Summary
इस प्रोटोकॉल चुंबक का उपयोग कर clamping माउस कान त्वचा पर एक ischemia reperfusion-(आईआर) मॉडल की प्रेरण का वर्णन है। एक कस्टम निर्मित intravital इमेजिंग मॉडल का उपयोग करना, हम विवो भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बाद reperfusion में अध्ययन करते हैं। इस तकनीक के विकास के पीछे तर्क कैसे ल्यूकोसाइट्स त्वचा आईआर चोट का जवाब की समझ का विस्तार करने के लिए है।
Introduction
Ischemia-reperfusion चोट (आईआरआई) तब होता है जब वहाँ रक्त प्रवाह (ischemia) ऊतकों (reperfusion) के एक बाद फिर से ऑक्सीजन के द्वारा पीछा की बाधा के कारण एक क्षणिक हाइपोक्सिया है। त्वचा में, ischemia reperfusion-(आईआर) दबाव अल्सर के pathophysiology, जहां लंबे समय तक बिस्तर पर आराम की चोट के लिए लंबी अवधि के अस्पताल में मरीजों predisposes के लिए योगदान कारकों में से एक माना जाता है। इन रोगियों में, दोनों त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों लगातार वजन बोनी प्रमुखता के क्षेत्रों के ऊपर लगाए गए दबाव को उजागर कर रहे हैं, स्थानीय चोटों कि, अगर अनुपचारित छोड़ दिया, परिगलित 1 हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप।
हर्जाना एक आईआरआई में शामिल दुगना कर रहे हैं। ischemia के दौरान, रक्त वाहिकाओं का रोड़ा ऊतकों को ऑक्सीजन वितरण की भारी गिरावट की ओर जाता है। इस एटीपी और पीएच, जो सेलुलर चयापचय में शामिल ATPases निष्क्रिय की कमी का परिणाम है। बदले में, सेलुलर कैल्शियम का स्तर स्पाइक, और जोर दिया है या क्षतिग्रस्त गएल apoptosis या परिगलन 2 से गुजरना। Intracellular सामग्री या क्षति जुड़े आणविक पैटर्न (नम) की रिहाई, HMGB1 की तरह, भड़काऊ प्रतिक्रिया से 3 योगदान देता है। दूसरी अपमान reperfusion के दौरान होता है। ऑक्सीजन और पीएच स्तर reperfusion के दौरान बहाल कर रहे हैं हालांकि, इस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी (आरओएस), जो intracellular लिपिड, डीएनए और प्रोटीन के ऑक्सीकरण की ओर जाता है में परिणाम है। नतीजतन, समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों सक्रिय कर रहे हैं, जो एक माध्यमिक भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि भड़काऊ साइट 2 के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती शामिल है बंद सेट। जबकि भड़काऊ प्रतिक्रिया करने के लिए अग्रणी जैव रासायनिक घटनाओं का झरना अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, प्रतिरक्षा सेल गतिविधियों के स्थानिक और लौकिक विनियमन अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं।
यहाँ, हम साधारण चुंबक का उपयोग कर clamping माउस कान त्वचा पर एक मजबूत आईआर मॉडल का वर्णन है। multiphoton intravital इमेजिंग (MP-IVM) के साथ मिलकर, हमइन विवो भड़काऊ प्रतिक्रियाओं है कि हो reperfusion की जगह लेता है के बाद अध्ययन करने के लिए एक मॉडल की स्थापना की। विकास और इस तकनीक के उपयोग के पीछे तर्क यह समझने के लिए कि कैसे दोनों मध्य और घुसपैठ की कोशिकाओं को वास्तविक समय में आईआर का जवाब कोशिश है।
त्वचा पार्श्व पर clamping तकनीक का उपयोग आईआर के मौजूदा मॉडलों, अत्यधिक आक्रामक हैं, क्योंकि वे त्वचा दिशा में स्टील प्लेट की शल्य आरोपण की आवश्यकता होती है, उन्हें प्रतिरक्षा अध्ययन के 4 के लिए कम-से-आदर्श बना रही है। इसी तरह की एक गैर-आक्रामक clamping तकनीक माउस त्वचा पार्श्व 5,6 में वर्णित किया गया है। हालांकि, इस पद्धति में intravital इमेजिंग घटक के समावेश के कारण, हम बजाय लक्षित आईआर साइट के रूप में कान त्वचा, चुना क्योंकि यह साँस लेने के कारण आंदोलनों में गतिरोध उत्पन्न और इमेजिंग 7.8 के दौरान स्थिरता प्रदान करता है। इसके अलावा, ल्युकोसैट सबसेट कि interstitium अवधि, कान त्वचा और त्वचा पार्श्व के बीच समान हैं, हालांकिसंख्या और अनुपात थोड़ा 9 भिन्न हो सकते हैं। इस प्रकार, कान त्वचा एक आदर्श इमेजिंग साइट का प्रतिनिधित्व करता है।
इसके अलावा, सबसे डेटा इन आईआरआई मॉडल से लिया गया स्थूल मूल्यांकन (अल्सर की ग्रेडिंग) और समापन बिंदु भड़काऊ संकेतक 10 का सूक्ष्म विश्लेषण करने के लिए सीमित कर रहे हैं। इस मॉडल का उपयोग करना, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस की त्वचा में reperfusion के बाद neutrophils के सेलुलर प्रतिक्रिया के वास्तविक समय दृश्य सक्षम है। एक पहले प्रकाशित intravital इमेजिंग कान मॉडल अतिरिक्त संशोधनों (आंकड़े 1, 2) के साथ 8 उपयोग किया जाता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
जीवित पशुओं के साथ काम कर सभी प्रयोगों सभी प्रासंगिक पशु का उपयोग और देखभाल के दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार आयोजित की गई।
1. फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों की पसंद
- 6 से 12 सप्ताह पुराने LysM-EGFP 11 चूहों (या तो पुरुषों या महिलाओं के लिए कोई वरीयता) का प्रयोग करें।
नोट: विभिन्न सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों के उपयोग विवो में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के दृश्य सक्षम बनाता है। इस तनाव में, न्यूट्रोफिल (GFP हाय कोशिकाओं) घूम, monocytes (GFP लो कोशिकाओं), और चमड़े का मैक्रोफेज (GFP लो कोशिकाओं) घूम देखे जा सकते हैं। साथ इमेजिंग मापदंडों का इस्तेमाल किया, केवल GFP पॉजिटिव न्यूट्रोफिल से उज्ज्वल संकेतों का पता लगाया जाएगा।
नोट: प्रतिरक्षा सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस त्वचा इमेजिंग अध्ययन के इस प्रकार के लिए उपयुक्त उपभेदों की एक सूची संदर्भ 8 में पाया जा सकता है।
नोट: यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि सूरजमुखी मनुष्य चूहों इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा pigmen के रूप में,टेड चूहों अधिक photodamage से ग्रस्त हैं। इसका कारण यह है pigmented कान त्वचा बहुत अधिक लेजर प्रेरित speckling (ऊतक जलने का संकेत) के प्रति संवेदनशील है। नतीजतन, न्युट्रोफिल भर्ती और संचय भी स्थिर राज्य 8,12 के दौरान देखा जा सकता है। - विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) 12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ की स्थिति में चूहों रखें।
2. माउस संज्ञाहरण
- Ketamine-xylazine (8 μL जी -1 वजन) के एक अंतर peritoneal इंजेक्शन, 15 मिलीग्राम एमएल का एक मिश्रण -1 ketamine और 1 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 xylazine बाँझ पानी में भंग की रचना के साथ माउस anesthetize।
- तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस रखें। एक पैर के अंगूठे चुटकी पलटा की अनुपस्थिति देख द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण के लिए जाँच करें।
नोट: पहले घंटे के बाद, संवेदनाहारी के बाद तिमाही खुराक subcutaneously एक प्रशासित करने की आवश्यकता होगीडी लगभग 0.5 घंटे के प्रत्येक के लिए पिछले जाएगा। मूंछ या पूंछ के हिल भी संकेत हो सकता है कि संज्ञाहरण से पहने हुए है और एक टॉप-अप के लिए आवश्यक है कि। - जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र स्नेहक का प्रयोग करें।
3. Depilation
- ध्यान से कपास की नोक applicators का उपयोग कर पृष्ठीय माउस कान के ऊपरी दो तिहाई लोमनाशक क्रीम लागू होते हैं।
- क्रीम को दूर करने के लिए एक पूरी तरह से लेकिन सौम्य तरीके से गीला कपास की नोक applicators उपयोग करने से पहले 3 मिनट - 2 के लिए प्रतीक्षा करें।
नोट: बालों को हटाने क्रीम, बहुत देर के लिए माउस कान पर रहने के लिए के रूप में यह सूजन 13,14 उत्पन्न हो सकता है की अनुमति न दें।
4. ischemia और चोट की प्रेरण
- सोना चढ़ाया, N42 ग्रेड neodymium मैग्नेट, 12 मिमी व्यास एक्स 2 मिमी मोटी प्रयोग करें, और लगभग 3000 की एक गॉस रेटिंग के साथ माउस कान त्वचा में ischemia प्रेरित करने के लिए।
नोट: इस मामले में, मैग्नेट के dimpled चेहरे Denoटीईएस अपने उत्तरी ध्रुव। - अपनी व्यक्तिगत प्लास्टिक गाइड में मैग्नेट स्लॉट।
नोट: प्लास्टिक गाइड के स्थान और उच्च शक्ति मैग्नेट की जुदाई को कम करने के लिए कार्य करता है। अपने मजबूत चुंबकीय शक्ति टूटना करने के लिए अभी तक कम प्रतिरोध के कारण, एक दूसरे के लिए या अन्य धातुओं के बहुत पास में अलग-अलग मैग्नेट जगह नहीं है। टूटना और टूटने हो सकती है यदि वे एक-दूसरे की ओर खींच। - स्थिति पहले (पृष्ठीय) चुंबक ऐसी है कि केवल किनारे दूसरा (उदर) चुंबक (चित्रा 3 ए) के साथ संपर्क में है
नोट: यह एक साथ तड़क से पहले वे ठीक से तैनात किया गया है से मैग्नेट से बचाता है। - दोनों मैग्नेट स्थिति ऐसी है कि उदर चुंबक कान (चित्रा 3 ए) पर फ्लैट निहित है।
नोट: इससे पहले कि ischemia प्रेरित है, यह सुनिश्चित करें कि माउस 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है और कहा कि पर्याप्त संज्ञाहरण बनाए रखा है (2.2 कदम देखें)। - एक बार तैयार है, ध्यान से मैग्नेट एक साथ आते हैं (चित्रा 3 ए नोट: इमेजिंग प्रयोजनों के लिए, कान तो यह है कि एक आईआर और गैर-आईआर क्षेत्र मनाया जा सकता है का केवल आधा दबाना।
- ischemia के 1.5 घंटे के बाद, घुमा एक दूसरे से दूर मैग्नेट प्लास्टिक गाइड का उपयोग कर, reperfusion की जगह लेने के लिए अनुमति देकर मैग्नेट को हटा दें।
नोट: देखभाल बढ़ती जब मैग्नेट रखा जाता से कान को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए। Macroscopically दिखाई प्रमुख रक्त वाहिकाओं को फिर से छिड़कना तुरंत (यानी, रक्त वाहिकाओं को तुरंत भर जाता है) के बाद अगर मैग्नेट हटा रहे हैं अंडरग्रेजुएट ischemia स्पष्ट है। हालांकि reperfusion मैग्नेट को हटाने के बाद तुरंत नहीं होती है, रक्त वाहिका रोड़ा केवल क्षणिक है। जैसे, यह के रूप में तेजी से संभव के रूप इमेजिंग के लिए माउस कान तैयार करने के लिए आवश्यक है।
5. रक्त वाहिका लेबल एजेंटों के इंजेक्शन
- इसके तत्काल बाद चुंबक हटाने के बाद, नसों प्रशासन इवांस नीले (10 मिलीग्राम एमएल (रेट्रो कक्षीय या पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से) -1पीबीएस या खारा में; 1 μL जी -1 वजन) या पसंद का एक और रक्त वाहिनियों की लेबलिंग एजेंट।
नोट: इंजेक्शन से पहले, यह सुनिश्चित करें कि पर्याप्त संज्ञाहरण अभी भी कोमल पैर की अंगुली बन्द रखो प्रदर्शन से बनाए रखा है।
6. इमेजिंग मंच पर कान की नियुक्ति
- टेप लंबाई में 1.5 सेमी और चौड़ाई में 1.8 सेमी मास्किंग के 2 टुकड़े काटें।
- चिपकने वाला पक्ष अपनी चौड़ाई के साथ चिपकने के बारे में 1 मिमी छोड़ने whilst एक साथ रहना करने की अनुमति दें।
- दो में मास्किंग टेप में कटौती, लंबाई, कान मंच पर भट्ठा के भीतर अपनी नियुक्ति को समायोजित करने के लिए।
- भट्ठा के माध्यम से आधे रास्ते के बारे में इस मास्किंग टेप डालें, ऐसा है कि चिपकने वाला पक्ष तक चेहरे।
- हीटिंग पैड पर माउस स्थिति, इस तरह के कान imaged किया जा मास्किंग टेप पट्टी के बगल में है।
- दो पीबीएस सिक्त कपास की नोक applicators का उपयोग करके, धीरे चिपकने वाली पट्टी के खिलाफ कान दबाएँ।
- एक गाइड के रूप में पट्टी का उपयोग करना, माउस कान लानाभट्ठा के माध्यम से, जबकि एक साथ मंच की ओर करीब माउस का समायोजन।
- चिपचिपा टेप को निकालने के लिए पहले टेप की चिपचिपाहट कम करने के लिए पीबीएस की एक बूंद जोड़ें।
- अलग मास्किंग टेप से माउस कान के रूप में धीरे संभव के रूप में ठीक एक तूलिका का उपयोग कर।
- धीरे कान पर एक नम कपास टिप applicator रोलिंग द्वारा कान मंच के खिलाफ कान समतल।
- Coverslip के नीचे पीबीएस की एक बूंद (जो तेल का उपयोग coverslip धारक पर स्थिति में रखा जाता है, चित्रा 2) रख दिया और धीरे से कान पर जगह है। अधिक पीबीएस के साथ ऊपर यदि आवश्यक है।
नोट: coverslip धारक इमेजिंग के दौरान स्थिरता बढ़ जाती है। - गुदा तापमान जांच डालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार हीटिंग सिस्टम के लिए तारों को जोड़ने।
नोट: 37 डिग्री सेल्सियस तक शरीर हीटिंग पैड का तापमान और 35 डिग्री सेल्सियस के लिए कान चरण मंच सेट करें।
7. Multiphoton माइक्रोस्कोप सेटऊपर और इमेजिंग पैरामीटर
नोट: इस प्रोटोकॉल एक भी किरण, multiphoton माइक्रोस्कोप एक tunable के साथ उपयोग करता है (680 - 1,080 एनएम) तिवारी: सा लेजर (3.3 डब्ल्यू 800 एनएम, 140 FS की नब्ज लंबाई, 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर) एक 20x पानी उद्देश्य के साथ (एनए = 1.0) intravital इमेजिंग अध्ययन के लिए।
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेजर संरेखित करें।
- 950 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को समायोजित करें।
नोट: GFP और इवांस नीले 950 एनएम पर एक साथ उत्साहित किया जा सकता है। - 500 माइक्रोन 2 scanfield, 505 x 505 पिक्सेल संकल्प, और एक भी लाइन स्कैन में 800 हर्ट्ज के स्कैन आवृत्ति: पूर्वावलोकन करने के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें। "पूर्वावलोकन" क्लिक करें।
- attenuator (लेजर) बिजली टॉगल करें। सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक संकेत हैं, जो गर्मी के नुकसान उत्पन्न हो सकता है लेजर बिजली की अत्यधिक मात्रा में करने के लिए इमेजिंग क्षेत्र को प्रकाश में लाने के बिना उठाया जाता है।
नोट: एक कम attenuator सत्ता पर शुरू और Signa यदि वृद्धिएल मंद है। न्यूट्रोफिल अनुपस्थित जल्दी समय में interstitium से अंक के बाद reperfusion हो जाएगा, मैक्रोफेज एक लाइन के रूप में कम से कम आवश्यक शक्ति निर्धारित करने के लिए, के रूप में पूर्व न्यूट्रोफिल से मद्धम हैं इस्तेमाल किया जा सकता है।
नोट: इस चरण के लिए पहली बार किया जा रहा है, गैर इस्कीमिक क्षेत्र है, जहां बरकरार संवहनी अखंडता की उम्मीद है में सेटिंग्स को समायोजित करने और attenuator सत्ता की स्थापना की सुविधा होगी। बाद के प्रयोगों में, इन सेटिंग्स ज्यादा संशोधन की आवश्यकता नहीं है, जब तक कि लेजर शक्ति अस्थिर है। - पीएमटी सेटिंग्स समायोजित करें।
नोट: पीएमटी के लिए अधिक से अधिक लाभ इष्टतम वोल्टेज के लिए निर्माता से संपर्क करें। की सिफारिश की सीमा से परे पीएमटी वोल्टेज की स्थापना के लिए एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात में परिणाम होगा। सामान्य सिफारिश की सिफारिश की दहलीज को पीएमटी लाभ वोल्टेज स्थापित करने के लिए और संकेत भी मंद होना चाहिए आवश्यक के रूप में attenuator शक्ति बढ़ाने के लिए है। - एक इमेजिंग क्षेत्र के लिए करीब निकटता में है कि चयन करेंischemia के किनारे, बड़े पैमाने पर इवांस नीले रिसाव से होती है।
- GFP और इवांस नीले संकेतों 525/50 bandpass (बीपी) और 655/40 बीपी फिल्टर, क्रमशः का उपयोग कर लीजिए। त्वचीय डिब्बे के भीतर कोलेजन फाइबर के दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) संकेतों के लिए, एक 475/42 बीपी फिल्टर का उपयोग करें।
- एक स्वरूप है कि उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए संगत है में छवियों को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ।
- 500 माइक्रोन 2 scanfield, 505 x 505 पिक्सेल संकल्प, और एक भी लाइन स्कैन में एक स्कैन आवृत्ति 400 हर्ट्ज: प्राप्त करने के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें।
- 4 माइक्रोन के एक कदम के आकार के साथ एक 100 माइक्रोन Z ढेर न्यूट्रोफिल घुसपैठ की निगरानी करने के लिए 1 मिनट के अंतराल पर समय के साथ बार-बार प्राप्त किया जा सकता है,।
नोट: विशेष रूप से एक उच्च प्रवासी वेग, एक अंतराल है कि अब से 1 मिनट सेल ट्रैकिंग विश्लेषण के दौरान कठिनाइयों में परिणाम हो सकता है के साथ ल्यूकोसाइट्स (जैसे, न्यूट्रोफिल) के लिए। इस मामले में, उपयोगकर्ता या तो एसी की मोटाई कम कर सकते हैंquisition ढेर या आवृत्ति स्कैन वृद्धि हुई है।
नोट: इस्कीमिक क्षेत्र के लिए जरूरी अधिग्रहण ढेर संपीड़न (वैकल्पिक रूप से एक उच्च तीव्रता स्वयं सहायता समूह की विशेषता) का एक परिणाम के रूप में छोटे दिखाई दे सकते हैं, बाद में reperfusion बड़े पैमाने पर सूजन का कारण बनता है कि कान प्रफुल्लित करने में परिणाम होगा। जेड दिशा में महत्वपूर्ण drifts उम्मीद कर रहे हैं। जैसे, एक बड़ी Z ढेर के अधिग्रहण के बहाव को समायोजित करने के लिए आवश्यक है। - इमेजिंग दौरान नियमित रूप से पीबीएस और पानी के ऊपर कान नम और उद्देश्य लेंस पानी में डूबे रहते हैं।
नोट: एक ठेठ प्रयोग आमतौर पर 2 के लिए रहता है - 4 h। प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, और एक अच्छी तरह से नियंत्रित संज्ञाहरण शासन के साथ मिलकर, इमेजिंग की अवधि का विस्तार संभव है।
8. प्रयोग समाप्त
- संस्था के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा माउस euthanize जनसंपर्कocedures।
नोट: के रूप में संस्था के नियमों, विनियमों, और दिशा निर्देशों द्वारा निर्धारित हमेशा अनुमोदित विधियों द्वारा माउस euthanize। बार-बार इमेजिंग की जरूरत है, हीटिंग पैड पर माउस रखने के लिए जब तक संज्ञाहरण बंद पहनता है। एक बार माउस पर्याप्त होश आ गया और मोबाइल है, अपने पिंजरे के लिए माउस वापसी।
9. छवि विश्लेषण
नोट: इमेजिंग प्रयोग से उत्पन्न डेटा विभिन्न सॉफ्टवेयर संकुल से देखे जा सकते हैं।
- इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
- के तहत मोड पार, फ़ाइल आयात (ओपन → इच्छित फ़ोल्डर → में किसी भी फ़ाइल का चयन करें "खुला" पर क्लिक करें)।
- छद्म संपादित रंगों यदि डिफ़ॉल्ट रंग लागू नहीं है (संपादन → प्रदर्शन समायोजन → चैनल टैब के तहत, रंग पैलेट से इच्छित रंग का चयन करें)।
- चमक, इसके विपरीत, और पृष्ठभूमि (संपादन → प्रदर्शन समायोजन → टॉगल अधिकतम और न्यूनतम मान) को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि फ़ाइल आयाम सही कर रहे हैं (संपादन → छवि गुण → ज्यामिति टैब के अंतर्गत, voxel आकार की जाँच करें। इस प्रोटोकॉल में, एक्स = 0.99, वाई = 0.99, और जेड = 4)।
नोट: प्राप्त एक्स और वाई पिक्सेल संकल्प द्वारा scanfield आयाम विभाजित करके। जेड प्रत्येक टुकड़ा के बीच मोटाई है।
नोट: इन डेटा सेट का उत्पादन अधिकतम प्रक्षेपण फिल्मों के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है।
नोट: ट्रैकिंग विश्लेषण पूरी तरह से आदेश विवो में उनके कार्य को समझने के लिए सेलुलर गतिविधियों और बातचीत को चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। मौके समारोह सॉफ्टवेयर में उपलब्ध का उपयोग सेल ट्रैकिंग की विस्तृत निर्देश संदर्भ में 15 प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है।
नोट: वहाँ बढ़ाता ल्युकोसैट प्रवास के कई तरीके हैं, जानकारी के संदर्भ में 16 की समीक्षा लेख में पाया जा सकता है, जिनमें से कर रहे हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
के रूप में चित्र 1 में दिखाया इस प्रोटोकॉल, एक कस्टम निर्मित कान त्वचा इमेजिंग मंच का उपयोग करता है। इस मंच के कई सुविधाओं विशेष इमेजिंग की सुविधा के लिए शारीरिक सेटिंग्स को बनाए रखते हुए डिजाइन किए हैं। गर्म पीतल मंच पर कान रखकर न केवल 35 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर शारीरिक कान का कहना है, लेकिन यह भी सांस लेने के कारण अपरिहार्य आंदोलनों से कान आइसोलेट्स। पीतल मंच पर एक धातु क्लिप के अलावा कान पर वजन exerting, जिससे निर्बाध रक्त के प्रवाह को बनाए रखने से coverslip धारक को रोकने के लिए एक अंतर पैदा करता है। मंच मंच भी एक हीटिंग पैड कि इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर माउस बनाए रखना होगा समायोजित करने के लिए बनाया गया है।
Coverslip धारक (चित्रा 2) coverslip वैक्यूम grea की मदद से धातु धारक पर जुड़े होने की अनुमति देने के लिए बनाया गया हैएसई। coverslip धारक एक स्टैंड है कि एडाप्टर की मदद से क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर कुल्हाड़ियों में लचीला समायोजन के लिए अनुमति देता है से जुड़ा है। इस तरह, उपयोगकर्ता पहली बार सही कान पर coverslip की स्थिति को समायोजित कर सकते हैं और बाद में एडाप्टर पर शिकंजा कस द्वारा कि स्थिति को ठीक।
इस प्रोटोकॉल में, हम मैग्नेट के उपयोग ischemia और अनुकरण करने का वर्णन किया है। चित्रा 3 बी प्रदर्शित करता है से पहले कान के प्रतिनिधि विचारों और तुरंत ischemia के बाद। शारीरिक शर्तों के तहत, प्रमुख रक्त वाहिकाओं macroscopically देखे जा सकते हैं। मैग्नेट के बन्द रखो प्रभाव अस्थायी रूप से रक्त का प्रवाह है, जो एक क्षणिक blanching प्रभाव (काला तीर) जब मैग्नेट हटा रहे हैं द्वारा मनाया जा सकता उपजा है।
इस विशेष प्रदर्शन में, इमेजिंग इस्कीमिक क्षेत्र (चित्रा -3 सी के किनारे पर ध्यान केंद्रित किया है (चित्रा 3 डी)। इस intravital इमेजिंग अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण स्थलों बनाता है और स्वतंत्र प्रयोगों के बीच सामंजस्य बनाए रखने में मदद करता है।
आंकड़ों से पता चलता है कि, एक आईआर अपमान के जवाब बरकरार रक्त वाहिकाओं से interstitium में न्यूट्रोफिल बाहर निकलने के घुसपैठ इस्कीमिक क्षेत्र के किनारे अस्तर और चोट साइट (चित्रा 3 डी और मूवी 1) की ओर पलायन में। हम interstitium में पलायन न्यूट्रोफिल की देरी प्रतिक्रिया की उम्मीद पहले के समय बिंदुओं के बाद reperfusion पर व्यवहार्य perfusing रक्त वाहिकाओं की कमी के कारण अन्य सूजन मॉडल की तुलना में। पूरी तरह से इन सेल को चिह्नित करने के लिएular गतिविधियों, सेल ट्रैकिंग विश्लेषण विवो में उनके कार्य को समझने के लिए नियोजित किया जा सकता है। स्पीड, विस्थापन मतलब है, और कीमोटैक्टिक सूचकांक संभावित पढ़ें बहिष्कार कि सेल ट्रैकिंग विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है कुछ कर रहे हैं।
चित्रा 1. intravital multiphoton इमेजिंग के लिए एक कस्टम बनाया कान त्वचा स्टेज के योजनाबद्ध आरेख। (क) उसके आयामों के साथ कान इमेजिंग मंच के शीर्ष दृश्य। (ख) ललाट देखें और आयाम। ध्यान दें कि पीतल की थाली पक्ष में गहरा हो जाता है, के क्रम में मंच को स्थिरता प्रदान करने के लिए, और पतली बीच में, त्वचा के साथ संपर्क क्षेत्र को कम से कम करने के लिए, निर्बाध रक्त का प्रवाह जब कान भट्ठा के किनारे पर मुड़ा हुआ है और यह सुनिश्चित करना मंच पर विश्राम किया। घुमावदार धारक है कि नीचे पिन प्रतिक्रिया की जांच (ग) साइड देखें। हीटिंग पैड हो सकता हैमास्किंग टेप का उपयोग कर मंच पर तय () नहीं दिखाया। ली एट अल।, नेट Protoc, 2012 8 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. Coverslip धारक का डिजाइन; पक्ष और शीर्ष देखें। coverslip धारक एक निश्चित स्थिति में coverslip रखती है और इस प्रकार जेड बहाव कम कर देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. आईआर मॉडल। (ए) योजनाबद्ध आरेख मैग्नेट की स्थिति को दर्शाता है। (बी) (सी) क्षेत्र है जहां चुंबक रखा गया था करने के लिए सम्मान के साथ imaged दिखा कान के योजनाबद्ध। (डी) एक समय चूक एक LysM-EGFP माउस में न्यूट्रोफिल घुसपैठ के बाद reperfusion दिखा क्रम से अधिकतम तीव्रता जेड अनुमान स्नैपशॉट। बीता समय HH में दिखाया गया है: मिमी प्रारूप। स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1. आईआर चोट में न्युट्रोफिल भर्ती। अधिकतम प्रक्षेपण के एक समय चूक अनुक्रम ischemia के 1.5 घंटे के बाद LysM-EGFP सूरजमुखी मनुष्य माउस कान त्वचा में reperfusion के जवाब में दिखा न्यूट्रोफिल (हरा) घुसपैठ। पहले के समय बिंदुओं पर, की कमीइवांस नीले संकेत (लाल) ischemia के बाद अस्थायी पोत रोड़ा इंगित करता है। कोलेजन (नीले, दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी)। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
महत्व
आईआर त्वचा दबाव अल्सर के प्रमुख कारणों में से एक है। दबाव अल्सर के प्रारंभिक दौर (मैं और द्वितीय) मानव त्वचा की हालत का वर्णन (अंतर्निहित चमड़े के नीचे के ऊतकों और मांसपेशियों की तुलना में)। हालांकि, प्रतिरक्षा एटियलजि की एक समझ अभी भी कमी है। यहाँ, हम इस अंतर को संबोधित करने के लिए माउस कान त्वचा पर एक सरल और मजबूत आईआर मॉडल प्रस्तुत करते हैं। हम दो मैग्नेट और बाद के बीच माउस कान clamping चुंबक हटाने (reperfusion) के बाद नीचे की ओर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन द्वारा ischemia अनुकरण। चुंबक का उपयोग समय की एक निश्चित अवधि के लिए प्रत्येक कान पर लगातार दबाव उत्पन्न करने के लिए, ischemia उत्प्रेरण द्वारा, हम प्रयोगों के बीच reproducibility और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए सक्षम हैं।
इस गैर इनवेसिव आईआर मॉडल की ताकत भी प्रदर्शित करने की क्षमता में वास्तविक समय में विवो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में intravital कल्पना की एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल के उपयोग के द्वारा निहित है,जो इमेजिंग के दौरान और अधिक स्थिरता प्रदान करता है त्वचा पार्श्व प्रक्रिया की तुलना में कान त्वचा, जी। वर्तमान त्वचा पार्श्व कुछ मॉडलों के शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं है कि त्वचा 4 की प्रतिरक्षा परिदृश्य बदल सकता है शामिल है। इसके अलावा, इमेजिंग त्वचा दिशा में ही एक तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है, के रूप में सांस आंदोलनों इमेजिंग 5,6 के दौरान इस प्रस्ताव से संबंधित कलाकृतियों के लिए योगदान कर सकते हैं। हमारे वर्तमान मॉडल के लिए इन समस्याओं में गतिरोध उत्पन्न।
आईआर के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के अलावा, इस मॉडल को भी मधुमेह हो सकता है, जहां मधुमेह वृद्धि हुई ऑक्सीडेटिव तनाव के माध्यम से आईआर चोट और खराब हो सकती है जैसे pathophysiological सेटिंग्स करने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझना घाव भरने की समझ के लिए योगदान देगा।
गंभीर कदम
एक बार माउस संज्ञाहरण के तहत है, तापमान बिगड़ा हुआ है और मुख्य शरीर के तापमान में तेजी से। hypot को रोकने के लिएHermia, बाहरी ताप 37 डिग्री सेल्सियस पर मुख्य शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। कान, शरीर कोर करने के लिए distally स्थित, physiologically 1 से कूलर है - 2 डिग्री सेल्सियस और 35 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। हीटिंग में इस निरंतरता भी सेल गतिशीलता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पढ़ें बहिष्कार सुनिश्चित करेगा। इसी समय, हीटिंग सिस्टम कि यह सुनिश्चित करने के लिए माउस संज्ञाहरण की पूरी लंबाई भर में अधिक हीटिंग नहीं है जाँच की जानी चाहिए।
सूरजमुखी मनुष्य चूहों (BALB / सी और C57BL / 6-सी 2J) सभी त्वचा इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयोग की अत्यधिक वर्णक प्रेरित speckling चोटों से बचने के लिए सिफारिश की है। सूरजमुखी मनुष्य चूहों उपलब्ध नहीं हैं, तो छवि अधिग्रहण के दौरान लेजर शक्ति कम हो रही pigmented चूहों के लिए समस्या को कम कर सकता है। हालांकि, आगे अनुकूलन, जरूरत हो सकती है के रूप में ऊतक प्रवेश का एक कम गहराई में एक गरीब अधिग्रहण परिणाम में परिणाम हो सकता है।
कान त्वचा बहुत नाजुक है; इसलिए, देखभाल किसी भी परिस्थिति से बचने के लिए लिया जाना चाहिए किसूजन का कारण बन सकता है। अनुचित तकनीकों के उदाहरण में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं निम्नलिखित हैं: 1) क्या सिफारिश की है पर समय का एक अत्यधिक राशि के लिए पर लोमनाशक क्रीम छोड़ने; जब कान इमेजिंग मंच के भट्ठा के माध्यम से कान लाने या जब मास्किंग टेप से कान detaching 2) कान पर अत्यधिक घर्षण लागू करने; और 3), कान overheating या तो एक दोषपूर्ण हीटिंग सिस्टम या एक गलत तापमान प्रतिक्रिया जांच है कि परिवेश के तापमान के बजाय माउस कोर तापमान रिकॉर्डिंग हो सकता है की वजह से।
संशोधन और समस्या निवारण
समस्या निवारण कान तैयार करने की प्रक्रिया से संबंधित के अधिकांश पहले से 8 सूचीबद्ध किया गया है। कान एक बाद में समय बिंदु के बाद reperfusion पर imaged है, तो कान कान (चित्रा 1) की मोटाई समायोजित करने के लिए 0.5 एमएम धातु क्लिप द्वारा बनाई गई खाई परे प्रफुल्लित हो सकता है। इस परिदृश्य में, कान पर coverslip के स्थानरक्त प्रवाह है, जो स्पष्ट है जब macroscopically दिखाई रक्त वाहिकाओं दृश्य से गायब हो बाधा हो सकती है। इस coverslip धारक और पीतल के मंच के बीच एक बड़ा अंतर बनाने से बचा जाना चाहिए। यह दो तरीकों से किया जा सकता है, या तो स्वयं coverslip धारक (चित्रा 2) की ऊंचाई का समायोजन करके या एक मोटा धातु क्लिप का उपयोग करके।
तकनीक की सीमाएं
इस प्रोटोकॉल में, हम, इस्कीमिक क्षेत्र का स्थान निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है के बाद से इवांस नीले interstitium में इवांस नीले रंग के रिसाव जल्दी समय बिंदुओं के बाद ischemia पर इस्कीमिक क्षेत्र की सीमा के निशान। इवांस ब्लू सामान्यतः एक रक्त वाहिका लेबलिंग एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है। हालांकि, भड़काऊ शर्तों के तहत, नाड़ी अखंडता को गंभीर रूप से समझौता किया है। इस इवांस ब्लू के रिसाव interstitium में में यह परिणाम है। इस मॉडल में, हम जल्द ही reperfusion के बाद रक्त वाहिकाओं और interstitium के बीच इसके विपरीत की एक कठोर नुकसान निरीक्षण करते हैं। जैसे, सेंट मेंudies जहां ल्युकोसैट endothelial बातचीत शामिल कर रहे हैं, हम विभिन्न आकार के अन्य रक्त वाहिनियों की लेबलिंग एजेंटों के साथ प्रयोग करने की सिफारिश (जैसे, dextrans, आदि।)।
भविष्य के अनुप्रयोगों
कैसे प्रदर्शित करने न्यूट्रोफिल त्वचा आईआर का जवाब LysM-EGFP माउस के उपयोग के अलावा, इस मॉडल भी अन्य ल्युकोसैट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, दोनों (monocytes) घुसपैठ में और निवासी मध्य (मैक्रोफेज) ल्यूकोसाइट्स में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह मॉडल भी एक आईआर चोट के बाद रक्त और लसीका अखंडता, साथ ही ल्युकोसैट endothelial बातचीत की जांच अन्य अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। MP-IVM के माध्यम से स्वयं सहायता समूह के संकेत के रूप में कोलेजन कल्पना करने की क्षमता के साथ युग्मित, यह भी आईआर के बाद या घाव भरने के दौरान कोलेजन अखंडता पर नजर रखने के लिए दिलचस्प होगा। सारांश में, हम माउस कान त्वचा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के क्रम में intravital इमेजिंग के लिए आईआर के एक गैर इनवेसिव, मजबूत मॉडल की स्थापना की है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
