Abstract
중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 '타원체'를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.
Introduction
중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 1, 2, 3을 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 (4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 "손실 / 감소"MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의 된 조건을 식별하고 상승했다.
많은 연구는 생체 재료 및 구형 집합체 또는 회전 타원체로 모두 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양을 보여주는 발표되었다. 중간 엽 줄기 세포의 타원체 배양 전임상 또는 임상 시험에서의 치료를위한 세포의 투여 후 생체 내에서 MSC 동작을 이해하는 방법으로 보였다 반면 생체 재료의 중간 엽 줄기 세포는 초기 셀 시드 지지체에 손상된 조직을 대체하는 조직 공학 방법을 위해 설계된 4, 5, 7. 흥미롭게도, 중간 엽 줄기 세포의 형태 타원체는 자발적으로 조직 배양 플라스틱에 부착이 허용되지 않는 경우8, 9, 10. 전통적으로, 세포 응집은 스피너 플라스크 방법 또는 액체 오버레이 기술, 종양 미세 환경을 모방하려고 노력 암 생물학에서 처음 사용 된 방법에 의해 촉진되었다. 최근 추가 방법은 배양 접시에서 세포 응집 세포 간 접착 수지 4, 5, 6을 방지하기 위해 특정 화학 물질로 미리 코팅 된 표면이 보여왔다. MSC의 타원체를 생성하는 가장 간단하고 경제적 인 방법 중 하나는 종종 배아 줄기 세포로부터 배아 체를 생성하기 위해 사용 된 기법에 매달려 방울 배양 그들이다. 드롭 배양 기술을 걸려, 조직 배양 플라스틱에 대한 세포 부착은 세포 aggreg을 용이하게하기 위해 중력을 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면에 중간 방울에 세포를 현탁하고시킴으로써 방지드롭의 정점에 ATION. 회전 타원체 크기 용이 세포 농도 또는 액적 부피 변화를 제어하는 것이 특히 용이 매달려 드롭 배양함으로써 조작 될 수있다.
중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양에 대한 초기 연구는 2D 대응 6, 8, 9에 비해 3 차원 셀의 특성 라디칼 차이를 보였다. 동시에, 보고서는 생체 내에서 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과는, 응답, 마이크로 환경 단서에 의해 활성화 될 항염증제 및 면역 11 요인을 생성하는 능력에 의존하고 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6), 및 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 요인의 많은위한 방법을 포장 전통적인 2D 엽 줄기 세포보다 MSC의 타원체에 의해 훨씬 더 많은 양으로 생산되었다 아이디어세포를 8, 12, 13를 활성화 차원 배양을 사용. 또한, 3D 배양에서 유전자 활성화는 마우스 (12)에 주입 한 후 세포 활성의 적어도 일부분 메커니즘 요점을 되풀이 나타났다. 생체 내에서 전통적인 MSC 효과는 종종 과도 지연 및 "뺑소니"로 설명 될 수있다 같은 실험들은 사용 전에 중간 엽 줄기 세포를 활성화시킴으로써, 세포의 장기간 효과는보다 두드러 수있다. 지난 몇 년 동안, MSC의 타원체를 사용하는 중요한 기능 연구는 염증 반응을 억제하며 타원체를 준비하는 중간 엽 줄기 세포 (2)의 매력적인 양식을 대 식세포, 수지상 세포, 호중구 및 T 세포와 같은 효과기 세포 영향에 의해 생체 내에서 면역성을 조절할 수 있음을 입증 3. 또한, int와 같은 항암 분자의 제조erleukin-24 (IL-24) 및 종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드 (TRAIL)는, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층에 중간 엽 줄기 세포의 상대 3D 문화에 표적 암 치료 8, 10, 14 악용 될 수있는 현상을 증가한다.
기존의 MSC 문화 조직 배양 플라스틱뿐만 아니라 FBS의 사용뿐만 아니라 필요에 따라 임상 극복 할 수 있었다위한 또 다른 장애물은 MSC의 회전 타원체보다 의무 확인합니다. 이 장애물을 해결하기 위해 최근에 특정 화학적 XF 조건 MSC의 구 상체의 형성을 보였다 얻어진 MSC의 구 상체는 FBS (14)의 조건에서 발생되는 회전 타원체와 같은 항염증제 및 항암 성 분자를 생성하기 위해 활성화되었는지 세웠다. 여기서, 이러한 결과는 XF를 이용하여 3 차원 배양에 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 생성을 보여주는 몇 가지 상세한 프로토콜에 제시미디어. 또한, 프로토콜은 함께 마우스에 그대로 타원체를 전달하는 실제적인 방법으로 그들의 항 염증, 면역 조절 및 항암 효과에 관해서는 상기 중간 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가하기위한 효과적인 방법을 설명이 제시된다.
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Protocol
1. MSC의 분리 및 확장
- 초기 통로 준비를 위해 센터에서 중간 엽 줄기 세포와 성체 줄기 세포 (배포 구하는 http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 냉동 튜브를. 또한, 일상적인 프로토콜 14을 다음과 골수 흡인에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하고 냉동 튜브를 저장합니다.
- 최소 필수 배지 (αMEM가) FBS, 2 mM L- 글루타민을 선택 15~20% 프리미엄 보충 알파 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신이다 완전한 배양 배지 (CCM)를 준비합니다. 여과에 의해 배지를 멸균.
- 150mm 세포 배양 접시에 CCM 30 ㎖에 넣고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 요리를 배양한다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 2 분 동안 약 10 6 엽 줄기 세포를 포함하는 냉동 병을 품어.
- 5 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 배양 접시에 바이알의 콘텐츠를 전송하고, 잔류 세포를 포착 접시에서 1-2 ML의 CCM과 함께 바이알 수회 세척 하였다. 적절한 인큐베이터에서 접시 하룻밤을 놓습니다.
- 조심스럽게 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 배양 및 미리 예열 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 3 mL로 중간 엽 줄기 세포를 분리. 분리는 일반적으로 인큐베이터에서 약 3 ~ 4 분 소요됩니다.
- 6 ml의 CCM 사전 예열 37 ° C와 함께 접시에 트립신을 중화하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 세포 수율을 최대화하기 위해 PBS의 세척과 결합합니다.
- 실온에서 10 분 동안 세포 (450 XG)을 원심 분리하여 상층 액을 흡인.
- CCM의 소량의 셀을 다시 중지하고 혈구 및 트리 판 블루를 사용하여 생존 세포 수를 계산.
- 100 세포 / cm 2에서 150mm 요리의 적절한 수의 종자
- 트립신 / EDTA와 같은 상기 세포를 수확하고, 적절한 매질과 하나의 원뿔형 튜브에있는 모든 셀을 결합한다. 다시 원심 분리기 및 세포 수에 대한 동일한 매체의 작은 부피로 세포를 다시 일시. 표준 CCM (FBS 함유) 또는 다양한 시판 XF 매체 제형을 사용하여, 여기에 인간 혈청 알부민없이 모두 XF 매체 -1- (XFM-1) 및 XF 매체 -2- (XFM-2)라고 함 (HSA 13 ㎎ / ㎖) 보충.
XF 조건에 따라 드롭 문화 매달려 3-D의 활성화 MSC 타원체 2. 준비
- 약 25,000 세포의 타원체를 생성하기 위해 CCM으로 수확 된 중간 엽 줄기 세포, XFM-1 XFM-1 + HSA (13 ㎎ / ㎖) XFM-2 또는 XFM -2- + HSA 714 세포에 (13 ㎎ / ㎖)에 희석 / μL.
- 세포의 피펫 35 μL은 / 방울 상150mm 반전 배양 접시 뚜껑의 밑면. 여러 상품을 쉽게 멀티 채널 피펫을 사용하여 피펫 팅 할 수있다.
주 : 크거나 작은 회전 타원체이 요구되는 경우, 세포 농도 또는 적절하게 방울 체적 (25-45 μL)을 변경. - 요리의 기본으로 실온 PBS 20 ㎖를 전송하고 하나의 연속 꾸준한 운동의 드롭의 정점이 아래에 직면 그래서, 방울을 포함, 뚜껑을 뒤집습니다. 배양 접시의 기초에 조심스럽게 뚜껑을 놓습니다.
- 해당 분야의 조립을 허용하는 데 방해없이 3 일 동안 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
- 72 시간 후, 조심스럽게 뚜껑을 제거하고 방울, 다시 한 번 상승에 직면 있도록 반전하여 회전 타원체 수확을 시작합니다.
- 각도를 대략 10 ~ 20 °까지 뚜껑이 셀 리프터를 사용하여 접시 가장자리는 타원체를 함유 방울을 누른다.
- 1,000 μL 파이프와 15 ML 원뿔 튜브에 분야 및 매체로 이동TTE. 사용 방 온도 PBS와 접시를 씻어 회전 타원체의 최대 복구를 보장하기 위해 같은 팁 피펫.
- 실시간 PCR 분석 (프로토콜 3)의 경우, 실온에서 5 분 동안 450 XG에서 구 현탁액을 원심 분리하여 상층 액을 흡인. PBS로 회전 타원체를 세척하고 모두 원심 분리 및 흡입 단계를 반복합니다. 동물로 전달 (프로토콜 8)의 경우, 구 원심 분리하지 않고 튜브 (~ 3-4 분)의 바닥에 정착 할 수 있습니다.
항 염증 및 항암 마커 3. 실시간 PCR
- DNA 무료 총 단층 중간 엽 줄기 세포에서 RNA (프로토콜 1)과 PBS로 세척하고 원심 분리 MSC의 회전 타원체 (프로토콜 2)를 분리 균질 열 및의 RNase없는 DNase의 세트와 RNA 추출 키트를 사용합니다.
- 를 Lyse 적어도 10 만 단층 중간 엽 줄기 세포 분리 15 ml의 각 조건에서 20 회전 타원체 RLT 버퍼가 β-머 캅토 에탄올 (1 : 100)를 포함와 원뿔 튜브.
- 트랜스1.5 ml의의 RNase없는 튜브로 철저하게 혼합 해물을 FER 및 회전 타원체 용해에 도움이 냉동실 (-80 ° C) 적어도 3 시간에 배치합니다.
- 간단히 얼음, 소용돌이의 세포 용 해물을 해동하고, 시중에서 판매하는 포유류 총 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA 분리에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 정량화 분광 광도계를 사용하여 격리 된 RNA의 품질을 평가한다.
- 실시간 PCR에의 cDNA를 생성하는 제조업체의 지침에 고용량 cDNA를 역전사 키트 또는 동등 따라 사용합니다.
- 얼음의 cDNA 샘플, 상업적으로 설계된 실시간 PCR 프라이머 / 프로브 (유전자 발현 분석 실험) 및 PCR 마스터 믹스를 놓습니다. GAPDH (대조) PTGS2 (COX-2, 항 염증)에 대한 프라이머 / 프로브를 사용 TNFAIP6 (소염 TSG6), TRAIL (항암) 및 IL-24 (항암).
- 유전자 발현 분석법 및 고속 Unive 대한 제조자의 지시에 따라 실시간 PCR 반응을 준비rsal 마스터 믹스.
- 실험 문서를 생성하고 실행을 수행하기위한 실시간 PCR 장비에 대한 지침을 따르십시오.
- 기준선 8, 14와 내인성 제어 및 중간 엽 줄기 세포 단층으로 GAPDH를 사용하여 유전자 발현에서의 상대적인 변경 (상대적인 양 RQ)를 계산하여 ΔΔC T 방식을 사용하여 데이터를 분석한다.
면역의 분석 실험 및 안티 - 암 가능성에 대한 CM 4. 컬렉션
- 그러나, 셀 리프터과 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 관에 상술 한 바와 같이이이 형상을 희석되므로 PBS로 접시의 뚜껑을 세척하지 마십시오 회전 타원체와 CM을 수확.
- 조심스럽게 피펫으로 무 세포 상층 액을 수집하고, 실온에서 5 분 동안 450 × g으로 원심 분리하고, 1.5 ㎖의 튜브에 상청을 전송.
- 조심스럽게 카스티를 수집, 실온에서 5 ~ 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기arified 피펫과 CM, 그리고 냉동실에 저장을 위해 새로운 1.5 ml의 튜브에 CM을 전송 (-80 ° C). 여러 분석을 위해 그것을 사용하는 경우 이전에 동결에 CM의 분취 량을 준비합니다.
주 : 앞서 하류 분석을 수행하는, PGE2 농도, CM의 항 염증 가능성을 보여주는 좋은 지표가 제조자의 지시에 따라 시판 ELISA 키트를 사용하여 결정될 수있다. TSG6 농도는 발표 프로토콜 (14)을 사용하여 결정될 수있다.
5. 대 식세포 분석은 MSC-CM의 항 염증 가능성을 평가하는
- L- 알라 닐 -L- 글루타민을 함유 FBS 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신을 선택한 10 %의 프리미엄이 보충 된 둘 베코 개변 이글 배지 (DMEM)로 구성 식세포 매체를 준비한다. 필터 - 소독 매체를.
- 약 10 6 J774 마우스 대 식세포의 고정 된 유리 병을 얻어 37 ° C의 물을 욕조에 2 분 동안 병을 품어.
- , 뜨는을 대기음 대식 세포 배지 1 ㎖에 대 식세포를 일시 중단하고, 대 식세포 매체의 30ml를 포함하는 150mm 배양 접시에 대 식세포를 전송합니다.
- 매 2 일 매체를 변경하고 약 70-80% 합류 할 때까지 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
참고 : 대 식세포 따라서 매체 변화에 세포를 잃지 않도록주의해야한다 케어, 페트리 접시에 단단히 부착되지 않습니다. - 피펫으로 세포에 대 식세포 매체를 분사하여 대 식세포를 수확. 200-300 XG 실온에서 5 분 동안 50 ml의 원추형 원심 튜브에 세포를 옮긴다.
- 뜨는을 기음과 혈구와 세포 수에 대한 대 식세포 매체의 소량의 세포를 일시 중지합니다. 식세포 나와 200,000 세포 / ml로 농도를 조정dium.
- 의 대 식세포 분석에 대해 설정 시작 12 웰 플레이트의 우물에 대 식세포 매체의 480 μl를 추가합니다.
- 비 자극 제어 우물에 대 식세포 매체의 20 μl를 추가하고 20 μl의 비 조절 또는 매체 MSC 에어컨, 실험 우물에서, 상기 제조. 판을 눌러 우물에서 매체를 섞는다.
- 비 - 자극 된 대 식세포 대조군 웰에 대식 세포 현탁액 500 μl를 옮긴다.
- 500-1 : 1 첨가 나머지 식세포를 자극 1000 0.1 / ㎖ 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 ㎎을 실온에서 50-10 분 동안 배양한다.
- 에어컨 비 또는 MSC 에어컨 매체와 우물에 자극 식세포의 500 μl를 전송합니다. 지속적으로 접시를 여러 번 흔들어 우물을 섞는다.
- 16 ~ 18 시간 동안 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
- 실온에서 5 분 동안 500 XG의 식세포 조정 배지 원심 수확.
- 이전제조자의 지시에 따라 상용 ELISA 키트에 의해 종양 괴사 인자 - 알파 (TNF-α) 및 인터루킨 -10 (IL-10)의 컨텐츠에 대한 새로운 튜브 및 분석에 뜨는.
6. 비장 분석은 회전 타원체-CM의 면역 잠재력을 평가하는
- Rosewell 파크 메모리얼 연구소 (RPMI), 10 % 열 - 불 활성화 FBS, 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신으로 보충 -1640 배지 및 2- 메르 캅토 에탄올로 구성되어 전체 비장 세포 배지를 준비한다. 필터 - 소독 매체를.
- 비장을 통해 복부의 왼쪽에 제조 된 절개를 통해 안락사-남성 BALB / c 마우스에서 수확 비장, 약 전면 사이의 중간 방식과 다리 (14) 뒷다리. 비장 세포 (14)을 분리하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너에 비장을 전송합니다.
- 멸균 페트리 접시 날기에 70 μm의 스트레이너를 통해 비장을 밀어 비장 세포 / 림프구를 분리g 2-3에서 플런저의 부드러운 고무 / 플라스틱 끝 (14) 주사기 ㎖로. 비장을 떼어 놓다하기 위해 연마 원형 모션을 사용합니다.
- 차가운 PBS로 세포 스트레이너를 여러 번 세척하고 50 ML 원뿔 튜브에 페트리 접시에서 세포를 전송합니다. 10 분 동안 4 ° C에서 차가운 PBS와 원심 분리기 (500 XG)와 튜브를 입력합니다.
- 뜨는을 기음과 5 ~ 10 분 (비장 당) 5 ~ 10 ml의 적혈구 세포 용해 용액으로 배양하여 적혈구에서 세포를 취소합니다.
- 500 XG에 5 ~ 10 분 동안 4 ° C에서 튜브와 원심 분리기에 차가운 PBS를 추가하여 용해를 중지합니다.
- 완전한 비장 세포 배지에서 분리 된 세포를 일시 40 ㎛의 여과기를 통하여 여과하고 혈구 세포를 사용하여 계산. 106 세포 / ml의 최종 세포 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액에 비장 매체 추가
참고 :이 기술은 일반적으로 마우스의 비장 당 약 3 × 10 7 비장 세포를 얻을 수 있습니다. - 이전 10 6 비장 세포 (자극 또는 비 자극) (1)의 최종 희석 우물로 12 웰 플레이트의 우물에 비 조절 (컨트롤)을 추가하거나 MSC-CM : 10-1 : 20.
- 실온에서 5 분 동안 500 × g으로 24 시간 원심 후 비장 CM 수확.
- 제조업체의 지침에 따라 상업 ELISA 키트에 의해 인터페론 감마 (IFN-γ) 콘텐츠에 대한 새로운 튜브 및 분석에 뜨는을 전송합니다.
회전 타원체-CM의 안티 - 암 잠재력을 평가 7. 전립선 암 분석
- RPMI-1640 배지 (10)로 보충된다 완전한 RPMI 성장 배지를 준비% FBS, 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신.
- 된 LNCaP 전립선 암세포의 냉동 바이알을 수득하고, 37 ℃의 수욕에서 2 분 동안 바이알을 배양한다.
- 30 전동 피펫을 이용하여 완전 RPMI 성장 배지 ㎖의 5 ml의 피펫 혈청을 함유 한 배양 접시에 바이알의 내용물을 이동. 접시에서 매체 유리 병 여러 번 세척하고 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 세포가 포화 상태에 도달하기 직전에 실온 PBS로 두 번 세척하고 배양을 미리 예열 0.25 % 트립신 / EDTA 용액 3 mL로 된 LNCaP 세포를 분리.
- 완전한 RPMI 성장 배지 디쉬에 트립신을 중화하고, 50ml의 원뿔형 튜브에 세제와 함께 세포를 옮긴다.
- 실온에서 10 분 동안 450 XG에서 세포를 원심 분리하고 상층 액을 흡인.
- 완전한 RPMI 성장 배지의 작은 부피로 세포를 다시 중지하고 혈구를 사용하여 암세포를 계산.
- 세포 증식 분석 키트를 사용하여 세포 성장 시험을 수행하기 위해, 웰로부터 배지를 흡인하고, 냉동 (-80 ℃)에 대한 적어도 3 시간에 플레이트를 옮긴다.
- 플레이트를 해동하고 잘 180 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.2 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 세포 용해 시약 100 μL를 첨가하여 각 세포를 용균
- 표준 곡선 들어 된 LNCaP 세포를 Lyse 알려진 양 전술 한 바와 같이.
- 1 시간 후, 1X 함유 한 세포 용해 완충액 100 ㎕를 추가 세포 증식 측정 시약 100 희석하고 셀 크기를 결정하기 위해 각 웰에서의 형광을 측정한다.
본래 타원체의 8 복강 내 배달
- (프로토콜 2)에 resuspend의 t 전술 한 바와 같이 회전 타원체 중간 엽 줄기 세포를 준비그는 XF 조건을 유지하기 위해 0.2 ~ 0.5 % HSA 보충 무균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 분야. 솔루션에서 HSA 사출시 플라스틱에 구 부착을 방지하는 데 도움이됩니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 40-120 회전 타원체를 전송하고 튜브에 6 ml의 HBSS / HSA를 추가하여 세포를 씻으십시오. 구가 하강하는 3-4 분을 허용합니다. 각 동물에 대한 타원체의 독립적 인 원뿔 튜브를 준비합니다. 또한, 회전 타원체 유지 (아래 8.18 참조) 원하는 경우 전송 후 치료 요인의 생산 (아래 8.19 참조) 결정 분석에 대한 타원체의 추가 튜브를 준비합니다.
- , 뜨는을 대기음 0.2 ~ 0.5 % HSA 보충 무균 HBSS의 100 ~ 200 μL와 타원체를 오버레이하고, 얼음에 튜브를 배치합니다.
- 간단히 유도 챔버에서 약 2 분 동안 핀치 발가락 반사의 소실 될 때까지 100 % 산소의 2 % 이소 플루 란과 동물을 마취.
- BSL-2 장, 지느러미 ASPE 내부에 동물을 배치코 콘을 통해 1.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물의 연속적인 흐름으로, (복부면이 위를 향하게) 아래 ct는.
- 방부제와 같은 70 % 알코올로 낮은 마우스의 복부를 청소합니다.
- 20 G의 정맥 주사 (IV) 카테터의 캡을 제거하고 카테터 스틸 어셈블리와 함께 복강 내 주사를 수행합니다. 마우스 피부를 잡고 한 손으로 사용하고 다른 하나는 주입을 수행 할 수 있습니다. 약 바늘 끝이 중간 선을 향해 가리키는와 근육이 수축 무릎 관절과 생식기 지역을 연결하는 인공 라인의 중간에 주입 지점을 찾습니다.
참고 : 카테터 스틸 어셈블리는 일반 바늘보다 더 높은 저항을 가지고, 따라서 치료는 내부 장기에 부상을 입을 수있는 복부에 너무 깊이 바늘을 주입하지으로 간주되어야한다. 피부의 침투 후 근육 / 복막는 카테터를 배치하는 동안 느낄 수 있습니다. - 부드럽게 카테터 스틸 어셈블리에서 금속 스틸 / 바늘을 제거합니다. CHEC혈액, 소변 및 대변의 스틸을 K와 폐기. 바늘에 피가 내부 기관 (들)의 구멍을 나타냅니다.
- 유체 흐름을 허용하기 위해 주사하는 동안 직립 위치에있는 플라스틱 카테터를 잡습니다.
- 100-200 μL 팁과 피펫을 사용하여 카테터를 통해 무균 HBSS / HSA의 약 100 μl를 주입하여 플라스틱 카테터의 적절한 배치를 확인합니다. 단단한 시일을 형성하는 카테터를 주사기 어댑터 내부 피펫 팁의 끝을 놓는다. 천천히 복강 내부에 유체를 주입.
참고 : 올바른 위치에 카테터의 유체가 자유롭게 카테터의 사소한 조정과 복강 내부에 흐를 것이다. 카테터의 위치가 부적절 (피하 또는 내 장, 또는 신장 등의 바늘 부상 복막 장기의 팁 경우) 저항을 증가 흐름을 줄일 수 있습니다. 피하 배치는 피부에서 명백한 "거품"의 형성에 발생합니다. - t를 수집그는 200 μL 피펫 팁을 사용하여, HBSS / HSA (단계 8.3)의 100-200 μL 제조 타원체를 MSC, 상기 한 바와 같이 카테터를 통하여 복강 내로 분야의 전체 부피 (40-120 분야)를 옮긴다.
- 잔류 타원체를 수집 복강로 주입하는 상기와 동일한 팁을 사용 HBSS / HSA 100 ㎕와 분야를 포함하는 튜브를 세척한다.
- (선택 사항) 카테터를 씻어 복강에 HBSS / HSA의 추가 100 μl를 주입한다.
- 카테터를 통해 살균에 적신 거즈 패드를 놓고 천천히 복강에서 카테터를 제거하고 폐기합니다.
- 부드럽게 회전 타원체의 고른 분포를 확인하기 위해 손가락으로 복강 마사지.
- 동물이 가까이 감독하에 복구하고 주사 부위에서 출혈을 감시 할 수 있습니다.
- 나머지 회전 타원체의 카테터 15 ML 튜브를 검사합니다. 몇 구를 관찰하기 위해 정상입니다카테터 / 튜브.
주 : MSC 타원체 배달 기재된 기술은 정상 동물 또는 부상 다양한 모델에서 사용하기 위해 채택 될 수있다. 이 기술은 성공적 마우스 각막 손상 및 패혈증 모델에서 타원체 주입뿐만 아니라, 지 모산 - 유도 된 복막염 모델 (8)에 사용되어왔다. - (선택)이 유지 구 상체의 수를 정량화하기 위해, DNA 기반 세포 수 정량 키트 / 시약을 사용한다. 15 ML 튜브를 통해 사용 카테터를 잡고 격렬하게 다시 15 ML 튜브에 남아있는 구체를 강제로 카테터를 통해 HBSS / HSA를 분배.
- 실온에서 5 분 동안 500 XG에 15 ㎖의 튜브를 원심 상청을 흡인. 냉동기 (-80 ℃)에 대한 적어도 3 시간에 구형 펠렛을 함유하는 튜브를 옮긴다.
- 튜브를 해동 및 180 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.2 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 세포 용해 시약 500 μL를 첨가하여 용균 스피어
- 제어 fre를겔과를 Lyse 전술 한 바와 같이, (하나의 주입을 위해 준비 타원체의 수에 바람직 상당) 타원체의 알려진 양.
- 상기 키트에서 세포 증식의 측정 시약의 1:50 희석액을 함유하는 1X 세포 용해 완충액 100 μl를 1 시간 후, 96 웰 마이크로 플레이트에, 복제에서 세포 용 해물 100 ㎕를 전달하고 각각의 웰에 추가한다. 10 분 후, 대조 시료와 실험 샘플 (들)과 비교하여 주사하지 않은 분야의 수를 결정하기 위해 각 웰에서의 형광을 측정한다.
- 전송 분야에 의해 생성 된 PGE2의 농도와 TSG6를 측정하여 (선택 사항) 주입을 준비 타원체의 활성화 수준을 평가합니다. 전송 2 % FBS 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충 한 2 ml의 αMEM 함유하는 12 웰 또는 6 웰 플레이트에, 상기 한 바와 같이 카테터를 통해 40-120 분야. 6 시간 동안 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 의 매체로 이동웰을 1.5 ml의 15 튜브에 6 시간 후, 실온에서 5 분 동안 450 XG에서 튜브를 원심 분리.
- 실온에서 5 ~ 10 분 동안 10,000 XG에 피펫과 원심 분리기를 사용하여 신선한 1.5 ml의 튜브에 세포가없는 상층 액을 전송합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 상업 ELISA 키트를 사용하여 PGE2 농도 (CM의 항 염증 가능성의 좋은 지표)에 대한 새로운 1.5 ml의 튜브와 분석에 명확히 CM (뜨는)를 전송합니다. TSG6 농도는 발표 프로토콜 (14)을 사용하여 결정될 수있다.
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Representative Results
현재 작업에 매달려 드롭 문화는 소형 구형 마이크로 조직 또는 XF 조건에서 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 '타원체'을 생성하기 위해 사용되었다. 그림 1의 임상 로드맵은 중간 엽 줄기 세포는 자기 조립에 권장되는 타원체, 또는 CM은 구 유래의 치료 요인로드 한 후 72 시간에 대한 방울 매달려에 현탁 때 타원체로 수집 될 수 있으며, 잠재적으로 모두 사용되는 것으로 묘사 연구 및 임상 응용 프로그램. 구 생산에 필요한 세포의 다수 cm 2 당 일반적으로 저밀도 100-200 세포를 중간 엽 줄기 세포를 시딩하고 약 80 % 합류 (도 2까지 6-7일 위해 세포를 확대하여 일주일 이내에 취득 할 수있다 ). 세포 성장 동역학은 매일 생존 세포를 계수함으로써 결정 강력한 확장 단계 (3-7 일) 1~2일 간략한 유도기 (도 2c를 <다음 지적/ STRONG>). 통로 (2) 또는 제 3 엽 줄기 세포는 통상적 CCM에서 배양 된 세포를 냉동 보존 1,000,000 단일 바이알로부터 50-100000000 세포를 수득 하였다.
확장 및 수확 후, 중간 엽 줄기 세포는 타원체, μL 당 일반적으로 500 ~ 1,000 세포를 생성하는 높은 세포 농도로 일시 중단됩니다. 매달려 드롭 배양 이후에 (도 3) 대칭 적절 접시의 바닥에 위치되는 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면 상에 중간 엽 줄기 세포를 함유하는 배지 25-40 ㎕의 액 적을 이송에 의해 제조된다. μL 당 714 세포에서 CCM의 35 μl의 방울에 현탁 경우 (예 : 드롭 당 25,000 세포), 중간 엽 줄기 세포는 먼저 결국 드롭 (그림 3C)의 정점에서 72 시간에 하나의 컴팩트 한 영역을 생성하기 위해 병합 작은 집합체로 조립한다. 회전 타원체는 MSC 확장에 최적화 된 시판 XF 미디어의 여러 종류에 72 시간에 걸쳐 형성여기 XFM-1 및 XFM-2라고도합니다. 그러나 XFM-1 단일 컴팩트 분야의 형성은 13 ㎎ / ㎖ 인간 혈청 알부민 (HSA), CCM의 추정 된 총 단백질 함량 (도 3d)를 반영하는 농도의 보충을 필요로한다. 단일 소형 구체 쉽게 HSA없이 또는 단백질 무료 αMEM (그림 3D)에서 기본 XFM-1에서 형성하지 않습니다. 적절한 화학적으로 정의 된 XF 매체 (예 XFM-1 + HSA)에서 구 조립, MSC 표현형의 변화 근본적으로 (그림 4), 때, PGE2 및 TSG6 (그림 4C)을 포함하여 상향 조절하는 다수의 항 염증 인자의 발현 중. 그러나 TSG6 및 PGE2의 생산은 현저하게 HSA (그림 4C)없이 XFM-2 또는 XFM-1의 분야로 배양 된 중간 엽 줄기 세포의 증강되지 않습니다. 특히 이러한 항 염증 인자뿐만 아니라, 항암 요인 TRAIL 및 IL-24가 높은 경우 t, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층하는 구형 엽 줄기 세포에 비해 상향 조절 된그는 인간의 혈액 (그림 4D)에서 준비 중 재조합 HSA (RHSA) 또는 임상 등급 HSA (CHSA) 보충 XFM-1에서 배양 한 분야입니다.
다양한 미디어 제형으로 제조 MSC 분야의 치료 가능성을 평가하기 위해, 여러 가지 실제 테스트는 (그림 5) 수행됩니다. 타원체의 면역 조절 성 특성은 첫째 LPS 자극 식세포 및 CD3 자극 된 비장 세포 / 림프구 (그림 5)에 의해 생성 된 사이토 카인의 수준에 구 CM의 효과를 측정하여 시험 관내에서 결정된다. MSC에서 CM은 CCM 식세포 TNFα 및 IFNγ의 비장 XFM-1 / HSA 현저히 억제 생산 분야에서 배양하면서 동시에 항 염증 사이토 카인 수준이 증진 IL-10 (도 5a 및도 5b). 분야의 항암 특성은 구 형상 (O)의 영향을 측정함으로써 평가되고N 성장 된 LNCaP 전립선 암세포의 형태. XF 매체 XFM-1 / HSA 효과적으로 FBS 함유 CCM (도 5C 및 5D)과 유사한 된 LNCaP 증식을 감소시켰다.
중요한 것은, 그대로 MSC 스피어 (도 6) 생체 내에서 세포의 항 염증 활성을 테스트하기 위해 마우스의 복강 내로 투여 될 수있다. 이 실험을 위해,이 분야 XF 상태를 유지하면서 플라스틱 배관에 그 접착력을 최소화 HSA의 낮은 농도를 함유하는 HBSS로 주입을 위해 준비된다. 이어서, 구체 쉽게 적절한 표준 복강 내 주사를 위해 배치 된 니들 / 카테터 조립체 (도 6c과도 6d)를 통하여 피펫 (도 6b)을 이용하여 포집 관 (도 6a)에서 전송 한 후 주입 될 수있다. 이 방법을 이용하여, MSC의 타원체 규칙적 일 수무결성 (그림 6 세대 6H)을 방해하지 않고 효율이 90 % 이상 (그림 6E 및 6F)에서 전송. 복강 내에 카테터 팁의 부적절한 위치는 가난한 구 납품 및 높은 유지 (그림 6 층)에 연결됩니다. 중요한 것은, 피펫 / 카테터 내의 구 보존 레벨 질적 육안 검사로 결정되거나, 정량적 / 수집 잔류 구체 용균 시판 DNA 기반 셀 정량 시약 / 키트 (도 6F)로 세포 수를 측정함으로써. 포스트 분사 구 보존 분석 실험 중에 포함 / 제외 기준을 만들 수 있습니다. 특히, TSG6 및 PGE2의 높은 수준을 분비하는 CCM 및 XFM-1 / HSA 회전 타원체의 능력은 드롭 문화 (그림 6I)에 걸려에서 구체의 전송 후 최소 6 시간을 유지됩니다. 자신의 체외 EF 유사fects는 XFM-1 / HSA 분야는 염증성 TNFα (그림 6J)을 감소시키면서 즉시 복막에 정맥 LPS의 관리, 강화 된 PGE2 및 IL-10 수준으로 전신 염증의 유도에 따라, 마우스의 복강에 주입.
그림 1 : XF 조건에서 구형 마이크로 조직으로 준비하는 중간 엽 줄기 세포의 secretome를 활용하기 위해 개발 플랫폼의 도식 표현. 단층 문화 (1) 등의 확장에 따라, 중간 엽 줄기 세포는 프라임 / 세포를 활성화 높은 세포 농도로 배양 접시 (2)의 뚜껑에서 방울을 걸려에서 일시 중단됩니다. 72 시간 후, (3) 조정 배지 (CM) 및 (4) 본래 타원체가 소적에서 수확 다양한 하류 어플리케이션에서 이용 될 수있는 두. 형상은 면역 조절 인자뿐만 아니라 다른 치료 COMPON 풍부엔트. 매달려 방울 형성 컴팩트 타원체 쉽게 도관 (6)을 통해 생체 내 투여 효과적으로 피펫 (5)를 사용하여 전송 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 단층 배양 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 성장 특성. 통로 (2)의 중간 엽 줄기 세포는 15cm 접시 (접시 당 15,000 세포)와 CCM 7 일간 배양 낮은 밀도 (cm 2 당 100 셀)을 접종 하였다. 보통 하루 5 ~ 6 (수확하기 전에 24 ~ 48 시간)에 다시 3 일에 변경 하였다. 세포를 플레이 팅 후 MSC들 삼일 (A) 7 일간 (B)의 대표적인 위상차 현미경 사진. 스케일 바 = 200 μm의. 중간 엽 줄기 세포의 (C) 성장 동역학3 기증자로부터 얻은 날 (7)에 일이 매일 가능한 부착 세포의 수를 계산하여 결정 하였다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : XF 매체에 MSC의 타원체를 프라이밍에 대한 드롭 문화를 걸려 제조. 기술을 묘사 (A) 사진이 빠르게 조직 배양 접시 뚜껑의 아래쪽에 방울을 걸려 층합니다. (B) 사진 교수형을 설명하면 요리의 기초 위에 반전과 뚜껑의 위치 후 삭제합니다. (C) 위상차 현미경으로 시각으로 매달려 드롭 25,000 엽 줄기 세포의 집계에 시간에 따른 변화를. 목적은 드롭의 정점에 집중했다. 스케일 바 = 500 μm의. (D) 난 ...MSC 분야의 GES가와 FBS (예 : CCM)없이 αMEM, XFM-1 및 HSA없이, 그리고 XFM-2와 HSA없이 등 다양한 미디어 제제를 사용하여 드롭 문화를 걸려 3 일 후에 형성했다. 스케일 바 = 200 μm의. 패널 D의 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 3-D XF의 문화 MSC 활성화의 평가. (A) 분야 / CM은 / 반전 접시 뚜껑을 기울 셀 리프터를 이용하여 에지 방울 강요 72 시간 후에 수확한다. 25,000 세포로부터 조립 분야를 쉽게 수집 중에 가시화 될 수있다. (B) approxi의 사진많은 조직 배양 접시의 뚜껑에서 수집 한 500 구를, 후면부. 분야는 빠른 속도로 원심 분리하지 않고 튜브의 바닥에 내려. 72 시간을 ELISA로 측정 한 후, PGE2의 (C) 단계는 MSC 분야에서 분비. 실시간 RT-PCR은 TSG6 수준을 측정 하였다. TSG6 및 PGE2 모두 타원체에서 MSC 활성화를 선별하기위한 중요한 지표이다. XF 매체 XFM-1 + HSA는 PGE2와 TSG6 생산 (빨간색 상자)의 높은 수준을 보였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하고 (*** p <0.001, αMEM 샘플에 비해) 학생의 t-test를 분석 하였다. (D) PGE2 ELISA 및 실시간 RT-PCR CCM, 13 ㎎ / ㎖ 재조합 HSA (RHSA) 특별히 보충 XFM-1에서 제조 분야에 대한 분석, 또는 인간의 정맥 혈액으로부터 제조 된 임상 등급 HSA (CHSA). 접어 변화가 부착 된 단층 중간 엽 줄기 세포 (RQ = 1)에서 측정 하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고 (** p <0.01, *** p <0.001 비교 스튜던트 t 검정에 의해 분석 된단층 중간 엽 줄기 세포). 패널 C와 D의 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 생체 기능 분석에서 드롭 문화를 걸려에서 수집 MSC-CM의 항 염증 및 항암 특성을 평가. (A) LPS 자극 된 마우스 대 식세포 (MQ)를 기준으로 TNFα 및 IL-10 생산에 구 CM (CCM 및 XFM-1 / HSA)의 효과를 나타내는 ELISA를 대표 결과. (B) 항 CD3 항체로 자극 된 마우스의 비장 세포 (SPL)에 의해 IFNγ 생산에 구 CM (CCM 및 XFM-1 / HSA)의 영향을 보여주는 ELISA 결과를 대표. CCM 및 XFM-1 / HSA 제조 MSC 분야에서 기본적인 CCM 및 XFM-1 / HSA 또는 조정 배지 (CM)로 처리 된 LNCaP 전립선 암세포의 (C) 위상차 현미경 사진. 된 LNCaP 세포를 RPMI 배지 (대조군)에서 배양 하였다. 스케일 바는 200 μm의입니다. 된 LNCaP 전립선 암세포의 성장 (D) 양적 변화는 시판되는 DNA 기반 셀 정량 시약 / 키트로 측정 하였다. 점선은 잘 5,000 세포의 파종 밀도를 나타냅니다. 모든 패널의 데이터는 평균 ± SD로 표시되고, 스튜던트 t 검정 (** p <0.001)로 분석 하였다. 모든 패널의 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 6 : 20G 정맥 바늘 / 도관 시스템을 사용 XF 조건 하에서 제조 된 중간 엽 줄기 세포의 손상 타원체, 효율적인 전송. (A) 0.2 % HSA가 포함 된 HBSS에 주입을 준비 XFM-1 / HSA MSC의 분야와 15 ML 원뿔 튜브의 대표 사진. (B) 200 μL 피펫 팁에 흡인 후 MSC 분야의 대표적인 사진. (C) 마우스에 그대로 MSC의 타원체를 관리하는 데 사용되는 20 G 바늘 / 카테터 어셈블리의 이미지. 폴리 우레탄 카테터 어댑터 내로 피펫 팁의 적절한 위치 설정을 보여주는 (D) 이미지. 즉시 배양 접시에 카테터를 통해 통과 후 MSC 분야의 (E) 이미지. 약 100 중 95 구를 옮겼다. 마우스의 복강 내로 구 전달 (F)의 효율은 유지 / 용균 분야를 수집하여 측정 하였다용해 분야의 총형로부터 얻은 세포의 수에 대하여 상용 DNA 기반 세포 분석을 통해 정량 피펫 / 카테터 측정 셀 번호. 빨간색 점선은 90 %의 전송 효율을 나타낸다. 불량 구 전달 (71 %)은 하나의 주입 (화살표)으로 관찰 하였다. (G) 패널 E의 분야의 위상차 현미경 (보기 확대). 스케일 바 = 200 μm의. (H) 조직 배양 접시 상에 전송 후 XFM-1 / HSA 구 16 시간의 위상차 현미경 사진. 중간 엽 줄기 세포의 섬유 아세포, 스핀들 형상의 형태가 구형에서 이전 셀에서 유지된다. 스케일 바 = 200 μm의. TSG6 및 PGE2는 CM 수행 된 소염 인자 (I) ELISA 분석법을 2 ml의 αMEM / 2 % FBS를 포함하는 6 웰 플레이트로 분야의 전사 후 6 시간을 모았다. XF 매체 XFM-1에서 제조 분야는 / HSA는 TSG6 및 PGE2 분비 (빨간색 상자)의 가장 높은 수준을 보였다. 데이터는 평균으로 표현± SD가, 학생의 t-test를 분석 하였다 (*** p <0.001, αMEM 샘플에 비해). 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. (J) 독소의 정맥 내 주사 (LPS)에 의해 도전 마우스에서 TNFα의 수준을 감소시키면서 복막 PGE2 및 IL-10을 증가 복강 내로 주입 타원체하는 능력을 예시하는 대표 그래프. 샘플은 염증과 80 타원체 전달 유도 후 복막 세척액 6 시간으로 얻었다. 데이터는 평균 ± SD로, 학생의 t-test를 분석 하였다 표현 (* P <0.05, 대조군과 비교 ** P <0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달성 3) 그들의 항에 관해서 타원체 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가 염증, 면역 조절 성 및 항암 전위, 4) 마우스에 그대로 타원체로 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 제공한다.
중간 엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직 등 다양한 성인 조직으로부터 플라스틱 접착을 통해 분리 할 수있다 다 능성 줄기 세포이다. 중간 엽 줄기 세포는 쉽게 표면 마커의 고유 한 집합을 표현 (~ 20 %) FBS 농도가 상대적으로 높은에서 조직 배양 플라스틱에 전파하고있다지방 세포, 골 세포, 연골 세포 계통 및 1, 16, 17, 18로 적어도 분화 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 생체 내에서 투여 된 후 단지 일시적으로 유지 보여도 인간 질환의 여러 동물 모델에서 유리한 효과를 발휘하는 것으로 입증되었다. 중간 엽 줄기 세포의 효과는 따라서 "뺑소니"라고되어 종종 중간 엽 줄기 세포 (2)에 의해 분비 등 PGE2, TSG-6 및 indoleamine 2,3- 디옥 시게나 제 (IDO) 등의 항 염증 및 면역 분비 인자에 의해 매개되는 3, 11, 19, 20, 21. 그러나, 이러한 요인들을 생성하기 위해, 중간 엽 줄기 세포는 손상된 조직으로부터 신호를 통해 또는 면역 C에서 역시 활성화가 필요받는 사람의 ELL 학생. 이어서, 동물 또는 환자 (22)에 세포를 전달하기 전에 MSC 미리 활성화 프라이밍 또는 프로토콜을 개발하는 새로운 관심이 있었다. 또한, 표준 MSC 준비에 항원 FBS 구성 요소의 존재는 우려를 제기하고있다. 따라서, 연구가 MSC 배양을위한 최적의 화학적 XF 조건을 결정하기 위해 수행되었다. 우리의 최근 연구에서는 먼저 중간 엽 줄기 세포는 타원체를 형성하여 3D 활성화 될 수 있음을 보여 주었다하고 세포 활성화가 특정 조건 XF 8, 12, 13, 14에 따라 달성 될 수 있음을 발견했다.
3D 세포 배양 기술은 셀 기반 연구 정품 생리적 조건을 제공 할 목적으로 수십 년 동안 사용되어왔다. 2D에서 문화는 조직의 3D 특성을 무시하고, 따라서 항상 요점을 되풀이하지 않는다세포 - 대 - 세포 및 세포 신호 전달에서 중요한 세포 간 상호 작용 매트릭스. 많은 3D 배양 기술 그러나, 이러한 방법 많은 가장 큰 단점은 생성 된 회전 타원체의 크기 및 / 또는 특정 고가의 장비의 요구 사항의 이질성이다, 회전 용기, 스피너 플라스크, 또는 다양한 비 접착면을 사용합니다. 연구는 또한 본질적으로 중간 엽 줄기 세포를 장려 매달려 드롭 배양액을 사용하여 수행되었는지에 자발적으로 집합 한 구형 4, 5, 6, 7, 8, 9, 23로. 특히 매달려 드롭 배양 쉽게 세포 농도 및 / 또는 드롭 볼륨을 조절하여 세포 집합체의 크기를 조작 할 수 있다는 이점도 가진 비교적 균일 한 마이크로 조직 / 응집체의 조립을 지원한다. 또한, 매달려 D의 지배ROP 문화 기술은 광범위한 교육을 필요로하지 않습니다. 25-40 μL 방울을 용이하게 높은 세포 농도 μL 당 통상적으로 500 ~ 1,000 개의 세포와 중간 엽 줄기 세포를 제조 할 수있다. 보다 작은 20 μL 빨리 증발하는 경향이 그보다 큰 45 μL 종종 반전 중에 뚜껑 걸쳐 얼룩 떨어진다. 어떤 크기, 속도와 방향성의 방울을 포함하는 뚜껑을 틀지 때, 표면 장력 및 드롭 / 회전 타원체의 적절한 모양을 유지하기 위해 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 인큐베이터에서 중단 문화와 적절한 공기 흐름 또한 각 드롭 내에서 하나의 영역으로 중간 엽 줄기 세포의 집계를 보장하기위한 중요하다.
이 기술의 단점은 매달려 방울을 포함하는 판 어려운 환자 치료를위한 스케일 업을, 인큐베이터에 누적 또는 구를 조립하는 동안 이동하지해야한다는 것입니다. 또한, 드롭 문화를 걸려 매체를 변경하는 것은 매우 어려운이며, 따라서 장기적인 문화 유명해야한다oided. 또한, 매달려 떨어진다 낮은 매체 간 세포 비율은 결국 중요한 세포 기능 및 / 또는 세포 사멸의 손실로 이어지는 영양분 고갈과 폐기물의 축적을 일으킬 수있다.
그러나, 적절한 매달려 드롭 방식으로, 우리는 세포가 강력한 항 염증 분자 PGE2 및 TSG6뿐만 아니라 항암제 분자가 IL-24의 공장되어 있음으로 회전 타원체의 중간 엽 줄기 세포는 매우 활성 또는 프라이밍 될 것으로 입증 꼬리. 우리는 MSC의 타원체 실제로 항염증제 및 면역 것을 도시 배양 대식 세포, 비장 세포, 전립선 암 세포를 8, 12, 13, 14을 사용하여 다수의 기능 분석에서의 2 차원 단층 대응 우수한 항암 특성을 가지고있다. 또한, 우리는 투여시 MSC의 회전 타원체는 강력한 항 염증 효과를 발휘할 수 있다는 것을 보여 주었다복막염 8 마우스의 복강에. 특히, 약 400-500 ㎛의 직경의 큰 회전 타원체 (25,000-30,000 엽 줄기 세포 각각) 효율적 20G 바늘 / 카테터 조립체 및 표준 피펫을 사용 HBSS 작은 부피로 전달 될 수있는 것으로 나타났다. 유체의 흐름에 저항이 높은 결과이 기술 부적절한 카테터 위치로 쉽게 프로토콜에 기재된 바와 같이 제 HBSS / HSA 중 소량 주입함으로써 전송을 구형에 앞서 결정될 수있다. 적절하게 위치 된 카테터의 구 상체는 HBSS가 플라스틱 배관에 부착 구를 최소화 HSA로 보충되어 제공된 자유롭게 흐르고, 그리고 쉽게 가시화 될 수있다. 더욱이,이 기법은 주입을위한 표준 니들 / 주사기를 사용하여 발생할 수있는 셀에 전단 응력을 방지하고, 감염의 위험이 높은 운반 많은 기술적 도전 절개 수술에 대한 필요성을 회피한다. 하나의 주요 단점은 t이다카테터를 통해 구 전송에 대한 저항이 잘록한 부분이 높고으로 회전 타원체의 모자 다수는, 예컨대 복강 같은 넓은 체강 내로 주입 될 수있다.
우리는 또한 최근 타원체의 MSC 활성화 동일한 수준이 특정 시판 XF 매체를 사용함으로써 달성 될 수 있다는 것을 입증 XFM -1- 여기 불리는 것이면 재조합 기술을 통해 사람의 혈액에서 수득 또는 제조 HSA 보충되었을 14. 중간 엽 줄기 세포에 가장 XF 미디어가 처음 2D에서 세포의 최적의 확장을 공식화했다 아마도 때문에, MSC의 회전 타원체는 XF 미디어 (14)의 모든 종류의 PGE2와 TSG6의 높은 수준을 생성하지 않는 점에 유의하는 것이 중요합니다. HSA의 종류가 다양 역가 14주의하는 것이 중요하다. 또한, PGE2의 절대 레벨이 약간 다를 수 활성화 타원체의 CM 검출PGE2를 위해 사용 된 ELISA로 사라져 참으로 경쟁 분석이다. 따라서, 모든 PGE2 ELISA에 적절한 컨트롤을 포함하고, 서로 다른 시간에 분석 샘플 사이 또는 상이한 플레이트에 데이터를 직접 비교 피하기 위해 중요하다. 또한, 중간 엽 줄기 세포는 철저하게 이전에 매달려 준비에 XF 매체에 세척 따라서 잔류 CCM과, FBS 구성 요소의 제한 이월을 제거하기 위해 삭제해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜이 쉽게 구 형성 및 치료 유전자 발현의 다른 미디어 배합물을 평가하기 위해 채택 될 수있다.
중간 엽 줄기 세포는 3D에서 배양 할 때 분명히, 일반적으로 2D 중간 엽 줄기 세포에서 발생하지 않는 수많은 세포 신호 이벤트는 모션에서 설정됩니다. 세포 간 및 세포 - 기질 간 상호 작용 및 인테그린 cadherins 가이드 타원체 형성 및 다짐 24, 25, 26에 의해 매개 및 회전 타원체 치료 가능성이 매우 중요하다. 세포 집계와 공동으로마이너 아폽토시스 다수의 잠재적 치료 인자 4, 5의 제조 결과 MSC 활성화 과정에서 보조를 포함한 타원체 다양한 스트레스 신호로 MPACT. 우리는 이전에 MSC 활성화 및 PGE2 및 TSG6 (12)의 생산 분비 IL-1 신호 전달의 중요한 역할을 나타내었다. 많은 다양한 신호 전달 경로에 대해 MSC 활성화에 그 원조 알 수없는 남아 있지만, 매달려 드롭 문화 플랫폼은이 현상을 연구하고 MSC 기반 치료를 향상시킬 수있는 실용적인 방법을 제공한다. 전체적으로, 우리는 항 염증성, 면역 조절 및 항암 인자를 생성하기 위하여, 여기에서 프로토콜 화학적 정의 XF 조건 하에서 활성화 또는 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포의 프라이밍 방법에 대하여 설명 하였다. 이 그대로 MSC의 타원체가 생체 내에서 제공 할 수있는 방법을 우리는 또한 설명했다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80 °C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
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