Summary
Kombinerade prekursor isotopisk märkning och isobar taggning (cPILOT) är en kvantitativ proteomik strategi som förbättrar prov multiplexering kapacitet isobariska taggar. Detta protokoll beskriver tillämpningen av cPILOT till vävnader från en Alzheimers sjukdom musmodell och vilda kontroller.
Abstract
Det finns ett ökande behov av att analysera många biologiska prover för sjukdom förståelse och biomarkörer. Kvantitativa proteomik strategier som tillåter samtidig mätning av flera prover har blivit utbredd och kraftigt minska experimentella kostnader och tider. Vårt laboratorium utvecklades en teknik som kallas kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobar taggning (cPILOT), som förstärker prov multiplexering av traditionell isotopisk märkning eller isobariska märknings tillvägagångssätt. Global cPILOT kan tillämpas på prover som härrör från celler, vävnader, kroppsvätskor, eller hela organismer och ger information om de relativa protein abundances över olika provbetingelser. cPILOT fungerar genom ett) med användning av låga förhållanden pH-buffert att selektivt dimethylate peptid N-terminaler och 2) med användning av högt pH buffertbetingelser för att märka primära aminer i lysinrester med kommersiellt tillgängliga isobariska reagens (se tabell of Materials / Reagents). Graden avprov multiplexering tillgängliga är beroende av antalet av prekursor etiketter som används och den isobar märkningsreagens. Här presenterar vi en 12-Plex analys med användning av lätta och tunga dimetylering kombinerades med sex-plex isobariska reagens för att analysera 12 prover från musvävnader i en enda analys. Förbättrad multiplexering är till hjälp för att minska experimentell tid och kostnad och ännu viktigare, tillåter jämförelse över många provförhållanden (biologiska replikat, sjukdomsstadium, läkemedelsbehandlingar, genotyper, eller longitudinella tidpunkter) med mindre experimentella förspänning och misstag. I detta arbete är den globala cPILOT metod som används för att analysera hjärna, hjärta och lever vävnader över biologiska replikat från en Alzheimers sjukdom musmodell och vildtyp kontroller. Global cPILOT kan tillämpas för att studera andra biologiska processer och anpassas för att öka prov multiplexering till högre än 20 prov.
Introduction
Proteomik innebär ofta en analys av många prover som användes för att bättre förstå sjukdomsprocesser, enzym kinetik, post-translationella modifieringar, svar på stimuli från omgivningen, svar på terapeutiska behandlingar, mätning av biomarkörer, eller läkemedelsmekanismer. Kvantitativa metoder kan användas för att mäta relativa skillnader i proteinhalter över proven och kan vara etikettfria eller involverar isotopmärkning (metabolisk, kemisk eller enzymatisk). Stabila isotopmärkningsmetoder har vuxit i popularitet eftersom de tillåter många prover som skall analyseras samtidigt och är lämpliga för prover från olika celler, vävnader kroppsvätskor, eller hela organismer. Isotopmärkning metoderna 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ökning experimentell genomströmning,samtidigt minska förvärvs tid, kostnader och experimentella fel. Dessa metoder använder prekursor masspektra för att mäta relativa förekomsten av proteiner från peptidtoppar. I kontrast, isobariska märkningsreagens 8, 9, 10 genererar reporter joner som antingen detekteras i MS / MS eller MS 3 11 spektra och dessa toppar används för att rapportera om relativa förekomsten av proteiner.
Den nuvarande state-of-the-art i proteomik multiplexering är antingen en 10-Plex 12 eller 12-plex isobar tagg analys 13. Förstärkt prov multiplexering (dvs> 10 prover) metoder har utvecklats av vårt laboratorium för vävnader 14, 15, 16, 17, och av andra för analys av celler 18 sup>, 19, 20, vävnader 21 eller målinriktade peptider 22. Vi utvecklat en förbättrad multiplexering teknik som kallas kombinerade prekursor isotopisk märkning med isobar taggning (cPILOT). Globala cPILOT är användbart för att få information om de relativa koncentrationerna av alla proteiner i olika provförhållanden (≥12) 14. Figur 1 visar en allmän cPILOT arbetsflöde. Tryptiska eller Lys-C-peptider är selektivt märkt vid N-terminalen med dimetylering med användning lågt pH 2 och vid lysinrester med 6-Plex reagens som använder högt pH. Denna strategi fördubblar antalet prover som kan analyseras med isobariska reagens som bidrar till att minska experimentella kostnader och dessutom minskar experimentella steg och tid.
cPILOT är flexibel som vi har utvecklat andra metoder för att studera oxidativ posttranslationell modificeringar, inklusive 3-nitrotyrosin-modifierade proteiner 14 och cystein innehållande peptider med S-nitrosylering (oxcyscPILOT) 23. Vi har också utvecklat en aminosyra selektivt tillvägagångssätt, cystein cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 förvärv med en topp-jon 11 eller selektiv-y 1 -jon metod 15 kan bidra till att minska reporter jon störning och förbättra kvantitativ noggrannhet cPILOT. Användningen av MS 3 i förvärvet metoden kräver en hög upplösning instrument med en Orbitrap massanalysatorn fastän med låg upplösning ion trap instrument kan också fungera 24.
Tidigare har cPILOT använts för att studera leverproteiner 16 från en Alzheimers sjukdom musmodell. Här beskriver vi hur du utför global cPILOT analys med hjärna, hjärta och leverhomogenat för att studera rollen av periphery i Alzheimers sjukdom. Detta experiment innehåller biologiska replikering. På grund av mångsidigheten hos cPILOT kan intresserade användare använda tekniken för att studera andra vävnader för en rad biologiska problem och system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Möss köptes från en oberoende, ideell biomedicinsk forskning institution och inrymt i divisionen av försöksdjur Resources vid University of Pittsburgh. Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Pittsburgh.
1. Protein Extraction and Generation av peptider för kemisk märkning
- Extrahera proteinet från vävnad, celler eller kroppsvätskor.
- Homogenisera 60-90 mg vävnad (t.ex. hjärna, hjärta och lever) i fosfatbuffert koksaltlösning (1 x PBS) med 8 M urea (500 | il) med användning av en mekanisk homogenisator. Proteas eller fosfatasinhibitorer kan sättas till bufferten vid behov. I detta projekt var de inte används. Använda följande parametrar för homogenisatorn: lysematris A-kulor, 4 m / s, 20 s. Hjärtvävnad kan kräva upp till 9 cykler av homogenisering.
OBS: Proteas eller fosfatasinhibitor s kan sättas till bufferten vid behov. De användes inte i denna studie.- Avlägsna vävnadshomogenat från lyseröret och överför till en mikro-centrifugrör. Skölj lyse rör med 100-500 mikroliter av PBS med 8 M urea och kombinera skölj lösningen med vävnadshomogenat.
- Centrifugera de homogeniserade vävnaderna (9447 xg, 4 ° C, 15 min) och infånga supematanten.
- Homogenisera 60-90 mg vävnad (t.ex. hjärna, hjärta och lever) i fosfatbuffert koksaltlösning (1 x PBS) med 8 M urea (500 | il) med användning av en mekanisk homogenisator. Proteas eller fosfatasinhibitorer kan sättas till bufferten vid behov. I detta projekt var de inte används. Använda följande parametrar för homogenisatorn: lysematris A-kulor, 4 m / s, 20 s. Hjärtvävnad kan kräva upp till 9 cykler av homogenisering.
- Bestämma proteinkoncentrationen med hjälp av en bicinkoninsyra (BCA) analys enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Ytterligare spädning med buffert kan vara nödvändig om proteinkoncentrationen är för hög. De resulterande koncentrationer för prover från dessa vävnader var mellan 6-13 pg / pL.- Valfritt: Lägg till ett intern kvalitetskontroll standard (t.ex. bovint alfa kasein eller annat exogent protein) med förhållandet 1 ug standard: 100 | ig proteinprov.
- Tillsätt 100 | ig (100 x 10 -6 g) av protein från varje prov för att individuellt märkta mikro-centrifugrör. Volymen är beroende av proteinkoncentrationen (se steg 1,2).
- Lägga ditiotreitol (DTT) (40: 1-reagens till prov molförhållande) till varje prov. Inkubera vid 37 ° C under 2 h. Beräkningen för molförhållandet baseras av proteinmassan av bovint serumalbumin (BSA), vilket är 66,5 x 10 3 g / mol.
- Lägga jodacetamid (lAM) (80: 1-reagens till prov molförhållande) till varje prov. Inkubera på is i mörker i 2 timmar. Denna reaktion utföres på is under 2 h för att förhindra sidoreaktioner.
- Lägga L-cystein (40: 1-reagens till prov molförhållande) till varje prov. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Lägg 20 mM Tris-buffert med 10 mM CaCl2 (pH 8,2) för att späda urea till en slutlig koncentration av 2 M.
- Lägga L-1-tosylamido-2 fenyletyl-klormetylketon (TPCK) -behandlat trypsin (50: Ett substrat till enzym molförhållande) till varje prov och inkubera vid 37 ° C under 24 timmar.
- Släcka proteindigestion genom flash-frysning av provet i flytande kväve och förvara vid -80 ° C tills vidare bearbetning.
3. Prov Avsaltning
- Re-surgör proverna genom tillsats av myrsyra (FA). Tillsätt tillräckligt FA för erhållande av en slutkoncentration av 0,1%. Om proverna är ursprungligen vid -80 ° C, tina prover på is före åter surgöring.
- De-salt peptiderna med C 18 hydrofil lipofil viktad (HLB) 10 mg patroner såsom beskrivits tidigare 16.
- Torka proverna genom vakuumcentrifugering (5 Torr, 45 ° C, 77 X g) till en volym av ~ 10 | il.
4. dimetylering Märkning (N-terminaler)
- Rekonstituera peptider i en% ättiksyra (0,25 | ig / | il) upplöst i högupplösande vätskekromatografi (HPLC) eller nano-rent kvalitet vatten. Ta bort en 50 μ; G portion till en ny mikro-centrifugrör (1,5 ml) och lagra resten vid -80 ° C.
- Lägga 8 mikroliter av 60 mM (4%) CH 2 O (37% vikt / volym) eller 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% vikt / vol) till proverna för märkning med lätt eller tung dimetylering, respektive . Typiskt, 4 mikroliter av reagens tillsätts per 25 ^ g av peptider (steg 4,2, 4,3, 4,6).
- Lägga 8 mikroliter av 24 mM NaBH3CN eller 24 mM NaBD 3 CN till proverna märkta med lätt eller tung dimetylering, respektive.
- Virvel och skaka på ett rör skak under ~ 10 min vid rumstemperatur.
- Släcka reaktionerna genom tillsats av 16 mikroliter av en% ammoniak (~ 28-30% volym / volym) under 5 min. Typiskt, 8 mikroliter av reagens tillsätts per 25 ^ g av peptider.
- Re-surgöra reaktionsblandningarna genom tillsats av 8 | il av 5% FA (98% volym / volym).
- Kombinera de lätta och tunga dimetylerade peptider (Figur 1) för att generera totalt sex prover. Se tabell 1
- Utför prov avsaltning enligt steg 3.2 och 3.3.
5. Isobarisk Tagging (Lys-rester)
- Rekonstituera 100 ug av dimetylerade peptider (1 | ag / | il) i 100 mM tri-etyl ammoniumbikarbonat (TEAB) buffert (pH ~ 8,5).
- Förbereda isobariska reagens som anges i tillverkarens protokoll (se tabell of Materials / Reagents).
- Lägga solubiliserade isobariska reagens (41 pl) och peptider och vortexblanda i ~ 10 s. Skaka proven på en mikro-centrifugrör skakanordning under ~ 1 timme. Släcka reaktionerna med 8 mikroliter hydroxylamin (10% vikt / vol) och inkubera proverna under 15 min vid rumstemperatur.
- Pool de sex märkta prover i en enda blandning och avsalta (Steg 3,1-3,3) eller förvara vid -80 ° C tills vidare användning.
OBS: För att förbättra proteom täckning och djup, är en flerdimensionell separation strategi föreslåssåsom stark katjonbyte (SCX).
6. Strong Cation Exchange
- Utföra SCX enligt tillverkarens protokoll (se Material tabell).
- Förbereda ~ 1 ml av ammoniumformiat lösningar (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, & 500 mM) med 10% acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
- Ta bort den röda locket från toppen av pipettspetsen och knacka på pipettspetsen med packning slam för att säkerställa att förpackningsmaterialet är mot botten av pipettspetsen.
OBS: Kritisk: Kasta inte bort pipettspetsen till slutet av protokollet. - Placera centrifugadaptern på toppen av en mikro-centrifugrör (2 ml) och säkra pipettspetsen inuti.
- Tillsätt 150 mikroliter av SCX rekonstitutionsbuffert till pipettspetsar.
- Centrifugera pipettspetsar för 6 min vid rumstemperatur (4000 xg). Upprepa detta steg två gånger och kasta avfallet.
- Upplösa peptides i 150 mikroliter av SCX rekonstitution buffert. Säkerställa att pH är 3.
- Lägg peptider till pipettspetsar, centrifug (se 6.1.5), och hålla eluent.
- Överföra filtret och pipetten till en ny mikro-centrifugrör (2 ml) och till 150 mikroliter av 20 mM ammoniumformiat-lösning. Centrifugera i 6 minuter vid rumstemperatur (4000 xg) och hålla elueringsmedel.
- Upprepa steg 6.1.8 ytterligare sju gånger, med användning av successiva koncentrationer (dvs. 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM och 500 mM) ammoniumformiat.
- Överföra de åtta SCX fraktionerna till mikro centrifugrör (1,5 ml) och koncentrera dem med hjälp centrifugal indunstning (se steg 3,3).
7. vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS / MS) och MS 3
- Rekonstituera peptiderna i massa kvalitet vatten spektrometri med 0,1% FA, filter, och placera i en auto-sampler ampull. Filter peptider som follows:
- Lägga rekonstituerade peptider till en mikro-centrifugrör innehållande ett 0,65 um filter (se Material tabell).
- Centrifug peptider vid 12 tusen xg under 1 min. Ta bort filtret, kasta, och lägg filtrerade peptider in i en auto-sampler ampull.
- Förbereda de mobila buffertar fas enligt följande: 3% (vol / vol) ACN med 0,1% FA (A) och 100% ACN med 0,1% FA (B).
- Injicera 6 mikroliter av varje SCX fraktion provet på en fälla kolonn packad till 2 cm med C 18 material (5 | im, 200 A porstorlek).
NOTERA: Prov rengöring på fällan är följande: 3 min, 0% B; 3 mikroliter / min med användning av en 2D vätskekromatografisystem (se Material tabell). - Köra den analytiska separationsmetoden. Använda en 75 | j, m id x 13,2 cm laser drog-tip smält kiseldioxid kapillärkolonn packad med C 18 material (5 | im, 100 Å). Gradienten är: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
- Köra datainsamling för masspektrometern medan den analytiska separationsmetoden är igång.
OBS: Parametrarna för MS undersökning scan är följande: 400-1,600 m / z, 60 tusen upplösning, automatisk förstärkningsreglering (AGC) rikta 1 x 10 6 joner, maximal injektionstids 500 ms. Parametrar för CID-MS / MS är som följer: Topp 1-7 eller Top 8-14 databeroende förvärv (DDA), 3 m / z isolering bredd, 500 minimala signal, 35% normaliserad kollisionsenergi (NCE), 0,25 aktivering q , 10 ms aktiveringstid, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maximala insprutningstiden. Parametrar för HCD-MS 3 är följande: 200 minimala signal, 4 m / z isolering bredd, 60% NCE, 0,1 aktiveringstiden, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS-områdesval , utesluta un-fragmenterad moderjon.
8. Dataanalys 16
- Sök RAW-filer med hjälp av proteinanalys programvara mot en lämplig databas, såsom mus Uniprot.
OBS: Det är viktigt att skapa två arbetsflöden för varje RAW-fil för att söka efter lätta och tunga dimetylerade peptider. - Söka i RAW-filer med användning av följande parametrar: trypsin med två missade klyvningar, peptidmassområde 300-6,000 Da, 15 ppm modermassan tolerans, en Da fragmentering tolerans. Statiska modifieringar: ljust dimetylering (28,031, peptid-N-terminalen) eller hEavy dimetylering (36,076 Da, peptid N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
OBS: Ibland den tunga dimetylerade toppen är ~ 7 Da (35,069 Da, peptid N-terminalen) är från ljuset dimetylerad topp och sålunda bör införlivas i sökandet arbetsflöde för tunga dimetylerade peptider. Dynamiska modifieringar: oxidation (15,995 Da, M), 6-Plex isobar tagg (229,163 Da, K). Inkluderar ett lockbete databassökning för att ge falskt upptäcktssatser (t.ex. 1 och 5%) och en kvantifiering nod för att söka efter de reporter jonintensiteter av isobariska taggar. - Statistik
- Exportera data till en elektronisk kalkylprogram i syfte att normalisera proteinrapportör ion värden. För varje protein, dela upp antingen de medianreporter jonförhållanden eller råreporter jonintensiteter med median förhållandet av den interna standarden eller råa reporter jonintensiteter för den interna standarden, respektive. Använd lämplig statistisk programvara som ett elektroniskt kalkylprogram, PersEUS, eller R för att bestämma signifikanta förändringar bland provbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cPILOT använder aminbaserad kemi att kemiskt etikett peptider vid N-terminalen och lysinrester och förbättrar prov multiplexering kapacitet. Figur 2 visar representativt MS-data som erhålls från en 12-Plex cPILOT analys av hjärna, hjärta, och levervävnader från en Alzheimers sjukdom musmodell och vilda kontroller. Såsom visas i tabell 1, är två biologiska replikat för Alzheimers sjukdom och vildtyp möss ingår i denna 12-Plex analys. Figur 2A visar en dubbelt laddad topp par som är åtskilda av m / z avstånd av 4 indikerar en enda dimetylgruppen inkorporerades i peptiden. Både de lätta och tunga dimetylerade toppar i paret är oberoende isolerade och fragmenterad med CID. MS / MS-data för var och en av de dimetylerade peptider visas i fig 2B och C. Sökresultat ange detta pair av toppar tillhör T (dimetyl) ELNYFAK (isobar-tag 6) peptid av proteinet fosfoglyceratkinas 1. Den mest intensiva fragmentjon y 3+ som är liknande för både de lätta och tunga dimetylerade toppar. Dessa toppar är isolerade ytterligare för HCD-MS 3 och reporter jonerna (m / z 126-131) observeras såsom visas i figurerna 2D och 2E. Båda uppsättningarna av MS tre spektra är nödvändiga för att få information om de 12 proverna. I detta exempel, de reporter jonförhållanden (AD / WT) (Alzheimers sjukdomsbekämpning / Vildtyp) för hjärna, lever, och hjärtvävnader är likartad i de två biologiska replikat. De fold-avvikelsevärden för varje jämförelse antyder att fosfoglyceratkinas 1-nivåer i hjärna och hjärta är högre i AD-möss, under det att i levern nivåerna är lägre.
Figure 1: Proteomics arbetsflöde med användning cPILOT. Som ett exempel, ges i denna arbetsflödet analysen av 12 individuella prover. Proteiner från vävnader, celler eller kroppsvätskor extraheras och en lämplig proteinstandard (t.ex. bovint alfa-kasein) tillsättes. Proteiner digereras med användning av trypsin. Peptider är märkt vid N-terminalen genom användning av lätt eller tung dimetylering (pH ~ 2,5) och vid lysinrester med användning av TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Märkta peptider poolas till en enda blandning och föremål för SCX RP-LC-MS / MS och MS 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel cPILOT data för peptider från hjärna, hjärta, och levervävnader hos en Alzheimers sjukdom musmodell och vilda kontroller. (A) visar lätta och tunga dimetylerade peptider, som representeras av topparna vid m / z 643,854 och 647,875. Dessa peptider selekterades, isoleras och fragmenteras, vilket genererar CID-MS / MS-spektra (B och C), som tillhandahålls peptididentifiering. Ett ytterligare urval, isolering, och fragmentering av den mest intensiva fragmentet jon av de lätta och tunga dimetylerade peptider på MS / MS skede genereras HCD-MS tre spektra (D och E), respektive. Peptidsekvensen är T (dimetyl) ELNYFAK (isobar-tagg 6) och tillhör fosfoglyceratkinas 1. Klicka här för att visa en större version av denna figur.
| isobar Reagens0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| ljus dimetylering | WT a | AD b | WT | A.D | WT | A.D |
| hjärna | hjärta | lever | ||||
| tung dimetylering | WT | A.D | WT | A.D | WT | A.D |
| hjärta | lever | hjärna | ||||
| Vävnaden är antingen från en vildtyp-kontroll (WT) en eller Alzheimers sjukdom mus (AD) b. | ||||||
Tabell 1: cPILOT gruppering av AD och WT Hjärna, hjärta, och levervävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cPILOT möjliggör samtidig mätning av mer än 12 unika prover. För att säkerställa framgångsrik märkning vid både N-terminalen och lysinrester av peptider, är det absolut nödvändigt att ha rätt pH för varje uppsättning av reaktioner och för att utföra den dimetylering reaktionen först för peptidmärkning. Selektiv dimetylering vid N-terminalen utförs genom att ha ett pH vid ~ 2,5 (± 0,2). Detta uppnås genom att utnyttja skillnaderna i pKa-tals av aminogrupperna på lysin och N-terminalen. Vid pH 2,5, är lysin inaktiv (pKA ~ 10,5); men om pH är svagt surt (dvs pH 5-7) eller basiskt, både N-terminalerna och lysinrester kommer att dimetylerad. Dessutom, om isobar märkning utförs först vid ett lågt pH, kommer N-terminaler har de isobariska etikett- och lysinrester kommer att dimetylerad. Detta kan resultera i mindre fragment väljs för MS 3 som b-joner skulle behöva väljas. De relativa kostnaderna för dimetylation reaktioner är billigt jämfört med de kommersiella isobariska reagens. Även om man kan använda en hel isobar reagensflaska per 100 mikrogram har vi också haft framgång med hälften av reagensflaskan per 100 mikrogram med jämförbar effektivitet märkning. Detta bidrar till att avsevärt minska kostnaderna för enskilda cPILOT experiment och gör att fler prover som skall analyseras. Det är också viktigt att notera att andra isobariska taggreagens kan användas i stället för isobar reagens som används i detta protokoll som vi tidigare har visat 14. För att säkerställa hög märkning och märkning effektivitet är det viktigt att lägga reagens prover snabbt. Detta kommer att möjliggöra prover för att ha ungefär samma reaktionstiden. För kvantitativa ändamål bör varje prov behandlas identiskt särskilt före sammanslagning sampel vid dimetylering och isobariska märkningsstegen. Slutligen bör det noteras att arbeta med många prover samtidigt i de första stegen requires noggrann användar skicklighet och känsla för provhantering.
Den mest ideala scenariot är att erhålla reporterjoner för varje protein i blandningen över 12 prov. Detta är dock inte fallet för ett stort antal proteiner. Antalet peptider som detekteras med kvantifiering information för cPILOT och andra förbättrade multiplexering närmar beror på flera faktorer innefattande provtyp, provfraktionering och bearbetningssteg, MS datainsamlingsmetoder, och typ av instrument. Även om både dimetylering och isobariska taggningsstegen har en hög verkningsgrad på ~ 95-99% peptidmärkning, finns det fortfarande ~ 20% av MS 3 data som inte kommer att innehålla reporter jon information. Detta beror delvis på användning av trypsin som genererar arginin-termine peptider som resulterar i ingen inkorporering av isobar reagens. Detta kan lösas med användning av andra enzymer, såsom LysC, med en potentiell kompromiss i protein identifieringar 25. Även för tungadimetylerade peptider, kan toppen ut för fragmentering vara M eller M-1 topp, som har olika intensiteter och kommer att påverka reporter jonintensiteter observerats i MS 3 skede. Således kan det finnas vissa låg intensitet reporterjoner som inte detekteras för vissa prover. Sådana situationer är ofta vanligen observeras för låg intensitet MS / MS-fragment som är isolerade för MS 3 steg. En bra lösning på detta problem har införlivats i tribrid masspektrometrar, som, istället för att använda enkel-notch val för MS 3, använder multi-notch eller multipla MS / MS-fragment 26.
Det finns en hel del flexibilitet i cPILOT tillvägagångssätt särskilt med avseende på det antal prov som kan jämföras i en enda analys (dvs upp till 20 med kommersiella isobariska reagenser) och vilka typer av vävnader som används. Vi har visat att det är lätt att få korrekt kvantitativ information från hjärna, hjärta ochlevervävnad i samma analys i samband med en sjukdom. Denna metod, i likhet med andra multiplexering metoder, tillåter för analys av flera prover på en gång, och är tillämpbar på prover som härrör från celler, vävnader, kroppsvätskor, eller hela organismer. Dessutom cPILOT märkta peptider kan analyseras med användning av antingen en låg 24 eller hög upplösning (60 tusen) instrument. I jämförelse, erhålla framgångsrik mätning med användning av andra multiplexering metoder kan begränsas till en specifik typ av prov (dvs celler) 18, kan kräva ett instrument med mycket hög upplösning 20, eller tillgång till stabila isotopetiketter. cPILOT är bra för användare som är intresserade av sjukdom förståelse, biomarkörer upptäckt, svar på ett läkemedel eller terapeutiskt ingripande eller längsgående förändringar över många tidpunkter. Dessutom för stora shotgun proteomik analyser av kliniska prover (där N är stor, hundratals till tusentals), cPILOT kan också vara lämpliga för att minska experimentella kostnader och tid. I framtiden kommer cPILOT utökas till multiplex ett större antal prover genom att använda befintliga och nya isotop och isobariska etiketter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna erkänner University of Pittsburgh Uppstart fonder och NIH, NIGMS R01 bidrag (GM 117.191 till 01) till RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
