Introduction
Bestemmelse af strukturen af et biomolekyle er en vigtig forudsætning for at forstå dens funktion. To veletablerede fremgangsmåder til strukturbestemmelse er cryo-elektronmikroskopi og røntgenkrystallografi 1, 2. I dag begge metoder giver høj opløsning strukturel information med en opløsning ned til ångstrøm niveau. Disse to metoder er blevet anvendt i vid udstrækning til at klarlægge strukturen af store biomolekyler såsom proteinkomplekser. Selvom de eksisterende metoder til stadighed er blevet forbedret gennem de seneste årtier, kompleksiteten af biologiske strukturer udgør stadig en stor udfordring for strukturel biologi, især når store, dynamiske og transiente komplekser undersøges 3.
For at studere dynamikken af makromolekylære komplekser og strukturen-funktionen forholdet navnlig enkelt-molekyle metoder har provided nyttige oplysninger 4. Flere nye strategier blev udviklet giver et ortogonalt tilgang til at erhverve strukturel og dynamisk information. Eksempler er højhastigheds AFM 5, mekanisk manipulation 6, fluorescens lokalisering mikroskopi 7, samt enkelt-molekyle Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) 8, 9. Siden ret tidligt FRET er blevet betegnet en molekylær lineal, på grund af afstanden afhængighed af længden omfanget af biomakromolekyler 10.
En særlig interessant anvendelse af smFRET er at bruge oplysningerne afstand indhentet fra smFRET målinger for at udlede strukturel information 11, 12, 13, 14, 15 >, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. På grund af den høje tidsopløsning smFRET kan positionen af mobile dele af en proteinstruktur lokaliseres. Men for at udtrække kvantitative oplysninger fra smFRET data vigtige korrektion parametre om farvestofmolekyler skal fastlægges under målingen 24. Med disse korrektionsfaktorer kan FRET effektivitet E FRET beregnes ved hjælp af formlen
,
hvor jeg A og I D figur 2). Den β-faktor udgør krydstale, udsivning af donor emission til acceptoren kanalen og beregnes ved
hvor jeg A og jeg D fluorescensintensiteterne af donoren og acceptor-molekylet efter foto blegning af acceptor-molekylet.
Den γ-faktor korrigerer forskellen i de relative detektionseffetiviteter i de to kanaler samt forskellene i fluorescenskvantumudbytte af donoren og acceptoren farvestof. Det er beregnet ud fra hver enkelt gang spor af
Bemærk, at denne beskrivelse negligerer direkte excitation af acceptoren molekyle, som undertiden bliver vigtigt og skulle korrigeres for så godt. Til bestemmelse Disse korrektionsfaktorer er det nyttigt at excitere både donor og acceptoren i en alternerende skema 25 for at skelne mellem foto-fysiske forandringer og strukturelle dynamik.
For ikke blot opnå kvantitative smFRET effektivitet, men også kvantitativ strukturel information, blev Nano-Positioning System (NPS) indført i 2008 26. Navnet blev valgt ud fra sine ligheder med det satellitbaserede Global Positioning System (GPS). NPS er en hybrid teknik kombinerer smFRET og røntgenkrystallografi data til lokalisering af ukendte farvestof positioner i biomacromolecular komplekser. crystal struktur tjener som reference rammen og smFRET Resultaterne anvendes til at opnå afstanden information mellem et ukendt fluorofor position (antenne) og en position, kendt fra krystalstrukturen (satellit). I konsekutive eksperimenter afstandene mellem antennen og flere satellitter måles og positionen af antennen bestemmes ved hjælp af en statistisk stringent analyse, der er baseret på Bayes parameter estimation. Som følge heraf er ikke kun den mest sandsynlige position af antennen beregnet, men dens fuldstændige 3D usikkerhed distribution, den såkaldte posterior, visualiseret ved troværdige volumener. Desuden NPS blev udvidet til at muliggøre analysen af komplette smFRET net 27.
NPS er blevet anvendt til at løse en række vigtige spørgsmål i eukaryot transkription, nemlig under den opstrøms DNA, ikke-template-DNA og det spirende mRNA i RNA-polymerase II forlængelse complex 12, 28, også viser virkningen af transkriptionsinitiering faktorer 26 og den dynamiske arkitektur af en åben-promotor-kompleks 29. Desuden blev NPS anvendt til at klarlægge strukturen af arke RNA Polymerase åben kompleks 30 og navnlig placeringen af transkriptionsinitiering faktor TFE, som binder kompetitivt til samme sted som transskription elongeringsfaktor Spt4 / 5 31.
Siden da har en række smFRET baserede strukturelle tilgange blevet offentliggjort 15, 18, 21, 23. Når man sammenligner forskellige smFRET baserede strukturelle metoder, bliver det klart, at den tilsyneladende nøjagtighed af metoden er meget afhængig af den særlige valg af farvestof modeller. Man bør bemærke, atfarvemolekyler kan udvise forskellige rumlige og orienteringshjælp adfærd afhængigt af deres lokale miljø.
Til dette formål blev Fast-NPS introduceret 32. Fast-NPS anvender en avanceret prøveudtagning algoritme reducere beregningsmetoder tider drastisk. Endvidere Fast-NPS tillader en at udføre en strukturel analyse og for hver farvestofmolekyle brugeren kan vælge fra et sæt af fem forskellige farvestof modeller, som vil blive beskrevet i det følgende. De mest konservative model, kaldet klassisk, ud fra, at farvestoffet kun optager én, men ukendt, position. På denne position kan fluoroforen rotere frit inden for en kegle, hvis størrelse er bestemt ud fra dens respektive (tidsafhængig) fluorescensanisotropi. Orienteringen af keglen er ikke kendt, hvilket fører til stor usikkerhed ved konvertering målte smFRET effektiviteter i afstande. I denne henseende er modellen konservativ, da det vil føre til den mindste præcision i forhold til den anden farvestof tilstandls. Kun for meget korte afstande bør de forudsætninger, som den klassiske model føre til en mærkbart forkert positionsbestemmelse. For typiske smFRET værdier, er den korrekte position altid indesluttet i forholdsvis store troværdige volumen.
Men da en højere præcision er ønskelig, er det vigtigt at udvikle og afprøve alternative farvestof modeller, som kan bidrage til at forbedre præcisionen. Hvis farvestoffet roterer meget hurtigere end dets iboende fluorescens levetid, kan den såkaldte iso modellen anvendes. Her orientering faktoren K 2 (nødvendig til beregning af den karakteristiske isotrope Förster radius 
) Er indstillet til 2/3. Som følge heraf er de beregnede troværdige volumener næsten to størrelsesordener mindre sammenlignet med dem i den klassiske model 32. I tilfælde af at fluoroforen er fundet i et miljø, der muliggør ikke kun hurtig reorientation, men derudover hurtige bevægelser over hele dens tilgængelige volumen, bør anvendes meanpos-iso-model. I denne model farvestoffet effektivt optager kun én middelværdi position, hvor udgjorde den rumlige midling af et polynomium afstand konvertering 15. Denne model gælder hvis for eksempel (almindeligvis hydrofobe) farvestof er bundet til en hydrofil region, fx DNA'et. Anvendelse af meanpos-iso-modellen fører til en yderligere reduktion i størrelsen af de troværdige volumener med en faktor på ca. to. et farvestof bundet til et protein, kan dog bindes reversibelt til flere hydrofobe pletter i sin sterisk tilgængelige volumen (AV). En fluoroforen der øjeblikkeligt skifter mellem disse regioner, men inden for en region gennemgår fri rotation og hurtigt lokaliseret bevægelse kan bedst beskrives som VAR-meanpos-iso-model. For en lignende situation, hvor farvestoffet er ikke fri til at rotere VAR-meanpos model gælder. mere d etails om disse modeller kan findes i vores seneste publikation 32.
Disse modeller giver et omfattende repertoire til specifikt redegøre for de forskellige miljøer et farvestof kan komme ud og anvende dem med omtanke optimerer dens lokalisering præcision. I Fast-NPS hver farvestof molekyle bundet til en bestemt position kan henføres til en enkelt model, således at FRET-partnere får lov til at have forskellige modeller. Dette gør det muligt grænseløs og tæt på naturen modellering. Det er imidlertid vigtigt, at man gennemfører krævende statistiske tests for at sikre, at den er opnået ved den endelige model kombination resultatet stadig indforstået med eksperimentelle data. Disse test er inkluderet i Fast-NPS software.
For at anvende Fast-NPS til eksperimentelle data der kræves måling af (kun) tre inputparametre. Først farvestoffet-pair specifik isotrope Förster radier (/54782/54782eq5.jpg "/>) Skal bestemmes. Derfor kvantumsudbyttet (QY) af donorfarvestoffet, donor fluorescensemissionsspektrer og acceptoren absorptionsspektre skal måles. Disse målinger kan udføres i bulk, ved anvendelse af en standard spektrometer og en standard fluorescens spektrometer. for hvert par er Re 0 derefter beregnet ved hjælp af freeware PhotochemCAD og kan anvendes i NPS analyse. Desuden er de (tidsopløst) fluorescens anisotropier af farvestofmolekyler brug skal opnås ved anvendelse af en polarisering (og tid) følsom fluorescens spektrometer. Men de vigtigste inputparametre for Fast-NPS er smFRET effektiviteter målt på et enkeltstrenget molekyle fluorescensmikroskopi setup, såsom en total indre refleksion fluorescens mikroskop (TIRFM) .
Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til at opnå smFRET data og anvende Fast-NPS (figur 1).
Protocol
1. Forudsætninger og Måleudstyr
BEMÆRK: Samlingen af målekammeret er afbildet i figur 3. Sandwich-konstruktionen af målekammeret omfatter tre hovedkomponenter: en kvartsglas (kvartsglas) slide, en forseglende film og et dækglas som forsegler strømningskammeret. Målekammeret er monteret på en tilpasset prøveholder. Dimensionerne af prøvekammeret og holder metallet er gearet til at passe til en standard mikroskopi kvarts objektglas (76 mm x 26 mm).
- Cut kvarts objektglas under anvendelse af en diamant bore (0,75 mm) ved positioner, der er angivet i figur 4. Udformningen af kvarts objektglas er asymmetrisk for at skelne mellem de to sider af hver slide.
BEMÆRK: De kvarts slides kan genbruges efter målingen indtil overfladen bliver ridset. - For at montere kamrene, bruge tilpassede metal prøveholdere som afbildet i figur 5 </ Strong>. Prøveholderne indeholder to tråde (M4) for at forbinde et indløb og et udløb rør til strømningskammeret. Endvidere anvender gevind (M3) til at montere prøvekammeret på metalholder samt gevind (M3) til at fastsætte prismeholderen onto til den nedre halvdel metalholderens.
- Udfør smFRET målinger på et prisme typen total intern refleksion fluorescens mikroskop (TIRFM) (figur 6).
BEMÆRK: TIRFM har tre lasere: en grøn (532 nm, Nd: YAG-laser) og en rød laser (643 nm, diodelaser) til excitation af donor og acceptor farvestofmolekyler samt en blå laser (491 nm , diode-pumpet solid-state laser) til blegning de fluorescerende urenheder baggrundskontrol på prøvekammeret før smFRET målingen. De tre laserstråler er rumligt kombineret og kan vælges via en akustisk-optisk afstemmelige filter (AOTF). Fluorescenslyset opsamles ved en høj blænde objektiv, opdelt i en donor og en modtagereller kanal ved hjælp af en dikroisk spejl og projiceret på to EM-CCD-kameraer. Prøvekammeret er fastgjort til et mikrometer fase tillader bevægelse i x- og y-retningen med to stepmotorer. En tredje piezo motor anvendes sammen med en IR-laser og en position detektor til at bygge en auto-fokus for at sikre optimal fokus under hele forsøget.- Brug skiftevis laser excitation (ALEX), når dynamikken i FRET tid baner overholdes 25. Sådan dynamik kan være forårsaget af enten konformationsændringer i molekylerne eller ved udsving i acceptor lysstyrke og acceptor blinke.
BEMÆRK: ALEX giver mulighed for forskelsbehandling mellem disse to mulige årsager og forhindrer fejlfortolkning af dynamiske FRET baner. Men for nemheds skyld, er protokollen del begrænset til analyse af film taget uden ALEX.
Forsigtig: Klasse 3B lasere anvendes i single-molekyle fluorescens setup. Sørg for, at tilstrækkelig laser sikkerhedsforanstaltninger, i henhold til lokale statslige regler, er blevet taget før systemet drives.
- Brug skiftevis laser excitation (ALEX), når dynamikken i FRET tid baner overholdes 25. Sådan dynamik kan være forårsaget af enten konformationsændringer i molekylerne eller ved udsving i acceptor lysstyrke og acceptor blinke.
- Udfør absorptionsmåling til bestemmelse kvantumsudbyttet på en UV-VIS spektrometer (se Materialer og fremgangsmåder).
- Udføre målingen af donorfluorescensemission spektrum, acceptoren absorptionsspektrum og den fluorescensanisotropi på en fluorescens spektrometer (se Materialer og fremgangsmåder).
- Forbered prøvekamre ifølge offentliggjorte procedurer 33. Alternativt kan fremgangsmåden beskrevet i kan anvendes [34].
- Mærke de undersøgte prøver med en donor-acceptor-farvestof molekyle pair egnet til smFRET og sikre, at der er en biotindel til immobilisering på overfladen af prøvekammeret.
BEMÆRK: For at lokalisere en ukendt antenne farvestof stilling med Fast-NPS software der er behov forskellige prøve-konstruktioner. Hver konstruktion needs at have én etiket på den ukendte antenne farvestof position og én etiket på en satellit position kendt fra krystalstruktur. Mindst tre forskellige konstruktioner med farvestoffer knyttet til antennen position og tre forskellige satellitpositioner er nødvendige for nøjagtige resultater. Målinger mellem antenner samt mellem satellitter er også nyttige til at forbedre nøjagtigheden, men dette kræver udveksling af farvestof molekyler, som skal indtastes korrekt i analysen.
2. Montering af Flow Chambers i en brugerdefineret Holder
- Træk siliconerør (0,8 mm ID, 2,4 mm OD) til hule fanen skruer (M4) og skære slangen i begge ender lige efterlader et udhæng på 1 cm på begge sider ved hjælp af en skarp barberblad. Juster overhæng af slangen til ca. 2 mm på den ene side af fanen skruen.
- Monter strømningskammeret i prøveholderen på en sådan måde, at hullerne i kvarts objektglas passer trådene i prøveholderen. Strammeindløb og udløb skruer forsigtigt for at sikre, at indløbet og udløbet af prøvekammeret er stadig gennemtrængelige. Stram forsigtigt de fire skruer af indehaveren af akrylglas at fastsætte placeringen af flowet kammeret.
- Cut silikone slange (0,58 mm ID, 0,96 mm OD) i 20 cm lange stykker. Indsættes en af brikkerne til indløbet og udløbet skruen af målekammeret. Luk indløbet og udløbet slangen ved hjælp af en klemme.
BEMÆRK: De samlede prøvekamre kan opbevares ved stuetemperatur i op til to uger.
3. smFRET Måling på TIRF mikroskop
- Brug en sprøjte til at vaske prøven kammer med 500 pi PBS. Forhindre luftbobler ind prøvekammeret på alle tidspunkter ved at skabe en dråbe for enden af indløbsrøret før der skiftes til en anden pufferopløsning.
- Skyl prøvekammeret med 100 pi neutravidin (0,5 mg / ml i PBS) og inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vaskud neutravidin opløsningen med 500 pi PBS.
- Skrue holderen metal til prismet på prøvekammeret.
- Monter prøvekammeret til mikrometer fase af TIRF-mikroskop. Sørg for at montere proevekammeret vandret så lige som muligt foran målet at undgå defokusering under scanningen proces.
- Start softwaren styrer EM-CCD-kameraer og den software til styring af piezo-motorer i scenen.
- Juster fokus af mikroskopet målsætning ved at se på de refleksioner af IR laser.
- Placer prisme (PS991, n = 1,52) på toppen af holderen metal prisme. Juster den laterale position af prismet at sikre, at laserstrålerne rammer prismet derefter bruge et klæbemiddel og inkuberes med UV-lys i 5 minutter.
BEMÆRK: Monteret prisme kan genbruges ved at rense. - I kameraets kontrol software klik "Setup Acquisition", og definere følgende erhvervelse parametre: 100 ms inteion tid, 401 billeder / film (grøn kamera), 400 billeder / film (rød kamera), elektron multiplikator vinde 225, pre-forstærker gain 5x og udlæsning sats 3 MHz på 14 bit.
- Opret en mappe på den lokale harddisk til målingen. Vælg et ønskede navn for måling filer, f.eks År-Måned-Dag. I softwaren indstillinger gå til "Auto-Gem" rytter, aktivere "Auto gem" og vælg filformat * .sif for film erhvervelse. Vælg den mappe på harddisken. Brug mappenavnet som filestem.
- Aktiver "AutoIncrement" funktion (indstillede værdi til 1). Aktiver fastgørelse af en operatør til filnavnet. Brug "DON" og "ACC" for donor og acceptor kanal hhv. Vælg "_" som separator.
- I kameraets kontrol software klik på "Video" for at starte live-billedet af kameraet og blegemiddel baggrund fluorescens ved at scanne prøvekammeret hjælp maksimal laser intensitet alle tre lasere (dkkombineret ≈3,000 W / cm2 for 10 s pr synsfelt).
- Sluk den blå laser. Mindske intensiteten af den grønne laser til omkring 200 W / cm2, og ca. 40 mW / cm2 i den røde laser, hvis der anvendes alternerende laser excitation (Alex).
- Fortynd biotinyleret fluorescerende prøve til en koncentration på 50-100 pM. Belastning 100 pi af opløsningen. Prøven immobiliseres på kammerets overflade ved binding.
BEMÆRK: Sørg for ikke at overbelaste kammeret. Nabomolekyler skal være adskilt fra hinanden. - Hvis det er nødvendigt, lægge yderligere 100 pi af en 2x mere koncentreret prøve til kammeret.
- Forsegl ind- og udløb slanger af målekammeret ved hjælp klemmer efter læsning er afsluttet.
- Sluk lasere og bruge piezo-motorer til at flytte strømmen kammeret to synsfelter yderligere.
- I kameraets kontrol software klik på "Take signal" for at starte videooptagelse og skiftepå laseren samtidigt. Sikre, at mere end 80% af molekylerne er bleget ved udgangen af filmen ved at justere lasereffekten.
- Gentag trin 3.17 og 3.18 for hele Forbleget prøve kammer region.
4. Erhvervelse af Transformation kort ( "beadmap")
- Forbered et flow kammer, som beskrevet i afsnit 1.1, 1.2 og 2.
- Brug avidinovertrukne fluorescerende multispektrale perler som viser fluorescensemission i donor og acceptor kanal. Vortex bestanden i 1 min, derefter fortynde 50 pi af bestanden i 50 uL Hedeselskabet 2 O. Vortex igen i 1 min, sonikeres 1-2 min, derefter vortex yderligere 10 s.
- Udfør trin beskrevet for smFRET målinger (§ 3,5-3,10).
- Load 100 pi (1 kammer volumen) 1: 2 fortyndede fluorescerende kugler ind i strømningskammeret. Vente 10 min for de fluorescerende perler at binde til overfladen.
- Brug parametre erhvervelse i 3,9 men change film længde til 26 (grøn kamera) og 25 (rød kamera) og elektron multiplikator gevinst til 10.
- Indstille intensiteten af den grønne laser til en værdi på 20 W / cm2.
- Tag en film på et synsfelt med cirka 50-100 perler.
5. Behandling og analyse af smFRET data
- Brug den brugerdefinerede skriftlig software SM FRET til analyse af beadmap (se materialer og metoder) og de erhvervede film. Start programmet viewPlot1.m.
- Klik på Analyser | Batch Analysis, fjerne markeringen af indstillingen "ALEX", hvis det ikke er blevet brugt. For bedste ydelse vælge tærsklen for peak fund "høj". Tryk på "OK".
- Vælg "NEJ" når du bliver spurgt, om en beadmap allerede er blevet analyseret. Gennemse mappen med den erhvervede beadmap og vælg * .sif fil (ved at dobbeltklikke på den). I det næste dialog vinduet tryk "OK".
BEMÆRK: Hvis en beadmap allerede har analyseret i en tidligere foranstaltningling, vælg "YES" her og vælg den gemte beadmap ved at browse til den korrekte mappe og dobbeltklikke på beadmap * .map fil. Fortsæt med trin 5.8. - Vælg to enkelt perler anbragt i modsatte hjørner af synsfeltet. De pixel intensiteter er farvekodede fra mørk blå (lav intensitet) til mørkerød (høj intensitet).
- Klik på midten af den første vulst. Hvis midten af molekylet kan være placeret tydeligt ved farvekodning, vælg "YES" ellers klik på "NO" og vælge en anden molekyle par.
- Placer trådkorset på pixel viser den maksimale intensitet og tryk på "HOLD". Gentag processen med den anden kanal.
- Klik på molekylet i det modsatte hjørne, og gentag trin 5.5 og 5.6.
BEMÆRK: Den relative pixel skift af de to kanaler vises i kommando vinduet og transformationen kortet gemmes automatisk som * .map fil i den mappe, der indeholder beadmap * .sif fil <./ Li> - For at indlæse donor- og acceptor-film (* .sif) for "batch analyse", gå til den mappe, vælge alle film, der skal analyseres, og klik på "OK". I det næste vindue dialog, tryk "OK".
BEMÆRK: batch analyse er færdig, når den sidste vises i kommando-vinduet lane begynder med "Færdig analysere ...". De fundne molekyler vises i et nyt vindue, som også angiver den relative forskydning af donor og acceptor kanal bestemmes ud fra omdannelsen kortet. - For at indlæse batched filmfiler klik på Filer | Load. Fjern markeringen af indstillingen "ALEX", hvis det ikke er blevet brugt. Indstil smoothwidth til 10 og klik på "OK". Vælg den mappe, der indeholder de * .ttr filer og klik på "Vælg alle" og "OK" i næste genvejsmenu.
- Hvis den viste spor har de karakteristiske smFRET faser (Figur 2) tryk på knappen toggle "Ikke valgt" og førstvælge tidspunktet for begyndelsen af den FRET begivenhed ved at flytte linje med musen og klikke på venstre museknap. Næste vælge tidspunktet for blegning af acceptormolekylet og endelig tidspunktet for blegning af donormolekylet.
- I det næste vindue FRET effektivitet plottes i blåt. For at vælge spor ved at trykke på "Ja" knappen ellers vælge "Nej". For igen at få adgang til en tid spor klikke på knappen "forrige".
- Gentag proceduren indtil den sidste molekyle af filmen.
- Efter at have analyseret den sidste molekyle i en film redde de valgte spor ved at klikke på "File | Save". Gem de valgte spor i samme mappe som de * .sif filer.
- Gentag trin 5,10-5,13 for alle erhvervede film.
- Udfør programmet combine_fret_results.m. Vælg den mappe, der indeholder de * .res filer og alle * .FRETonly_trace filer. Gem molekyle-wise FRET og frame-wise FRET filer som MW.dat ogFRW.dat henholdsvis.
BEMÆRK: * .dat filer gemmes som ASCII-filer. Den FRW.dat fil indeholder seks kolonner og en række for hver FRET-frame. Den sjette kolonne indeholder den korrigerede ramme-kloge FRET effektivitet. Den MW.dat fil indeholder 21 kolonner og en række pr udvalgt FRET molekyle. Den tredje kolonne indeholder molekylet-kloge FRET effektivitet.
6. Visning smFRET data i histogrammer
BEMÆRK: For at udtrække den gennemsnitlige smFRET effektiviteten af alle optagede smFRET data rammen-wise data eller molekyle-wise data er plottet i histogrammer og analyseret ved hjælp af Gauss passer til (flere) toppe. I det følgende protokollen anvender en kommerciel dataanalyse software (se Materialer List). Imidlertid kan enhver anden tilgængelig software anvendes i stedet.
- Åbn en dataanalyse software (se Materialer List). Klik på Filer | Import | multipel ASCII. Vælg den mappe, der indeholder FRW.dat filen. Vælg filen, og tryk på "OK & #34 ;. Acceptér input option med "OK" uden en ændring.
- Vælg den tredje kolonne C (Y), der indeholder de korrigerede FRET effektivitet, højre-klik på og vælg Plot | Statistik | Histogram. I histogrammet vinduet dobbeltklikke på kolonnerne og fravælge "automatisk Binning", og vælge den ønskede bin-størrelse, f.eks 0,05. Også vælge begyndelsen og slutningen værdier, f.eks -0,025 og 1,025.
- Vælg de kolonner af histogrammet ved at venstreklikke på dem. Højreklik derefter og vælg "gå til Bin Arbejdsark". Vælg "Tæller" kolonnen ved at venstreklikke på den og derefter højreklikke og vælge Plot | Kolonne / Bar / Pie | kolonne.
- I kolonnen bar plot gå til Analyse | Fitting | Ikke-lineær kurve fit | dialogboksen Åbn. Vælg "Gaussian" under Funktion derefter gå til "Parameter" rytter. Fravælg auto parameter initialisering. Fastgør offset værdi (y0) ved 0. Klik på "Tilpas".
BEMÆRK: fit funktion samt montering dehaler vises nu i kolonnen plot. Den "xc" værdi giver midten af fit funktion, dvs. middelværdien FRET effektivitet, der tjener som input parameter for NPS software.
7. Måling af Quantum Udbytte
- Udføre kvante bestemmelse udbytte med den relative metode, der ligner den beskrevet af Würth et al. 35, under anvendelse af rhodamin 101 opløses i ethanol (QY = 91,5%) som en standard.
- Optag absorptionsspektrene ved en UV-VIS spektrometer under anvendelse af et volumen 80 pi i en absorption cuvette 1 cm vejlængde på. Absorbansen ved bølgelængden, som vil blive anvendt til fluorescens excitation skal ≤ 0,05.
- Optag emissionsspektre på en lampe-kalibreret spektrometer drives foton-tælling tilstand. Udfør målinger med Glan-Thompson polarisatorer i excitation (0 °) og emission (54,7 °) sti (magiske vinkel forhold) ved hjælp af en spectr al båndbredde på ca. 5 nm og 2,5 nm for excitation og emission monochromator hhv. Mål prøver efter overføre dem til en fluorescens kuvette med 3 mm vejlængde tage sig, at tæller ikke overstiger 10 6 s -1.
- Beregn kvanteudbytte ifølge
hvor n og n Std er brydningsindekserne på opløsningsmidlet af prøven og standarden hhv. f (λ) og f_Std (λ) er fluorescensintensiteterne af prøven og standarden ved bølgelængden λ. A (λ ex) og A std (λ ex) er absorbansen af prøven og reference ved excitationsbølgelængden og Φ std er kvante udbytte af standarden.
le "> 8. Beregning af Isotropic Förster Radius- Beregn isotrope Förster radius (
) Fra emissionsspektret for donoren molekyle, absorptionsspektret af acceptor-molekylet, kvantumsudbyttet af donoren og brydningsindekset for mediet. Brug freeware PhotochemCAD til beregning af . Men enhver anden tilgængelig software kan anvendes i stedet 36.
) Fra emissionsspektret for donoren molekyle, absorptionsspektret af acceptor-molekylet, kvantumsudbyttet af donoren og brydningsindekset for mediet. Brug freeware PhotochemCAD til beregning af 9. Måling af Anisotropier
- Bestem steady state fluorescens anisotropier fra optagelser af fluorescens spektre med forskellige polarisator indstillinger excitation / emission (V / V, V / H, H / V, H / H) 36.
- Beregn G-faktor, som korrigerer for polarisering artefakter i instrumentet for hver bølgelængde fraforhold
og bruge den til at beregne anisotropi værdi for hver bølgelængde:
hvor jeg xy angiver intensiteten til excitation polarisering x og emission polarisering y.
- Gennemsnittet af værdier på tværs emission spektralområde at beregne steady-state fluorescensanisotropi.
10. Montering af Fast-NPS Software
- Hent UCSF Chimera fra http://www.cgl.ucsf.edu/chimera og følg installationsvejledningen.
- Gå til webstedet for "Institut for Biofysik"ved Ulm University: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Hent den aktuelle version af Fast-NPS og pakke den til en mappe valg. Åbn undermappen "Redistributable" og installere Visual C ++ Redistributable, som er passende for systemet.
11. Centrering FBF fil
- Åbn FBF fil (er) af interesse i Chimera. Vælg alle atomer af den makromolekylære kompleks og beregne koordinaterne for det geometriske tyngdepunkt (Tools | Structure Analysis | Axes / Planes / centroider | Definer tyngdepunkt ... | Ok).
- Åbn Svar Log (Foretrukne | Besvar Log) og Transformation Tool (Værktøj | Bevægelse | Transform koordinater). Indlæs koordinaterne centroid vist på Svar Log ind tekstfeltet "Shift" af Transform koordinater vinduet og ændre tegn på hver koordinat. Tryk på "Anvend" og gem filen med "Save FBF" (Filer | Gem FBF).
12. Indstillingstillingen Priors
BEMÆRK: Alle værdier anses i ångstrøm.
- Start teknisk sprog computing og ændre den aktuelle mappe til den lokale Fast-NPS mappe. Indtast i kommando-vinduet: FastNPS.
- Opret en ny jobfile i Project Manager (Projekt | Ny).
- Opsæt stilling før (Tools | Model farvestof før).
- I panelet "forudgående basics" definere den rumlige opløsning af positionen før ved at indtaste dens værdi (2 anbefales).
- Udeluk det indre af makromolekylet ved at aktivere afkrydsningsfeltet og klikke på knappen "load FBF". Vælg og indlæse centreret FBF fil som beskrevet i afsnit 11.
- Angiv den omtrentlige diameter (anbefales 13 Å, se diskussion) af farvestoffet ved at indtaste sin værdi.
- Angiv en skeletonization afstand, dvs. afstanden farvestofmolekylet kan trænge ind i makromolekylet (2 Å anbefales).
- ipanel "maksimal forudgående størrelse" indtaste Minimum og maximum koordinaterne for positionen før (anbefalet: x i [-150.150], y i [-150.150] og zi [-150.150]).
- Når du definerer en satellit, aktivere afkrydsningsfeltet "vedhæftet fil via fleksibel linker" i panelet "forudgående basics" og indtaste i panelet "linker" koordinaterne for atom (i centreret FBF fil), hvor farvestoffet molekylet er vedlagt. Endvidere angive længden og diameteren af linker ved at indtaste deres værdier (13 Å og 4,5 Å anbefales, se diskussionen). I tilfælde af en antenne springe dette punkt.
- Tryk på knappen "Beregn tilgængelige volumen".
- Gem position før og eventuelt eksportere det til visualisering formål, ved hjælp af software som f.eks Chimera.
13. Definition af Network Geometry
- Åbn Definer Måling Window (Mode | Edit Geometry).
- Opret en ny farvestof molekyle ved at trykke Buttpå "Ny" i panelet "Farvestoffer".
- Set sin fluorescens anisotropi (afsnit 9) ved at indtaste en værdi, og vælg et farvestof model i rullemenuen "Dye-model".
- Tryk på knappen "Load", vælg den tilsvarende position før og kontroller aktivere afkrydsningsfeltet af farvestoffet. Gentag denne procedure for alle farvestoffer, dvs for alle antenner og for alle satellitter.
- Når du har oprettet alle farvestoffer, definere målingerne. Opret en ny måling ved at klikke på "Ny" i panelet "Målinger".
- Vælg sine FRET partnere i dropdown menuerne "Farvestof 1" og "Farvestof 2" nedenfor.
- Indtast smFRET effektivitet med fejl og isotrope Förster radius af dette farvestof par.
- Endelig markere aktivere afkrydsningsfeltet for målingen. Gentag denne procedure for alle målinger.
BEMÆRK: Ofte netværket bliver stadig mere kompleks, så brugeren kan få forvirret. For at forebygt fejl, kontrollere netværket visuelt ved at trykke på "Check Network" knappen. Figuren viser de aktiverede farvestoffer og indikerer målinger via ledninger forbinder FRET farvestoffer.
14. Beregning
- Åbn Beregning Window (Mode | Beregning).
- Hvis hver farvestof i netværket har en specifik model tildelt, skal du vælge "Brugerdefineret", og start beregningen ved at trykke på "Beregning". At have alle farvestoffer i samme model, skal du vælge en af de fem modeller (klassisk, iso, meanpos-iso, Var-meanpos-iso og Var-meanpos) og fortsætte.
BEMÆRK: Kommandoen vindue angiver forløbet af beregningen. Fast-NPS vil gøre det med en pop op-meddelelse, når beregningen er afsluttet.
15. Visualisering af resultater
- For at eksportere troværdige mængder af farvestofferne, åbne Se resultater Window (Model | Vis resultater).
- Eksport farvestof tætheder:
- Eksportfarvestoffer enkeltvis eller alle samtidigt. For at eksportere en enkelt farvestof vælge den i panelet "Viste Farvestoffer" og tryk på "Export Density". Indtast en resolution (2 anbefales), og vælg en filtype til eksport. På højre tætheden er fremvist, og nogle af dens matematiske kendetegn er angivet.
- For at eksportere alle farvestoffer samtidigt skubbe "Batch Export".
- Åbn de resulterende massefylde filer i Chimera.
16. Sammenhæng Kontrol af valgte model Kombination
- Åbn Se resultater Window (Model | Vis resultater). Hvis i panelet "Calculation Info" tekstfeltet "Sammenhæng" viser en værdi under 90% den nuværende model ikke repræsenterer de målte smFRET effektivitet tilstrækkeligt og er derfor inkonsekvent.
- I tilfælde af uoverensstemmelse tryk på knappen "Detaljeret Sammenhæng". Søg efter de målinger, der har en værdi under 90%. Hvis en eller flere farvestofs overvejende involveret i disse målinger, deres modeller kan forventes at forårsage inkonsekvens. Overveje forskellige farvestof modeller for disse farvestoffer og gentag Fast-NPS beregning.
Representative Results
Transskription er det første skridt i genekspression i alle organismer. I Archaea, er transskription udføres af en enkelt RNA-polymerase (RNAP). Sammenlignet med eukaryoter, den arke RNAP har en slående strukturel lighed med deres eukaryote kolleger og samtidig have en enklere transskriptionel maskineri. Således kan Archaea anvendes som et modelsystem til at studere eukaryot transkriptionsinitiering af RNA-polymerase II (Pol II). For nylig har den komplette arkitektur arke RNA-polymerase åben kompleks blevet bestemt ud fra enkelt-molekyle FRET og NPS. Dataene fra NPS-analyse blev anvendt til at bygge en model af den komplette archaeorganisme åben promotor kompleks, som giver nyttig indsigt i mekanismen for transkriptionsinitiering.
For at belyse denne struktur blev smFRET effektivitet målt mellem ukendte antenne farvestofmolekyler beliggende inden for åbne promotor complex og flere kendte satellit farvestof molekyler, der blev indarbejdet i fem referencesteder i RNAP, hvis positioner er kendt fra krystallografiske strukturer (FBF-ID: 2WAQ) 37. Antennen farvestoffer blev fastgjort til den ene af forskellige positioner på den ikke-skabelon-DNA, TFB, TBP eller TFE. Den komplette netværk, der anvendes i denne undersøgelse bestod af mere end 60 målte afstande.
Figur 7 viser modellen for den komplette arke åben promotor kompleks bygget fra NPS analysen. Det består af dobbeltstrenget promotor DNA (lys og mørk blå), RNA-polymerasen (grå) og transkription initieringsfaktorer TBP (lilla), TFB (grøn) og TFE (gul). Modellen er overlejret med resultaterne fra NPS analysen, de troværdige mængder, der blev beregnet ved hjælp af klassiske model (A), iso-modellen (B) meanpos-iso model (C), VAR-meanpos-iso-model (D) og VAR-meanpos model (E).
Figur 1: Workflow erhvervelse og behandling af de parametre, der er nødvendige for Fast-NPS beregning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksemplarisk fluorescensintensitet tid spor af en smFRET begivenhed. Fluorescensintensiteterne af donoren (grøn) og acceptor-molekylet (rød), der viser de tre karakteristiske faser, nemlig I: smFRET, II: donor fluorescens efter acceptor-fotoblegning, III: baggrundsfluorescens efter donor fotoblegning.g2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skematisk illustration af strømningskammeret for smFRET eksperimenter. Strømmen kammer er monteret på en tilpasset metalholder med akryl glas holdere. Sandwich-design af strømningskammeret omfatter en kvartsglas (kvartsglas) glide med to huller til fastgørelse indløb og udløb slanger, en forseglende film og et dækglas, der lukker strømningskammeret. Prismet for TIRF belysning er monteret på den nederste halvdel af strømningskammeret. Hule fanen skruer giver indløb og afsætningsmuligheder for flowet kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fremstilling af kvarts objektglas og forseglingsfilmen. Mekanisk tegning af kvarts objektglas angiver positionerne af hullerne (angivet i millimeter). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Mekanisk tegning af strømningskammeret. Foranstaltningerne til prisme indehaveren af aluminium, acryl glas indehavere og aluminium monteringsramme er angivet i millimeter. Klik her for at se en større version af dette tal.
igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 54.782 / 54782fig6.jpg "/>
Figur 6: Skematisk illustration af prisme-typen TIRF setup anvendes til smFRET eksperimenter. Forkortelser til optiske komponenter: A, blænde; DM, dikroisk spejl; F, emission filter; L, linse; M, spejl; O, mål; P, prisme; PSD, position følsom foto-diode; S, prøve; PS, positioneringspodiet; T, teleskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Simulation resultater af de forskellige model antagelser. Alle billeder viser den arke RNA-polymerase (FBF-ID: 2WAQ, ovenfra) sammen med modellen for promotor DNA (tDNA og ntDNA i blå og cyan, henholdsvis), TBP (lilla), TFB (grøn) og TFE (gul)i arke åbne komplekse 30. De troværdige volumener overlejret for NPS simulering resultaterne af (A) den klassiske model, (B) iso-modellen, (C) den meanpos-iso-model, (D) VAR-meanpos-iso model og (E) det var -meanpos model. Alle mængder er vist ved 68% troværdighed. Den klassiske og VAR-meanpos netværk er i overensstemmelse med smFRET data. Derimod netværk, hvor alle farvestoffer er valgt iso, meanpos-iso eller VAR-meanpos-iso model er i overensstemmelse med de målte data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi præsenterer den procedure setup og eksperimenterende til præcist at bestemme FRET effektivitet mellem farvestoffer knyttet via fleksible linkere til biomakromolekyler, dvs, nukleinsyrer og / eller proteiner.
For at sikre præcise smFRET målinger (Afsnit 3), er det afgørende at udelukke luft fra strømmen kammeret på ethvert tidspunkt under målingen. Desuden skal du sørge for ikke at overbelaste flow kammer med fluoroforer. De fluoroforer skal være klart adskilt for at sikre korrekt analyse. Som smFRET par, der ikke viser blegning af donoren skal udelukkes fra analysen, skal du sørge for, at> 80% af molekylerne i synsfeltet bleges i slutningen af filmen. At tage højde for inhomogeniteter i stikprøven den β-faktor og γ-faktor, korrigere de cross-talk og relative detektionseffetiviteter af donoren og acceptoren kanal henholdsvis beregnes for hver FRET-par individuelt.
Ved målinger på fluorescens spektrometer (§§ 7 til 9) et godt kompromis mellem signalet intensiteten og den spektrale opløsning af de registrerede data skal findes. Til dette formål slidserne i excitation og emission pathway af fluorescensen spektrometer skal tilpasses afhængig af det anvendte instrument og koncentrationen prøven.
Desuden præsenterer vi Fast-NPS analyse metode til at opnå strukturel information af forbigående eller dynamisk MACROMolecular komplekser. NPS er blevet anvendt til at afsløre banen for den ikke-template-DNA-strengen og positionen af transkription initieringsfaktorer i arke RNA-polymerase åben kompleks. Brug af netværk af mere end 60 forskellige afstandsmålinger, viste vi, at Fast-NPS, udstyret med en nyligt gennemført prøveudtagning motor (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. under udarbejdelse), reducerer den nødvendige tid til analyse af denne komplekse smFRET netværk ved ≈2 størrelsesordener, i forhold til den oprindelige globale NPS metode 27. Algoritmen robusthed er rodfæstet i en Metropolis-inden-Gibbs sampler kombineret med en parallel hærdning ordning. Fast-NPS viser nøjagtig reproducerbarhed af net resultater og er i overensstemmelse med resultater tidligere 30 offentliggjorte.
Flere forskellige metoder er blevet offentliggjort til formål at udlede strukturel information fra smFRET målinger 11 op>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alle disse metoder giver kun én bestemt farvestof model. Således farvestoffer, der ikke opfylder de forudsætninger, som den respektive model, kan ikke bruges, eller føre til falske strukturel information. Fast-NPS, tværtimod tillader udvælgelse for hver farvestofmolekyle en anden model. Dette bidrager til at forklare forskellige konformationel opførsel af begge, farvestofmolekylet selv, samt linkeren anvendes til dets fastgørelse. De lokale molekylære omgivelser af farvestofmolekylet, samt dets fysiske egenskaber vil bestemme, hvilken model er mest hensigtsmæssig.
For det analyserede smFRET netværk af arke initieringskompleks, en isotropisk antagelse for alle farvestofmolekyler fører til en drastisk reduktion in størrelse troværdige volumener i forhold til den klassiske model. I kombination med en dynamisk position gennemsnit for alle farvestofmolekyler medianen af alle troværdige volumenstørrelser (ved 95%) reducerer til mindre end 0,5 nm 3. Men disse farvestof molekyle posteriors ikke længere stemmer overens med deres smFRET målinger, hvilket indikerer, at de antagelser gjort føre til falske strukturel information. I modsætning hertil posteriors bestemt i den klassiske model er i overensstemmelse med de bestemte smFRET effektiviteter.
Som antagelsen af isotrope og / eller dynamisk position gennemsnit for alle farvestoffer fører til uoverensstemmelser, Fast-NPS giver farvestof molekyle priors, hvor hver farve kan tildeles en af de fem modeller. Hver model bruger samme tilgængelige volumen. Algoritmen til beregning af farvestoffet AVS gør flere antagelser. I første omgang er fluoroforen rumlige form tilnærmet med en kugle. Således en diameter under hensyntagen fluoroforen er width, højde og tykkelse bør anvendes (§ 12). Endvidere er linkeren facon tilnærmet med en fleksibel stang. Værdierne præsenteres i afsnit 12 blev beregnet for farvestoffet Alexa 647 fastgjort via en 12-C linker. Til dato er det ikke muligt nøjagtigt at bestemme på forhånd, hvilken model, der passer bedst, givet en eksperimentel geometri, og dermed alle modeller bør testes. Generelt vil man vælge den model, der giver den mindst mulige bageste størrelse, mens den stadig er i overensstemmelse med dataene. For at teste om et valg af modeller er i overensstemmelse med smFRET data, beregner vi både den bageste og sandsynligheden. Konsistens betyder, at mere end 90% af de indsamlede prøver fra den bageste er inden for 95% konfidensintervallet af sandsynligheden.
Mens det er rigtigt, at jo lavere anisotropi, jo mindre afstanden usikkerhed, i et smFRET netværk geometriske arrangementer af farvestofmolekyler skal også tages i betragtning. Medens representing farvestofmolekyler med en lav fluorescens anisotropi med en iso model er en typisk første valg, konsistensen test giver et mere direkte middel til at vælge den korrekte farve model. Det optimale valg af farvestof modeller kan føre til en drastisk stigning i lokalisering præcision og samtidig bibeholde netværkets sammenhæng med dens FRET data.
For at opsummere, Fast-NPS gør det muligt at få strukturel og dynamisk information af store makromolekylære komplekser. I modsætning til fælles strukturelle fremgangsmåder, såsom røntgenkrystallografi eller cryo-elektronmikroskopi dette giver mulighed for at overvåge meget fleksible eller forbigående komplekser, hvilket i høj grad udvide vores mekanistisk forståelse af komplekse biologiske processer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowchamber preparation | |||
| Customized metall sample holder | self-built | n/a | |
| quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm | Technical Glass Products | 26007 | |
| coverslips, 60 mm x 24 mm | Marienfeld | 101242 | |
| detergent, Hellmanex II | Hellma | 320.001 | |
| ultra-pure water from Synergy UV | Millipore | 2512600 | |
| Zepto plasma cleaner | Diener | n/a | |
| (3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | |
| biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa | Laysan Bio Inc. | BIOTIN-PEG-SVA-5000 | |
| Sodium biocarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 Sigma | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S2127 Sigma-Aldrich | |
| sealing film (Nescofilm) | Fisher Scientific | 12981805 | |
| Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD | Saint-Gobain Performance Plastics | 720958 | |
| Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) | Fisher Scientific | 12665497 | |
| Neutravidin | Life Technologies | A2666 | |
| Total internal reflection fluorescence microscope | |||
| Nd:YAG Laser, 532 nm | Newport Spectra-Physics | EXLSR-532-100-CDRH | |
| diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso | Cobolt | 904010050 | |
| diode laser 643 nm, iBeam smart | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | |
| dichroic mirror, 532 RDC | Chroma | F33-540 | |
| dichroic mirror, 476 RDC | Chroma | F33-476z | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic | AOTFnC-VIS | |
| plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm | Thorlabs | LJ1703L1-A | |
| plano-concave cylindrical, f = -300 mm | Thorlabs | ||
| prism, PS 991 | Thorlabs | PS991 | |
| focusing lens, f = 75 mm | Thorlabs | LA1608-B | |
| syringe pump, PHD 2000 | Harvard Apparatus | 70-2002 | |
| 2 stepper motors, Z812B | Thorlabs | Z812B | |
| piezoelectric actuator, PE4 | Thorlabs | PE4 | |
| IR diode laser | Edmund Optics | CPS808 | part of the autofocus system |
| dichroic mirror, 775 DCXR | Chroma | 775 DCXR | |
| position-sensing detector (PSD), PDP90A | Thorlabs | PDP90A | part of the autofocus system |
| water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 | Nikon | MRD07601 | |
| dichroic mirror, 645 DCXR | Chroma | 645 DCXR | part of the emission pathway |
| emission filter, 3RD550-510 | Omega Optical | 3RD550-510 | green channel in the emission pathway |
| emission filter, 3RD660-760 | Omega Optical | 3RD660-760 | red channel in the emission pathway |
| EMCCD camera, iXon+ DU897EBV | Andor | AND-20-00032 | |
| EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV | Andor | AND-20-000141 | |
| Miscellaneous | |||
| Varian 50 | Cary | UV-VIS spectrometer | |
| Fluorolog2 | SPEX | fluorescence spectrometer | |
| Solis (V4.15) | Andor | control software for the EM-CCD camera | |
| Apt user utility (V1.022) | Thorlabs | control software for the piezo-motors | |
| Norland Optical Adhesive 68 | Thorlabs | adhesive | |
| PC-AFN-0.8 Nile red | Kisker Biotech | avidin-coated fluorescent multispec beads | |
| Matlab | Mathworks | technical computing language for custon written software | |
| Origin (V9.0) | Originlab | scientific graphing and data analysis software | |
| Hellma 105-202-15-40 | Hellma | 105-202-15-40 | absorption cuvette of 1 cm path length |
| Hellma 105-251-15-40 | Hellma | 105-251-15-40 | fluorescence cuvette with 3 mm path length |
References
- Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
- Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
- Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
- Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
- Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
- Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
- Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
- Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
- Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
- Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
- Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
- Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
- Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
- Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
- Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
- Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
- Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer. J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).
- Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
- Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
- Kapanidis, A. N.
- Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
- Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
- Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
- Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
- Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
- Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
- Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
- Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
- Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
- Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. Boston, MA. (2006).
- Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).
