可能にする統合されたワークフローについて説明しました。ヒト血液は、この研究の焦点であったが、この方法は、動物の血液試料に適用することができることは注目に値します。このワークフローは非常に再現性があると参加者の数が限られているとシリアル血液対策が取得された運動研究のために特に価値がある小さな変化を検出することができます。代表的な結果で強調したように、この改善された方法は、チャレンジと運動免疫学における現在の知識を向上させる可能性を有します、およびNK免疫監視に関連する他のフィールド。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
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