活细胞成像与三维分析转染人胚胎肾细胞中血管紧张素受体1a亚型的转运——基于共聚焦显微镜技术

摘要

本文介绍了一种对表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素Ⅱ 1a型受体的细胞进行成像的实验方案，该成像用于观察由血管紧张素Ⅱ处理引发的内吞过程。该技术包括使用第二种荧光标记物对溶酶体进行标记，然后利用软件分析受体与溶酶体在三维空间中随时间变化的共定位情况。

摘要

活细胞成像用于在血管紧张素II（Ang II）刺激后，同时捕获转染的人胚肾-293（HEK）细胞中血管紧张素II 1a型受体（AT_1aR）与细胞内区室的时间序列图像。HEK细胞被瞬时转染含有与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的AT_1aR的质粒DNA。溶酶体则通过红色荧光染料进行识别。在Ang II刺激后，使用激光扫描共聚焦显微镜采集活细胞图像，并通过软件对随时间变化的三维（3D，体素）图像进行分析。活细胞成像可研究受体的转运过程，避免因固定处理带来的干扰，特别是EGFP标记的膜受体可能发生的丢失或人为移位。因此，在对单个细胞进行时间追踪时，可对受体的亚细胞定位进行成像和定量测量。图像采集速度必须足够快，以捕捉囊泡的快速运动；然而，在更高的成像速度下，所收集的光子数量会减少。为了提高成像速度，在选择成像参数（如体素大小）时也必须做出权衡。活细胞成像的重要应用包括研究蛋白质转运、细胞迁移、增殖、细胞周期、凋亡、自噬以及蛋白质-蛋白质相互作用与动态过程等，仅举几例。

引言

总体目标是获取受体在激动剂处理后与特定亚细胞器在时间和空间上共定位的定量证据。因此，本实验的直接目标是在转染后，对人胚胎肾细胞（HEK）中的溶酶体和跨膜受体进行共聚焦显微镜下的延时成像，并随后将成像数据进行三维整合与分析，以定量测量受体向溶酶体的递送过程。研究跨膜受体在配体激活后内吞过程中与溶酶体或其他细胞器的同步转运行为，有助于阐明该跨膜受体在生理及病理生理条件下的调控机制。

在模型细胞系统（主要是HEK293细胞）中，AT_1aR 被认为在血管紧张素II（Ang II）处理后于溶酶体中被降解¹，尽管大多数受体主要定位于多泡体回收内体，随后可被循环回质膜，而大部分配体Ang II则在溶酶体中被降解^2,3,4,5。最近，Li et al. 利用荧光共振能量转移（FRET）和荧光寿命成像显微技术（FLIM）证明，AT_1aR 与溶酶体膜蛋白LAMP1在约10 nm尺度上共定位，表明至少部分受体被靶向至溶酶体并被其降解⁶。这些作者指出，溶酶体抑制剂氯喹可阻断AT_1a....

方案

第一天

1. 细胞接种

1. 制备完全的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。向450 mL DMEM中加入50 mL胎牛血清、5 mL青霉素/链霉素和5 mL L-谷氨酰胺，配制成500 mL完全DMEM，其中补充胎牛血清（10%）、青霉素/链霉素（1%）和L-谷氨酰胺（1%）。
2. 在8孔腔室盖玻片系统中，使用完全DMEM将人胚胎肾（HEK）细胞（传代次数6-11）以每孔50,000个细胞的密度接种。
3. 将腔室载玻片置于37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中培养24小时。

第二天

2. 脂质体转染

1. 在生物安全二级柜中，使用无菌条件新鲜配制 AT_1aR-GFP 质粒和脂质体溶液。
2. 将 2 µL 浓度为 900 ng/µL 的质粒 DNA 储存液加入 178 µL 低血清培养基中稀释，使质粒 DNA 浓度约为 10 ng/µL。
3. 将 4.5 µL 脂质体储存液加入 175.5 µL 低血清培养基中，配制为 1:40 的稀释液。
4. 将脂质体溶液加入质粒溶液中，使用 1 mL 移液器上下吹打 20 次，充分混匀以制备转染混合液。
5. 将混合液在室温（25–27 °C）下孵育....

结果

在本组代表性实验中，将血管紧张素1a型受体（AT_1aR-GFP）构建体（E1,2,3-AT_1aR）克隆至pEGFP-N2质粒中，并转染HEK细胞¹³。对HEK细胞进行时间序列成像并生成动态影像（见活细胞成像1和活细胞成像2视频）。动态影像及静态图像显示，在配体刺激后，AT_1aR-EGFP主要定位于细胞质膜；然而加入Ang II后，这些受体在2.5分钟内即发生内化，形成明亮的囊泡，并在后期逐渐聚集于核周区域的较大囊泡中（图4B、图5和图6A；活细胞成像2）。

对图5中细胞的总细胞GFP强度与总囊泡GFP强度进行定量，可说明当Ang II在刺激后立即诱导细胞皱褶形成和细胞形态改.......

讨论

本文展示的初步实验表明，在短短24分钟的时间过程中，AT_1aR-GFP向溶酶体的递送未发生明显变化。通常情况下，内化受体向溶酶体的递送最早可在15–20分钟内发生。该实验结果支持以下假设：大部分内化的AT_1aR被靶向至较大的、位于核周的内体。Li et al. 提供了至少部分AT_1aR可到达溶酶体的证据，他们比较了血管紧张素II处理后5分钟和30分钟的细胞，发现LAMP1 与AT_1aR在30分钟时存在显著的共定位，而在5分钟时则无此现象⁶。

本文详细描述了细胞制备、成像和分析步骤，并讨论了该先进成像技术中存在的诸多固有陷阱。该方法依赖于下文所述的关键步骤。

细胞培养与转染

由于细胞的良好状态对任何活细胞成像实验都至关重要，因此应避免使用传代次数超过11代的细胞，因为在高代次细胞中，其生长速率和转染效率会发生变化。为在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
血管紧张素 II（Ang II）	Sigma-Aldrich	A9525
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM 1x）	Gibco -ThermoFisher Scientific	11960-044	使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F2442	使用前在 37 °C 水浴中预热
青霉素-链霉素（Pen Strep）	Gibco -ThermoFisher Scientific	15140-122	使用前在 37 °C 水浴中预热
L-谷氨酰胺 200 mM（100x）	Gibco (life technologies)	25030-081	使用前在 37 °C 水浴中预热
人胚胎肾（HEK）-293 细胞	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1573	传代次数 5 - 12
Nunc Lab-Tek II 带 1.5 德国盖玻片腔室系统	Sigma-Aldrich	155409
Lipofectamine 2000 转染试剂	ThermoFisher Scientific	11668019	4 °C 保存
Opti-MEM 低血清培养基	Gibco- ThermoFisher Scientific	31985-070	使用前在 37 °C 水浴中预热
PBS 10x	Fisher BioReagents	BP3994	使用前在 37 °C 水浴中预热
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM 1x）	Gibco -ThermoFisher Scientific	31053-028	使用前在 37 °C 水浴中预热
LysoTracker Red DND-99	molecular probes -ThermoFisher Scientific	L7528	分装后避光保存于 -20 °C。
Volocity 版本 6.3 图像分析软件	PerkinElmer	可视化与定量模块	用于图像堆栈的三维图像分析
Leica SP8 AOBS	Leica Microsystems	激光扫描共聚焦显微镜	用于图像采集
Zeiss LSM 880	Carl Zeiss	激光扫描共聚焦显微镜	用于图像采集