Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per celle di immagine che esprimono fluorescenti tipo angiotensina recettori 1a proteina-tag verde durante endocitosi avviate dal trattamento angiotensina II. Questa tecnica comprende lisosomi etichettatura con un secondo marcatore fluorescente, e quindi utilizzando software per analizzare la co-localizzazione di recettori e lisosomi in tre dimensioni nel tempo.
Abstract
Live-cell imaging è usata per acquisire contemporaneamente time-lapse immagini di recettori di tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimenti intracellulari in cellule embrionali umane del rene trasfettate-293 (HEK) dopo stimolazione con angiotensina II (Ang II). Cellule HEK sono transitoriamente trasfettate con il DNA plasmide contenente AT 1a R contrassegnate con maggiore proteina fluorescente verde (EGFP). Lisosomi sono identificati con un colorante fluorescente rosso. Le immagini in diretta delle cellule vengono catturati su una scansione laser microscopio confocale dopo stimolazione Ang II e analizzati dal software in tre dimensioni (3D, voxel) nel corso del tempo. live-cell imaging consente indagini traffico recettore ed evita confonde associati con fissaggio, in particolare, la perdita o spostamento artefatti di recettori di membrana EGFP-tag. Così, come singole cellule sono tracciati nel tempo, la localizzazione subcellulare dei recettori può essere ripreso e misurato. Le immagini devono essere acquisite sufficiently rapidamente per catturare il movimento delle vescicole rapida. Tuttavia, a velocità di imaging più veloce, il numero di fotoni raccolti è ridotta. Compromessi devono essere effettuate anche nella selezione dei parametri di imaging come la dimensione voxel per ottenere velocità di esposizione. applicazioni significative di live-cell imaging sono di studiare il traffico di proteine, la migrazione, la proliferazione, ciclo cellulare, apoptosi, l'interazione autofagia e proteina-proteina e dinamiche, per citarne solo alcuni.
Introduction
L'obiettivo generale è quello di ottenere dati quantitativi nel tempo e nello spazio dei recettori colocalizzazione con specifici organelli subcellulari dopo il trattamento con un agonista del recettore. Così, l'obiettivo immediato è quello di catturare time-lapse immagini confocale di lisosomi e un transmembrana spanning recettore in cellule renali embrionali umane (HEK) dopo trasfezione e da montare successivamente e analizzare i dati di imaging in 3D per misurare quantitativamente la consegna del recettore lisosomi. Indagare il traffico simultaneo di un recettore transmembrana con i lisosomi o altri organelli durante endocitosi quando attivato dal recettore ligando può aiutare a determinare come il recettore transmembrana è regolato in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.
AT 1a R si presume essere degradato nei lisosomi dopo il trattamento con Ang II in sistemi di cellule modello, soprattutto HEK293 1, anche se la maggior parte dei receptors sono principalmente localizzate in endosomi riciclaggio multivesicular per il riciclaggio successivamente alla membrana plasmatica mentre la massa del legante, Ang II, è degradata nel lisosoma 2, 3, 4, 5. Più recentemente, Li et al. dimostrata mediante trasferimento di Förster energia di risonanza (FRET) e la fluorescenza di imaging durata microscopia (FLIM) tecniche che colocalizza AT 1a R (on ~ 10 nm scala) LAMP1, una proteina di membrana lisosomiale suggerendo che almeno una parte del recettore colpisce selettivamente e degradate da lisosomi 6. Questi autori hanno notato che la clorochina inibitore lisosomiale bloccato a 1A associazione R-LAMP1 che è coerente con le precedenti relazioni che suggeriscono che un effetto di clorochina è quello di bloccare la fusione di endosomi ritardo o autofagosomi con i lisosomi. Altri approcci indiretti per determinare a 1a R localization in lisosomi hanno utilizzato bafilomicina, un inibitore lisosomiale inferire AT 1a presenza R in lisosomi 3, 4, 5, 6, 7, 8.
live-cell imaging evita potenziali effetti di fissazione su volume cellulare, e la perdita / oscuramento / ridistribuzione dei recettori GFP-chimerico. Studi precedenti hanno invocato cellule fissate per determinare colocalizzazione o co-occorrenza del recettore con i lisosomi o usando cellule vive marcate con surrogati recettore-legante come β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. live-cell imaging di altri GPCR utilizzando confocale disco rotante o laser a scansione punto confmicroscopi Ocal dotati di Gaasp o HYD rilevatori hanno permesso ai ricercatori di osservare l'internalizzazione e la tratta dei recettori in singole cellule imaged in z-stack a 30 s intervalli 9, 10. Tuttavia, anche quando z-stack cellule vive sono rapidamente raccolti, analisi può avvenire solo dopo la selezione di un singolo piano all'interno di ciascuna pila, cioè in 2D 10. Anche se questo potrebbe essere sufficiente per studiare il GPCR o tirosin-chinasi del recettore internalizzato in questione, i Rs 1A a accumula in vescicole che cambiano dimensioni e la posizione nel tempo e, quindi, sono intrinsecamente più difficili da campionare in modo adeguato con una fetta solo rappresentante in ogni punto. Per determinare accuratamente il percorso del marcato a 1A R attraverso la cella e per rilevare ogni sottopopolazione di vescicole che differiscono in termini di dimensioni e la posizione, abbiamo messo a punto un metodo per l'imaging 3D e l'analisi 3D per tenere traccia di questi cambiamenti e di essere usato insieme con etichettatura di diversi compartimenti intracellulari come lisosomi.
Gli investigatori possono utilizzare questo protocollo per live-cell imaging di visualizzare direttamente il movimento di AT 1a R nella cella e il suo trasferimento a compartimenti subcellulari dopo stimolazione Ang II. compartimenti cellulari sono contrassegnati con chimere proteina fluorescente o altri marcatori fluorescenti. Questo protocollo può essere utilizzato anche come un primo approccio per localizzare recettori organelli subcellulari con una risoluzione minima di 200 nm per comparare mutato rispetto recettori wild-type o per rilevare modifiche seguenti trattamenti farmacologici. La tecnica è accessibile poiché può essere effettuata su ogni microscopio confocale attrezzata per live-cell imaging. La relativa facilità di questo approccio contrasta con maggiore competenza e le attrezzature necessarie per svolgere FRET / FLIM / tecniche BRET che rilevano interazioni molecolari 6,"xref"> 11. Queste misure definiscono le interazioni proteina-proteina ad alta risoluzione (~ 10 nm) e la localizzazione all'interno di organelli subcellulari è dedotto. Queste tecniche più avanzate sono utilizzate per seguire e definire ulteriormente le interazioni molecolari di interesse, piuttosto che il passaggio dei recettori attraverso compartimenti subcellulari, e dimostrano direttamente interazioni proteina-proteina in tempi e luoghi specifici all'interno della cella 11. FLIM, una tecnica FRET indipendente dalla concentrazione di accettori, viene spesso eseguita su campioni corretti dopo l'acquisizione dell'immagine è più lento. Al contrario, il rapporto FRET fornisce una rapida delle immagini e ad alta risoluzione colocalization di proteine che interagiscono. Lo svantaggio di rapporto di FRET è che l'imaging utilizza widefield epi-fluorescenza per guadagnare velocità di imaging e di includere l'intera cella, con conseguente ridotta risoluzione e contrasto degli organelli 12. trasferimento di energia di risonanza bioluminescenza (BRET) è un altrotecnica avanzata che è stato applicato al GPCRs per misurare l'acquisizione di prossimità molecolare nel tempo 11. In questa tecnica un fluoroforo proteina è molecolarmente diviso e ciascuna metà collegato ad uno dei due proteine in questione. Quando le due proteine di interesse legano tra loro, le parti del tag chimerico riassemblare acquisire fluorescenza e la maggiore fluorescenza quantificato nel tempo.
Qui vi presentiamo una tecnica semplice per l'imaging dal vivo di cellule accoppiato con immagine quantificazione di studiare il traffico di AT 1a R nella cella in seguito a stimolazione Ang II e il potenziale cambiamento nella consegna di interiorizzato a 1A R per lisosomi seguenti stimolazione Ang II. L'uso finale per questa tecnica è quello di caratterizzare le differenze di traffico di membrana confronto wild type e recettori mutati. Queste differenze aiuteranno a identificare il meccanismo (s) che hanno un impatto le attività fisiologiche di AT 1a R leading di regolazione della pressione sanguigna.
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Protocol
Giorno uno
1. cellulare Semina
- Preparare completa di Dulbecco modificato (DMEM). Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml di L-glutammina a 450 ml di DMEM per ottenere 500 ml di DMEM completo addizionato con siero fetale bovino (10%), penicillina / streptomicina (1%) e L-glutammina (1%).
- umane embrionali renali (HEK), le cellule di semi, numero passaggio 6-11 a 50.000 / bene in un sistema di 8 coprioggetti ben camerata in DMEM completo.
- Mantenere il vetrino a camera a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 24 h.
Secondo giorno
2. liposomi Trasfezione
- Appena fare AT soluzioni plasmidi e liposomi 1a R-GFP usando condizioni sterili con un armadietto livello di biosicurezza 2.
- Diluire 2 ml di DNA plasmide a 900 ng / ml soluzione madre in 178 ml di mezzi siero ridotto per ottenere un concentratione di plasmide DNA di circa 10 ng / ml.
- Diluire 4,5 ml di soluzione di liposomi magazzino a 175,5 ml di mezzi siero ridotto di creare una diluizione 1:40 dello stock.
- Aggiungere la soluzione liposomi alla soluzione plasmide e mescolare utilizzando una pipetta 1 mL di pipetta su e giù 20 volte per miscelare la soluzione di trasfezione.
- Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente (25-27 ° C).
- Mentre questa miscela è in incubazione, rimuovere il supporto lentamente con un mL pipetta 1 e aggiungere lentamente 400 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), che è pre-riscaldato a 37 ° C.
- Rimuovere delicatamente la PBS e sostituirlo con 200 ml / pozzetto di riduzione dei media siero pre-riscaldato a 37 ° C.
NOTA: prestare attenzione a tutte le fasi quando si lava le cellule per evitare il distacco delle cellule dal vetrino a causa di pura stress indotto pipettando. - Mantenere le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 30 min.
- Una volta che ilperiodo di incubazione è finita, aggiungere 80 ml di miscela di trasfezione ad ogni pozzetto e incubare le cellule per 4,0-4,5 h ma non più di 5 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2.
- Dopo il periodo di trasfezione incubazione, rimuovere lentamente il supporto dalle camere con una mL pipetta 1 e sostituire delicatamente con 300 microlitri / pozzetto di DMEM completo e incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 .
Giorno tre
3. Siero fame
- Rimuovere il supporto delicatamente con una pipetta mL 1 e sostituire lentamente con 300 ml di DMEM senza siero, senza rosso fenolo.
- Mantenere la camera a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 10-12 h.
Quarto giorno
4. Imaging Live Cell
- Compartimenti intracellulari Stain (lisosomi in questo caso).
- About 30 minuti prima di imaging lisosomi delle cellule, aggiungere 22,5 ml da un colorante fluorescente soluzione stock 1 micron (0,5 ml di 1 mm colorante fluorescente diluito in 499,5 ml di DMEM senza siero senza rosso fenolo) in ogni pozzetto per una concentrazione di colorante finale di 75 nM.
- Incubare per 25-30 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 e quindi rimuovere delicatamente il colorante e aggiungere lentamente 300 ml di DMEM fresco senza siero, senza rosso fenolo.
- Preparare il microscopio per l'imaging.
- Regolare la fase giù per evitare danni alla lente durante l'avvio di un microscopio automatizzato.
- Accendere microscopio, alimentazione dello scanner, potenza del laser e poi emissione laser, e infine la lampada ad alogenuri metallici per l'osservazione visuale (vedi confocale istruzioni del fabbricante microscopio).
- Aprire il programma software di imaging e nel turno software sul argon (488 nm) laser e potenza fino a 30-50%. Nota la potenza dipende daetà del laser. All'interno di esperimenti è fondamentale per mantenere le impostazioni costanti.
- Accendere laser rosso-emissioni (ad esempio 568 nm o 594 nm).
- Set formato di imaging per la profondità a 12 bit.
- Impostare il foro stenopeico per la linea di laser ad argon 488 nm e per la 568 nm o 594 nm laser per 1 unità disco di Airy. Se la GFP è molto debole, utilizzare un ambiente di 2 unità disco di Airy, ma abbinare i canali in modo appropriato.
- Quando si utilizza set di filtri dicroici, selezionare le lunghezze d'onda di emissione adeguati per GFP e il colorante fluorescente. In alternativa, impostare la lunghezza d'onda di emissione (Em) a 499-580 nm per la GFP e Em 599-680 nm per il colorante fluorescente rosso luminescente.
- Controllare che sanguinano attraverso e incrociato non si verificano. Spegnere ogni laser a sua volta e controllare entrambi i canali di emissione per ciascuna. Quando il laser ad argon è spento, l'emissione verde dovrebbe essere pari a zero. Quando il laser che emette verde è spento, il canale di emissione rosso dovrebbe essere zero.
NOTA: Il metodo più sicuro è quello di un'immagine ogni a tracce separate (Sequziale). - Includere un canale in campo chiaro se lo si desidera. Evitare di imaging contrasto differenziale (DIC), perché può inclinare misure colocalizzazione.
- Per l'imaging dal vivo, selezionare la linea sequenziale anziché cornice sequenziale.
- Selezionare le celle per l'imaging.
- Utilizzare un obiettivo 1.4 apertura numerica (NA), ad esempio un obiettivo 63X / 1.4 NA olio per celle di immagine (o 40X / 1.4 NA). Centrare l'obiettivo e aggiungere una goccia di alta viscosità, l'olio a bassa autofluorescenza di immersione sul oggettiva.
- Trasferire la camera con le cellule transfettate dal termostato alla fase del microscopio. Fare attenzione a tenere le diapositive piatto e accertare che la camera è ben posizionato e trattenuto dal movimento.
- Spostare l'obiettivo fino alla goccia di olio sfiori la parte inferiore della slitta; il piano focale destra è vicino a questa posizione. In microscopi automatici, salvare questa posizione così come la posizione abbassata da utilizzare per la remainder dell'esperimento di imaging per facilitare cambiando campioni.
- Scegli cellule dim. Le cellule overexpressing a 1A R-GFP saranno sviare il recettore nella cellula e disturbare la normale funzione.
- Verificare che il contorno della cella, definita dalla membrana plasmatica, è visibile e preferibilmente non sovrapposizione con altre cellule.
- Primo e centrare la cella nel campo visivo.
- Passa alla modalità confocale.
- Selezionare una modalità di imaging veloce. Con una mano sul controllo del fuoco e l'altra sul controllo XY fase mirare e centrare la cella di interesse visualizzata sul monitor.
- Verificare che la cella di interesse è ben diffuso e il suo lato inferiore o ventrale giustapposta a stretto contatto con il vetrino, concentrandosi su e giù attraverso la cella.
- Impostare i parametri Z-stage a un'immagine cellulari in 3D.
- Selezionare il pulsante di accensione per il top Z-stack e finestra inferiore (o equivalente) e concentrarsi sul fondo del cell quindi premere "iniziare". Poi, si concentrano per la parte superiore della cella e premere "fine". Ricontrollare che l'intera cella è incluso nel z-stack.
- Impostare la dimensione Z-passo a 1.0 micron.
- Impostazioni di imaging SET.
- Selezionare Zoom 2, a seconda della lente, in modo che la dimensione finale del pixel è circa 0,279 um x 0.279 micron a 0,14 micron x 0,14 micron nella dimensione XY.
- Per le cellule HEK in questo esperimento, impostare la velocità di scansione di circa 1 microsecondo per voxel e selezionare 2 media o 2 accumuli di linea, a seconda della luminosità delle cellule.
- Regolare intensità del laser e di ottenere per l'imaging GFP e il colorante fluorescente. In generale, controcolorazioni sarà molto più luminoso e quindi Fotomoltiplicatore rivelatore (PMT) e non fosfuro di gallio arseniuro (Gaasp) o rivelatori ibridi (HYD) dovrebbe essere utilizzato per questo secondo canale di colore che sono necessarie GASP e HYD rilevatori per il canale GFP. Se il hyd o Gaasp rilevanoors sono utilizzati per il colorante fluorescente, esercitare cautela e inizia con il laser ad una potenza estremamente bassa.
- Impostare durata della scansione e frequenza di scansione, ad esempio, ogni 30-60 s oltre 25 min o più per vedere il targeting di AT 1a R-GFP ai lisosomi.
- Impostare la messa a fuoco automatica per mantenere la stabilità sul piano focale nel tempo.
- Iniziare l'esperimento di imaging.
- Preparare in anticipo 100x Ang II stock a 5 mg / mL (4,7793 mM) e aggiungere 2,1 ml di questo per 998 ml di media (10 micron).
- Iniziare la stimolazione ligando con l'aggiunta di 3 ml di una soluzione stock 100x di ligando (Ang II) per pozzetto contenente 300 microlitri immediatamente prima di imaging (concentrazione finale 100 nM).
- Fare clic su Start e l'immagine in 3D per il tempo e frequenza desiderata.
- Prima di concludere il lavoro al microscopio, raccogliere un z-stack per un uso successivo in sottrazione del fondo durante l'analisi. In modalità di conteggio di fotoni, questo non ènecessario poiché lo sfondo è essenzialmente 0. illuminazione acceso e tutte le altre condizioni di imaging stesso, ma nessun campione prendere un'immagine campione. Vedere sottrazione del fondo (sotto) in analisi.
Quinto giorno
Analisi 5. Immagine
- Esportare le immagini in formato TIFF.
- Fare clic destro sul nome del file immagine per vedere i menu e selezionare Esporta o fare clic su File | Export | importare.
- Esporta in TIFF per analisi successive avendo cura di esportare il RAW, dati a 12 bit [non il 'Rosso Blu Verde' (RGB) di conversione utilizzato per immagini di qualità pubblicazione]. Non esportare in formato jpeg.
- Notare la X, Y, Z dimensioni voxel e la dimensione z-passo per un uso successivo durante l'analisi dell'immagine. Ad esempio, utilizzando un 40X / 1.4. NA obiettivo da questi valori potrebbero essere 0.138 micron x 0,138 micron con 1 micron dimensione z-passo (vedi dati nella sezione Risultati rappresentativi).
- <strong> Crea serie di immagini per l'analisi.
- Apri immagine del software di quantizzazione (Figura 2)
- Utilizzare "Azione | Create New | Immagini dalla sequenza selezionata" per generare una singola immagine file da sequenze importati singoli (figura 2, freccia 1 #).
- Inserire il numero di canali, il numero di z-sezioni, e il numero di punti temporali.
- A seconda della struttura dei file TIFF *, selezionare, per esempio, canali, piano z, e punti temporali come l'ordine dei piani dell'immagine. Controllare che la risma immagine finale rappresenta correttamente i canali di colore, z-stack, e punti temporali dell'immagine originale.
- Selezionare il nome dell'immagine (Figura 2, ha evidenziato il nome del file a sinistra, freccia # 2). Fare clic destro sull'immagine e / o il campo immagine, quindi una delle opzioni in fondo alla lista selezionare "Proprietà". Nel pixel micron per (X) (Y) e (Z) formato, inserire le proprietà dell'immagine corretti osservato in precedenza.
- Sfondo Sottrarre prima analisi delle immagini. Correzione del fondo può essere realizzato in qualsiasi software di analisi delle immagini. Sottrarre sfondo utilizzando una delle due opzioni.
- Opzione 1: Selezionare "Azione | Crea nuovo | sottrazione dello sfondo" (figura 2, freccia # 1). Utilizzare l'immagine di sfondo acquisita ottenuto al termine della sessione di imaging descritto come il "Dark riferimento" immagine sotto "Strumenti | Sottrarre Sfondo".
- Opzione 2: Controllare le aree più scure nelle immagini in cui vi è nessun campione, trovare la media o massima luminosità di pixel in quella regione, ignorando eventuali pixel insolitamente brillanti che potrebbero essere fluoroforo spuria, un pixel in modo casuale brillante, o qualche altro fenomeno. Selezionare "Azioni | Crea nuovo | sottrazione del fondo". Utilizzare questa luminosità dei pixel (fatto negativo) come offset.
- Verificare la registrazione colore e correggere se necessario.
- Generare una correzione della registrazione selezionando "Azioni | Crea Nuovo | correzione della registrazione" (figura 2, freccia # 1) e utilizzare la finestra di dialogo per effettuare le regolazioni. Al termine di un nuovo elemento cartella apparirà dal titolo "correzione della registrazione".
- Applicare la registrazione di una o più delle immagini di interesse facendo clic sul nome dell'immagine (Figura 2, ha evidenziato il nome del file a sinistra, freccia # 2) e quindi selezionando "Strumenti | corretta registrazione" (pulsante strumento adiacente Azioni).
- Selezionare un'immagine (Figura 2, ha evidenziato il nome del file a sinistra, freccia # 2) e disegnare una regione di interesse (ROI) intorno ad una singola cella usando lo strumento freestyle regione (figura 2, freccia 3 #). Utilizzare la modalità di messa a fuoco estesa (2D, menu a discesa in alto a sinistra) per osservare il cellulare come strumento di ritaglio funziona solo in visualizzazione 2D.
- Fare clic destro sull'immagine e selezionare "Ritaglia" e un nuovo elemento immagine viene generata.
- Selezionare la cella ritagliata facendo clic sul suo nome e quindi selezionare la scheda "Misura" di cui sopra (figura 2, freccia # 4).
- Per definire e misurare vescicole interiorizzato per GFP, trascinare "Trova gli oggetti" in "Finding" (figura 2, freccia 5 #) nella casella di sequenza (figura 2, freccia # 6).
- Impostare "Trova oggetti" Canale al canale GFP.
- impostazioni aperte (icona ruota finestra di dialogo, freccia # 6) e impostare4; Soglia utilizzando: "per SD e" limite inferiore "a 6. Set" Dimensione minima oggetto "da 0 micron 3.
NOTA: Il limite inferiore SD dipenderà singoli esperimenti. Conferma visiva che gli oggetti corretti thresholded è fatta esaminando diversi intervalli di tempo (figura 2, freccia 7 #). La "Misura | Commenti Opzioni" finestra di dialogo permette di scegliere il modo in cui oggetti selezionati thresholded vengono visualizzate (Figura 2, freccia # 8). - Fai clic su "misura" nella finestra di dialogo "Trova oggetti" (Figura 2 freccia # 6) e selezionare i canali e il tipo di misura. In genere, selezionare "Tutti i canali" e "intensità e volume misurazioni".
- Per definire la soglia e filtri per l'identificazione di tutto il cellulare e per misurare l'intensità totale GFP, ripetere i passaggi precedenti (5.5.4 - 5.5.8) utilizzando i seguenti parametri: SD 0 e "Dimensione minima oggetto" per 2 μ; m 3 nella seconda finestra di dialogo "Trova gli oggetti" per identificare le cellule che utilizzano GFP (figura 2, freccia 9 #)
- Trascinare "Filtro Popolazione" sotto "Filtro" per la casella di sequenza sotto popolazione 2 (la seconda casella "Trova oggetti", figura 2, freccia # 9). Selezionare "Volume (micron 3> 100).
- Visivamente garantire che solo un oggetto viene identificato. L'intera cella deve essere thresholded e tutti gli altri oggetti filtrato via. Il parametro "Filtro" (s) potrebbe essere necessario aggiustamento se la cella è piccola, per esempio.
- Una volta che la misurazione è stato standardizzato, salvare il protocollo facendo clic destro sull'immagine e selezionate "Salva Protocol" al fine di riutilizzare ( "Restore protocollo"). Il protocollo può essere esportato anche a fornire una registrazione nella stessa sottodirectory come immagine.
- Passare a "Fai la misura" selezionando "Misure | Fai la voce di misura" (Figura 2
- Inserire il nome misura corretta (copia incolla dall'immagine è conveniente) e il codice di analisi o la data (un'aggiunta utile per la tenuta dei registri) e selezionare "tutti i momenti". Un nuovo elemento foglio verrà creata sotto l'immagine. Mantenere i nomi dei file concisa.
- Fare clic sul nome del file foglio di lavoro e selezionare la scheda "Analizza". Determinare se voxel saturi sono presenti in primo luogo selezionando "Limitare l'analisi per:" selezionare Popolazione 2 (la cella).
- Fare clic destro del campo sotto la scheda "Analizza" e nella finestra di dialogo sotto "Analizzare questi dati:" selezionare "Max ([canale di colore GFP])"; sotto "Riepilogate per:" selezionare "Media ([canale di colore GFP]" e sotto "organizzare i dati per:" e "riga" selezionare "timepoint" e click "OK".
NOTA: Se i dati contiene pixel saturi (ad esempio 65.536 per 16-bit o 4.096 per 12-bit), l'analisi non sarà accurata (sarà sottovalutare il contenuto delle vescicole). Ignorare quella cella per l'analisi. Se non è saturo, passare alla fase successiva. - Successivamente, nella scheda "Raw" e poi nella scheda "Analisi" e tasto destro del mouse i dati trovano "Limita Analisi a:", quindi selezionare Popolazione 1 per vescicole o Popolazione 2 per tutta la cella.
- In "Analizzare questi dati:" selezionare "Sum" (canale del colore GFP); sotto "riassunto da:" selezionare "Somma"; e, sotto "organizzare i dati per:" e "riga" selezionare "timepoint" o "Time relativa" e quindi fare clic su "OK". selezioni di analisi possono essere salvate e riutilizzate.
- Selezionare e copiare / incollare direttamente dal software di immagine quantificazione di un foglio di calcolo vuoto o esportare i dati del foglio di calcolo facendo clic destro del datuna e selezionando Salva come file .csv. La misura intera intensità cella sarà incluso con le misurazioni di ogni vescicole nella popolazione in modo da essere sicuri di individuare e separarlo dalle vescicole.
NOTA: Dopo aver tracciato i dati, l'aumento totale della fluorescenza GFP contenuta in vescicole sale rapidamente. Photobleaching, se si verifica, viene rilevato come perdita di intensità totale GFP cellule nel tempo.
- Nei Trova gli oggetti (popolazione 1), impostare "Trova gli oggetti" di canale per il canale rosso e l'icona della ruota all'interno di tale finestra di dialogo indicato dalla freccia # 6 (figura 2) set "Soglia utilizzando:" per SD e "limite inferiore" a 6. Impostare "dimensione minima oggetto" a 0,017 micron 3.
NOTA: Il limite inferiore SD dipenderà singoli esperimenti. conferma visiva che gli oggetti corretti vengono thresholded dovrebbe essere fatta da esamevorazio diversi punti di tempo. La "Misura | Commenti Opzioni" finestra di dialogo permette di scegliere il modo in cui oggetti selezionati thresholded vengono visualizzate (Figura 2, freccia # 8). - Fare clic su "misura" in "Trova" Oggetti "finestra di dialogo (Figura 2 freccia # 6) e selezionare i canali ei tipi di misure. In genere," vengono selezionati tutti i canali "e" intensità e volume misurazioni ".
- Per la popolazione 2, le impostazioni di uso identico a quello utilizzato per identificare l'intera cellula transfettate che esprimono a 1A R-GFP (5.5.9).
- Se più cellule (incluse le cellule untransfected con vescicole dye-positivo fluorescenti) sono presenti, il ritaglio della cella nella prima fase di analisi è critica. In alternativa, l'uso di "compartmentalize" dovrebbe essere utilizzato per limitare l'identificazione dei lisosomi all'interno della cellula transfettate che esprimono AT 1a R-GFP. I lisosomi deve essere identificato solo all'interno della cellula GFP eNon da vicino, le cellule untransfected.
- Analizzare ed esportare dati come sopra.
NOTA: Un esempio di cellule thresholded e vescicole è mostrato in figura 4.
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Representative Results
In questo insieme rappresentativo di esperimenti, cellule HEK sono state trasfettate con il recettore dell'angiotensina di tipo 1a (AT 1a R-GFP) costruire (E1,2,3-AT 1a R) clonato nel plasmide pEGFP-N2 13. Time-lapse immagini di HEK sono stati acquisiti e giocato come un film (Vedi Cellulare Imaging 1 e imaging cellulare dal vivo 2 film). I filmati e le immagini fisse mostrano che dopo stimolazione ligando, a 1A R EGFPs sono localizzati prevalentemente nella membrana plasmatica, ma con l'aggiunta di Ang II questi recettori diventano interiorizzato all'interno di 2.5 min a formare vescicole luminose e in tempi successivi si raggruppano in vescicole più grandi una zona perinucleare (figure 4B, 5, e 6A; cellulare Imaging 2).
Quantificazione di intensità GFP cellulare totale e l'intensità totale della vescicola GFP per la cella in figura 5 provide un'illustrazione delle complicazioni inerenti quando Ang II induce scompigliava e cambiamenti di forma delle cellule immediatamente dopo la stimolazione (Figura 5A, freccia 0 min post-Ang II, riga superiore, arancione indica gli oggetti della soglia). In tempi più recenti, la localizzazione delle vescicole GFP contenenti in un cluster perinucleare interferisce anche (Figura 5A, freccia rossa a 29,5 min). Anche se tutti gli oggetti dovrebbero essere inclusi nella misurazione totale intensità GFP delle cellule, le balze dovrebbero essere esclusi dalle misure vescicole perché rappresentano membrana plasmatica a 1A R-GFP. Al contrario, le vescicole perinucleari cluster non dovrebbero essere esclusi dalla misura vescicole (questi ultimi sono visti in una zona della cella racchiuso in cerchi rossi nella figura 5a, freccia a 29,5 min post-Ang II, riga inferiore). I tentativi di ottenere questo risultato filtraggio dimensioni (superiore o inferiore a 7 micron 3) non è stato utile in quanto non potrebbe discriminare volant e cluster vesicles (figure 5A e 5B, confrontare Filtro> 7, filtri <7, e nessun filtro). Una possibile alternativa sarebbe disegnare un regioni di interesse (ROI) comprendente la porzione citoplasmatica della cellula ma escludendo il bordo ruffling e il perimetro della cella. In definitiva, questo cellulare non sarebbe stato incluso nei risultati quantitativi, perché ci erano saturi pixel di GFP presente.
Un secondo esempio rappresentativo è mostrato in Figura 6A illustra un corso di tempo in cui l'autofocus non è stato utilizzato. La GFP interiorizzato è indicato come percentuale totale GFP cellulare (Figura 6B). I punti di tempo prima della freccia rossa a 3 min sono fuorvianti come solo parte della cellula era in volume di imaging ma 3 min dopo Ang II Inoltre, il piano focale restabilized. La GFP totale all'interno della cellula dimostra che questo cellulare non ha photobleach sensibilmente nel tempo (Figura 6C ). Tra il 3 e circa 12 min, per cento GFP intensità in vescicole aumenta poi in piano (figura 6b). Successivamente, lisosomi individuati dal colorante fluorescente sono stati usati per identificare ROI all'interno di una cellula trasfettata che poi venivano quantificati per la somma di intensità GFP (Figura 6D). Dopo tre minuti, l'intensità del AT 1a R-GFP in lisosomi rosso-identificato non varia nel tempo (Figura 3D, n = 5, media ± errore standard della media). Quindi non vi è alcun aumento rilevabile nella consegna di AT 1a R-GFP ai lisosomi per un massimo di 24 minuti dopo la somministrazione Ang II.
Figura 1: saturi Pixel identificata in una tabella di ricerca (LUT). La freccia rossa indica pixel saturi mostrati in blu.t = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica dei Immagine Quantificazione Software. gli elementi chiave sono indicate da numeri e discusse nel testo metodi. 1) oggetto di azione, immagine 2) selezionati, 3) strumento ROI a mano libera, 4) scheda Misurazioni, 5) Trovare oggetti, 6) della popolazione 1 Trova gli oggetti della finestra di dialogo, 7) Freccia attivando tempo di film lasso, 8) Misure voce, 9) una seconda Trova gli oggetti finestra di dialogo con un comando Filtro popolazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il colore di correzione della registrazione. Le immagini con non corretta eregistrazione dei pixel corretti sono mostrati insieme con inserti di diversi vescicole colocalizing contenenti 1a R-GFP. I pixel rossi sono spostati di 1 pixel verso sinistra nel piano XY dell'immagine corretta. Riquadri mostrano le zone in scatola a maggiore ingrandimento. Scala bar = 3,3 micron, dimensioni voxel = 0,138 x 0,138 x 1 micron 3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'illustrazione di Soglia per identificare GFP e colorante fluorescente contenenti vescicole e GFP-cellule intere. (A) Identificazione di cellule intere con AT 1a R-GFP (GFP, riga superiore) e thresholded GFP per tutta la cella (Cell ID, fila in basso) sono mostrati a 0 e 2,5 minuti dopo l'Ang II aggiunta. Scatole bianche indicano insaree et mostrati in (B) e (C). (B) a 1A R-GFP sono confrontati a 0 e 2. 5 minuti dopo Ang II, oltre a immagini a colori singoli (riga superiore). Le vescicole identificati da soglia vengono visualizzati nella riga inferiore (ID Ves, viola). (C) le immagini a due colori (AT colorante 1a R-GFP / fluorescente) sono mostrati a 0 e 2,5 min dopo Ang II aggiunta. Lisosomi identificate da thresholding sono indicate da linee rosse. Scala bar = 7,0 micron, dimensioni voxel = 0,114 x 0,114 x 1,4 micron 3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'illustrazione degli effetti di increspature e cluster vescicole sulla misura della interiorizzato GFP recettori. (A) A T 1a R-GFP in Ang II trattata cellule a 0 (riga superiore) e 2,5 min (fila inferiore) sono mostrati in tre esperimenti filtraggio dove nella prima colonna è stato applicato un filtro per selezionare solo oggetti superiore a 7 micron 3, in seconda colonna per selezionare gli oggetti meno 7 micron 3, e nella terza colonna è stato utilizzato nessun filtro. livello Thresholding è stato costante in tutti e tre. Le frecce indicano oggetti di grandi dimensioni thresholded, cerchi indicano una superficie di citoplasma contenente vescicole perinucleari in momenti successivi. aree thresholded sono di colore arancione. (B) Quantificazione di intensità totale GFP in vescicole sono presentati aree thresholded con o senza filtraggio dimensioni (per colonna in A) in due punti temporali (per riga in A). Dimensioni Voxel erano 0,138 x 0,138 x 1 micron 3. Barra di scala = 5,6 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Monitoraggio AT1 un R- GFP internalizzazione e localizzazione potenziale nei lisosomi. (A) Cinque punti di tempo selezionati di AT 1a R-GFP con LysoTracker rosso sono mostrati dal film di accompagnamento (imaging cellulare dal vivo 1 film) a 0, 3, 6, 9, e 12 minuti dopo Ang II. La griglia costituisce la scala in unità di 6,56 micron 3, dimensioni voxel erano 0,297 x 0,297 x 1,2 micron 3, e z-step = 1.2 micron. (B) Un grafico della percentuale GFP totale in vescicole nel tempo illustra la rapida internalizzazione di AT 1a R-GFP. (C) Un grafico della GFP totale nella cella nel tempo dimostra che relativamente poco photobleaching avvenuto durante 24 min di imaging. (D) I lisosomi sono stati identificati attraverso l'individuazione LysoTracker vescicole Red-positivi. L'intensità GFP totale entro fluorescente dye-positivo vescicole ROI è stata misurata in ogni momento (normalizzato al primo punto volta senza compensazione per photobleaching che non è stato misurato in modo indipendente). (C - D) Prima della freccia, le misure non sono validi dal momento che l'attenzione si è spostata. N = 5, media ± errore standard della media. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1: Cellulare Imaging 1: (clic destro per il download) delle cellule HEK trasfettate con AT 1a R-GFP è stato ripreso ogni 1 min per 24 min (25 fotogrammi) dopo l'aggiunta di 100 nm Ang II. Film è stato acquisito utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un piano-Apochroma 63X / 1.4 obiettivo olio NA, le dimensioni voxel di 0,279 x 0,279 x 1,2 micron 3; e 5 fette per un totale di 4,794 micron di spessore ripreso a 3,20 ms / pixel. Il tasso di film è di 2 immagini / s. Unità = 6.56 micron.
Movie 2: Cellulare Imaging 2: (clic destro per il download) delle cellule HEK trasfettate con AT 1a R-GFP è stato ripreso ogni 30 s per 25 min (51 fotogrammi) dopo l'aggiunta di 100 nm Ang II. Film è stato acquisito utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un 40X / 1.4 obiettivo olio NA Plan-Apochromat. Dimensioni Voxel erano 0,11 x 0,11 x 1,4 micron 3. 7 fette per un totale di 8,4 micron di spessore sono stati ripresi a 3.72 s / telaio. Il tasso di film è di 3 fotogrammi / s. Barra di scala = 7 micron.
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Discussion
Esperimenti preliminari qui presentati mostrano che nel corso di un piuttosto breve corso di tempo di 24 min, senza modificare sensibilmente la consegna di AT 1a R-GFP ai lisosomi si è verificato. In generale, la consegna dei recettori internalizzati ai lisosomi potrebbe verificarsi già 15-20 min. Questo esperimento è coerente con l'ipotesi che la maggior parte del interiorizzato a 1A R si rivolge a grandi, endosomi perinucleari. La prova che almeno alcuni AT 1a R arriva in lisosomi è stata dimostrata da Li et al. , Che ha confrontato le cellule a 5 min e 30 min dopo il trattamento Ang II ed è risultato significativo colocalization di LAMPADA1 con AT 1a R a 30, ma non 5 min 6.
Questo documento fornisce una descrizione dettagliata della preparazione cellulare, immagini, e fasi di analisi e discute le molte insidie insite in questa tecnica di imaging avanzate. Questo metodo dipende fasi critiche discussi qui di seguito.
Dal momento che la buona salute delle cellule è fondamentale per qualsiasi esperimento di imaging cellulare dal vivo, è importante evitare l'uso di cellule al di là di passaggio 11 a causa delle variazioni nei tassi di crescita e l'efficienza di trasfezione a passaggi più alti. Per mantenere le cellule sane durante l'esperimento, il periodo di incubazione della miscela trasfezione con cellule non dovrebbe superare 5 h dal soluzione liposomi è tossico per le cellule evidenziato da un aumento blebbing membrana. Temperatura, umidità e controllo CO 2 è significativo sia prima che durante l'imaging. Derive di temperatura durante l'imaging possono causare relativamente grandi derive z-sezione e la perdita di stabilità piano focale. Quindi cautela è raccomandato durante aggiunta di Ang II alle cellule durante l'imaging per garantire che il piano focale è accuratamente mantenuto.
Imaging
Un vantaggio di live-cell imaging oltre immunoistochimica utilizzando cellule fissi èche le condizioni in vivo possono essere strettamente controllate e artefatti associati alle celle fisse possono essere evitati. Tuttavia, live-cell imaging può essere difficile da ottimizzare per i processi cellulari che sono estremamente rapidi, come internalizzazione recettoriale. velocità strumento e la necessità di evitare photobleaching limite la scelta di eventi che possono essere studiate. Ogni esperimento di imaging potrebbe richiedere alcune scelte da compiere in alcuni parametri e compromessi in altri; esempi sono scelte in termini di dimensioni dei pixel, l'accumulo di linea, fattore di zoom, e velocità di scansione per ottenere dati di buona qualità per l'analisi ed evitare sovracampionamento allo stesso tempo. decisioni critiche in questi fattori dipendono equilibrare la necessità di ottenere un'adeguata dimensione dei pixel per distinguere i singoli vescicole e la necessità di ottenere risoluzione temporale sufficiente degli eventi che si verificano. Così alcuni compromessi devono essere effettuati al fine di acquisire informazioni sufficienti rapidamente la cellula comincia a internalizzare recettore GFP-etichettata. Nel nostrocaso, anche se moderni software confocale può suggerire la dimensione ottimale dei pixel, i nostri esperimenti utilizzato un valore inferiore alla dimensione dei pixel ottimale secondo l'equazione Nyquist 14. scelte ottimali di impostazioni per altri esperimenti dipenderà anche da come brillante le cellule sono in quanto più grande dimensione dei pixel consentirà l'accumulo più rapido di fotoni permettendo un compromesso con più tempo voxel di sosta per raccogliere più fotoni.
Per l'analisi per avere successo, il live-cell imaging richiede anche criticamente accurata stabilizzazione focale durante il time-lapse imaging. spostamenti focali così come il fallimento di immagine l'intera cella possono avere impatto profondo sulla quantificazione del recettore internalizzazione così come intensità totale GFP cellulare. La soluzione a questo problema di turni focali durante primi momenti dell'imaging seguito l'aggiunta di Ang II è stata fornita dai produttori confocale in forma di soluzioni autofocus cui interferom vetrinoetria con un laser a infrarossi accoppiato con un feedback di controllo del fuoco automatica viene utilizzato per mantenere relativa distanza dall'obiettivo alla superficie coprioggetto identificato dalla riflessione IR (Focus esempio definita o Adaptive Control Focus). Il problema rimanente del microscopista è quindi individuare la corretta z-range in modo che, nonostante cambiamenti di forma, l'intera cella rimane nel volume di imaging. Temperatura è un altro fattore critico per mantenere la posizione del fuoco / Z durante punti temporali iniziali dopo aggiunta di Ang II. La temperatura dell'obiettivo, nonche la camera di imaging cellulare dal vivo devono essere mantenuti a 37 ° C per tutto l'esperimento.
Un altro componente fondamentale delle immagini, è l'acquisizione di immagini quantitativamente. Se un rivelatore HYD viene utilizzato nella modalità di conteggio Photon, i parametri di imaging devono essere impostati in modo che fotone pileup non si verifica. Per PMT e altri rivelatori, le immagini non devono contenere pixel saturi (voxel). In entrambi i casi, una spelizzata look-up table (LUT) può essere utilizzato per visualizzare la presenza di pixel saturi e naturalmente se presenti, microscopista dovrebbe ridurre l'intensità del laser e / o il guadagno.
Analisi
Sebbene l'approccio qui descritto è applicato al recettore 1a R e la sua colocalizzazione con i lisosomi, è applicabile agli esperimenti in cui la quantità relativa del recettore in compartimenti subcellulari etichettati con vari tag fluorescenti è in questione. Se l'obiettivo è quello di misurare se i recettori si sposta al organello, quindi utilizzando il coefficiente colocalization di un Pearson con un pennarello per l'organello è problematico. Ogni pixel in cui viene identificato l'organello avrà una quantità elevata del marcatore in modo che uno dei coefficienti saranno sempre vicino al 100%. Così, le misurazioni colocalizzazione potrebbero essere fuorvianti. D'altra parte, misurando la percentuale di recettore sulla organello rispetto totale della recepTor è molto più informativo e più chiara da interpretare. Un caso in cui la proteina colocalizzazione potrebbe essere meglio descritto utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson sarebbe al recettore R 1a e LAMP1 la cui interazione è stata documentata, anche se con un più sofisticato approccio co-localizzazione, cioè FLIM / FRET 6.
L'uso di immagini 3D è più preciso rispetto all'utilizzo di fette rappresentativi di cellule con analisi in 2D a causa di movimenti cellulari che sono inevitabili nel corso tempo (Imaging Live 2 film). E 'chiaro dalle immagini in diretta di cellule mostrati nelle figure 3, 4B e 5A che il recettore è localizzata principalmente a livello della membrana plasmatica, però, nel giro di pochi minuti di esposizione ad Ang II si localizza a punti luminosi sulla membrana e piccoli vescicole adiacente alla membrana, pozzi probabilmente rivestiti e endosomi precoci (figure 4B 4C). Continuando progressione del tempo, le vescicole si muovono attraverso la cella accumulo in vescicole grandi adiacenti al nucleo che sono stati descritti come endosomi multivesicular (MVEs, figure 1, 5A) 3, 15. Una sola fetta attraverso la cella nel tempo sarebbe distorcere il processo di interiorizzazione e travisare i veri eventi in particolare se la fetta non ha incluso la superficie cellulare a primi tempi, e le MVEs in tempi successivi.
In questo studio, due approcci per l'analisi delle immagini possono minimizzare effetti di photobleaching di GFP e colorante fluorescente sul risultato quantitativo. Come cellule photobleach (anche se in misura limitata), la luminosità relativa di vescicole internalizzate relativi all'intero intensità cella viene mantenuta, assumendo photobleaching avviene uniformemente. Fluorescenti vescicole dye-positivi sono anche facilmente identificati selezionando l'deviatio di serien dell'opzione intensità della fluorescenza media per thresholding vescicole internalizzate luminosi. Questo li distingue da sfondo anche come l'intero livello di cali di fluorescenza. Così, le nostre misurazioni non erano sensibili agli effetti di modesto photobleaching. Tuttavia, la forte perdita photobleaching come il 50% dell'intensità di cellule nel tempo potrebbe avere un impatto maggiore sui risultati quantitativi. In alternativa, gli effetti di fotoscolorimento potrebbe essere misurata indipendentemente in esperimenti di controllo assenti Ang II nel caso di AT 1a R-GFP o in cellule untransfected adiacenti in caso di coloranti fluorescenti. Gli effetti di photobleaching potrebbero quindi essere presi in durante l'analisi.
Le preoccupazioni aggiuntive
Recentemente, biologi cellulari hanno condotto valutazione critica e la modifica delle proteine fluorescenti per il monitoraggio del traffico di membrana delle cellule per evitare artefatti generati dalla proteina fluorescente in sé, indipendentemente dal bein proteineg tag. Varie proteine fluorescenti sono vulnerabili alle interazioni con il microambiente locale che conduce a precipitazione delle proteine o reticolazione basato su loro pKa di e presenza della cisteina, rispettivamente 16. Un altro risultato di queste interazioni possono includere perdita di fluorescenza 16. Tutti questi manufatti influire sulle misurazioni quantitative della tratta. Costantini et al. hanno generato proteine fluorescenti monomeriche per l'imaging che mancano cisteina per eliminare potenziali artefatti 16. Pertanto, a seconda della obiettivo degli esperimenti di imaging, il passaggio da EGFP (non monomerica) ad un monomerico, forma libera-cisteina sarebbe vantaggioso per studi di microambienti vescicolari acidi e / o riducenti. Un altro esempio potrebbe essere il loro migliore utility per FRAP o pensare esperimenti in cui multimerizzazione e reticolazione avrebbe un impatto di diffusione delle proteine e le interazioni proteina-proteina.
Un altro potenziale artefatto da considerare quando l'imaging lisosomi utilizza LysoTracker rosso insieme con proteine di fusione GFP è che LysoTracker rosso ha dimostrato di essere in grado di fotoconversione al verde 17. Gli autori raccomandano che l'uso di illuminazione epifluorescenza essere ridotto al minimo, discutere occorrenze di questo manufatto, e si riferiscono ai casi di successo di colocalizzazione usando questo reagente. Inoltre, altri marcatori di lisosomi possono anche essere impiegati per verificare i risultati colocalizzazione, per esempio, etichettato LAMP1 6.
In futuro, la sensibilità e la specificità di questo test possono essere esaminati per recettore targeting lisosomi nonché altri compartimenti subcellulari utilizzando inibitori del trasporto delle vescicole e / o fusione, inibendo lisosoma acidificazione utilizzando bafilomicina di bloccare degrado ma non accumulo 7, 18 in base clorochina per bloccare la fusione con i lisosomi conseguente blocco co-localizzazione del recettore con lisosomi 2, 5, 6, 7, 18, utilizzando controlli positivi come la destinazione dei marcato Ang II lisosomi 2, e rispetto ad altri ben sistemi recettoriali e leganti -described come il fattore di transferrina o epidermico di crescita e dei loro recettori affini 3. Un controllo positivo interessante, unartefatti lbeit, nei nostri esperimenti è stato un risultato osservato in adiacente, untransfected, AT cellule negative 1a R-GFP. Queste cellule a quanto pare hanno preso GFP rilasciato dalle cellule trasfettate e mirati a lisosomi dove colocalizzazione con colorante fluorescente era abbastanza importanti (non mostrato). Questo colocalizzazione, tuttavia, non era sensibile alle Ang II come previsto.
In conclusione, i metodi di trasfezione, imaging e analisi di immagine qui presentati forniscono un mezzo attraverso il quale internalizzazione recettoriale nei vari compartimenti subcellulari può essere quantitativamente risalire all'interno delle cellule viventi nel tempo. i confronti relativi tra diversi recettori o recettori mutati in modo selettivo sono possibili per quanto riguarda la cinetica e la localizzazione subcellulare di comparti specifici. Possibili difficoltà e artefatti associati a questa tecnologia sono discussi. Tuttavia, fast live-imaging 3D con analisi d'immagine può essere utilizzato per misurare recettore assorbimento e rapidatransizioni attraverso il citoplasma di molecolarmente compartimenti definibili. Questo pone le basi per la misurazione delle differenze derivanti dalla mutazione del recettore o applicazione di agonisti, antagonisti e inibitori.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Il lavoro di ricerca presentato in questo manoscritto è stato sostenuto dalla concessione R01 HL121456-01A1 a Kathryn Sandberg. Questo lavoro è stato sostenuto in aggiunta dalla disponibilità di una Leica SP8 AOBS in microscopia e di imaging di risorse condivise (MISR) presso la Georgetown University Medical Center, che è parzialmente finanziato da P30-CA051008 dal National Institutes of Health degli Stati Uniti d'America. Noi riconosciamo con gratitudine Leica assistenza di imaging SP8 da Peter Johnson, e l'uso della Zeiss LSM880 nel laboratorio di Thomas Coate, Dipartimento di Biologia presso la Georgetown University con l'assistenza di imaging fornita da Alma Arnold di Carl Zeiss Microscopia LLC. Il contenuto di questo manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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