Summary
यहां हम एक तेजी से संतुलन डायलिसिस (लाल) पद्धति का वर्णन करते हैं जो फुफ्फुसीय तपेदिक के घावों और गुहा से जुड़ी दवाओं को बाध्यकारी मानते हैं। प्रोटोकॉल का उपयोग फेनो मैक्रोफेज-व्युत्पन्न मैट्रिक्स के साथ भी किया जाता है जो केस्यूम के लिए एक प्रभावी सरोगेट है।
Abstract
तपेदिक रोग के उन्मूलन के लिए दवा के नियमों की आवश्यकता होती है जो जटिल फुफ्फुसीय घावों के कई परतों को घुसना कर सकती हैं। कैविटी और घावों के मामलों के मामले में दवा वितरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि वे ड्रग-सहिष्णु बैक्टीरिया के उप-जनसंख्या को भी बंद करते हैं जिन्हें सामान्यतया सामान्यतः पर्सर्स कहा जाता है। क्षयरोग संबंधी घावों में मादक द्रव्यों के सेवन के माप के मौजूदा तरीकों में जैव-फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों में जैव-विश्लेषणात्मक या इमेजिंग तकनीकों के साथ महंगा और समय-उपभोक्ता शामिल है। केस्यूम के लिए बाध्यकारी मादक पदार्थों में इन विट्रो मापन को ऐसी तकनीक के विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया था क्योंकि इस बाध्यकारी ने केसम के माध्यम से दवा के अणुओं के निष्क्रिय प्रसार को बाधा पहुंचाई है। रैपिड संतुलन डायलिसिस प्लाज्मा प्रोटीन और ऊतक बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय प्रणाली है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक तेजी से संतुलन डायलिसिस (आरईडी) डिवाइस का इस्तेमाल करते थे जो कि केस्यूम के होमोजनेनेट के लिए मादक पदार्थों को बाध्य करने के लिए इस्तेमाल होता हैतपेदिक-संक्रमित खरगोशों के घावों और गुहा से एड प्रोटोकॉल यह भी बताता है कि केसियम के स्थान पर उपयोग करने के लिए लिपिड लोड किए गए THP-1 मैक्रोफेज से एक सरोगेट मैट्रिक्स कैसे उत्पन्न किया जाता है। इस केसम / सरोगेट बाध्यकारी परख तपेदिक दवा की खोज में एक महत्वपूर्ण उपकरण है और इसे अन्य रोगों के कारण घावों या फोड़े में दवा वितरण का अध्ययन करने में सहायता करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
फुफ्फुसीय तपेदिक रोग के उपचार के लिए विभिन्न प्रकार के घावों में दवाओं के प्रभावी वितरण की आवश्यकता होती है। नेक्रोटिक घावों और गुहाओं में कैसर के केंद्र होते हैं जो दवाओं के सहिष्णु या 'लगातार' बैक्टीरिया के उप-जनसंख्या को बंद कर देते हैं 1 , 2 सीवेटरी रोग न्यून उपचार दर और खराब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। 3 , 4 पिछला अध्ययनों ने मात्रात्मक और इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करते हुए दिखाया है, कि केस्यूम को घुसना करने की क्षमता एक दवा वर्ग से दूसरे में काफी भिन्न होती है। 5 , 6 हालांकि, इन विधियों को जानवरों के संक्रमण वाले मॉडल के उपयोग की आवश्यकता होती है जो धीमे और थकाऊ होते हैं एक इन विट्रो परख जो पूर्व विवो कैसुम के लिए बाध्यकारी दवाओं को तैयार किया गया था। यह बाध्यकारी पाया गया था कि मामले में ग्रेन्युलोमा में प्रवेश के साथ व्युत्क्रम संबंध है और, इसलिए, हैएक भविष्य कहनेवाला उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया 7
संतुलन डाइलाइसिस को प्लाज्मा प्रोटीन बाध्यकारी अध्ययनों के लिए स्वर्ण मानक दृष्टिकोण माना जाता है। तीव्र संतुलन डायलिसिस (आरईडी) डिवाइस ऐसे एशेज के लिए त्वरित, आसान उपयोग और विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करता है। 8 डिवाइस दो घटकों से बना है: एकल-उपयोग, डिस्पोजेबल आवेषण जिसमें 2 कक्षों को अलग-अलग अर्ध-पारगम्य झिल्ली के ऊर्ध्वाधर सिलेंडर से अलग किया जाता है; और पुन: प्रयोज्य बेस प्लेट्स जो एक बार में 48 से सम्मिलित हो सकते हैं। डायलिसिस झिल्ली में 8 केडीए आणविक वजन कट ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) है जो दवा-मैक्रोमोलेकुले बाध्यकारी अध्ययनों के लिए आदर्श है। झिल्ली कम्पार्टमेंट का उच्च सतह क्षेत्र से मात्रा का अनुपात तेजी से डायलिसिस और संतुलन देता है। दोनों आवेषण और बेस प्लेट न्यूनतम गैर-विशिष्ट बंधन के लिए मान्य हैं। बायोएनालिटिकल तकनीकों के साथ लाल डिवाइस का संयोजन पी में दवाओं के अनबाउंड अंशों के सटीक अनुमान प्रदान करता हैLāsma। 8, 9
हालांकि मूल रूप से प्लाज्मा प्रोटीन बाध्यकारी को मापने के लिए बनाया गया है, लाल डिवाइस homogenates का उपयोग कर कई ऊतक बाध्यकारी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। 10, 11 इस प्रोटोकॉल में, हम पनीर, परिगलित मलबे परिगलित घावों और तपेदिक से संक्रमित खरगोशों की गुहाओं से अलग किया के लिए बाध्य दवा को मापने। किलाटी सामग्री के अकोशिकीय और गैर संवहनी प्रकृति यह आसान एक समरूप निलंबन कि परख के साथ संगत है में homogenize करने के लिए बनाता है।
यह देखते हुए कि पनीर के उत्पादन के लिए कठिन और मिलना मुश्किल है, प्रोटोकॉल भी एक सरोगेट मैट्रिक्स कि झागदार मैक्रोफेज से तैयार किया जाता है साथ प्रयोग के लिए मान्य किया गया है। THP-1 monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज कई लिपिड निकायों कि उन्हें अपने 'झागदार' रूप को प्रदान कर जमा करने के लिए ओलिक एसिड के साथ प्रेरित कर रहे हैं। ये लिपिड लोड कोशिकाओं काटा जाता है औरएक मैट्रिक्स का निर्माण करने के लिए संसाधित किया गया है जिसे हम केससम के लिए एक किराए के रूप में उपयोग करते हैं। इस अध्ययन से पता चला है कि इस सरोगेट मैट्रिक्स के लिए बाध्यकारी औषधि केसियम के लिए बाध्यकारी के साथ अच्छी तरह से संबंध रखती है, प्रभावी रूप से विवो प्रक्रिया की नकल कर रही है जो ग्रेन्युलोमा और गुहों के कैसर कोर में दवा की रोकथाम को बाधित करती है।
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Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन को एनआईएआईडी (एनआईएडी), बेथेस्डा, एमडी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रयोगशाला प्रयोगशाला के देखभाल और प्रयोग के अनुसार मार्गदर्शित किया गया। एम। ट्यूबरकुलोसिस से जुड़े सभी अध्ययन एक प्रयोगशाला में जैव सुरक्षा नियंत्रण स्तर 3 (बीएसएल -3) के साथ किए गए थे।
1. खरगोश संक्रमण मॉडल और केसम संग्रह
- न्यूजीलैंड के सफेद खरगोशों को एम। ट्यूबरकुलोसिस के साथ एक नाक-केवल एरोसोल एक्सपोज़र सिस्टम का प्रयोग करके पहले से वर्णित किया गया। 12 , 13 संक्रमण से 12-16 सप्ताह तक प्रगति की अनुमति दें। खरगोशों को 35 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 5 मिलीग्राम / किलोग्राम के साथ अंतःक्रियात्मक रूप से खरगोशों के साथ, खरगोशों को 0.22 एमएल / किग्रा पेंटोबारबेटिक सोडियम और पनीतोटीन सोडियम में नसों से उतारना और नेक्रॉप्सिस के साथ आगे बढ़ना।
- चिमटी और स्केलपेल का उपयोग करना, छाती सीए से फेफड़ों को हटा देंvity। प्रत्येक फेफड़ों की लोब से, एक स्केलपेल का उपयोग करके अलग-अलग छिद्रों और बड़े नेक्रोटिक ग्रैनुलोमा को छीलना पड़ता है। गुहा और ग्रेन्युलोमा दीवारों से कैसुम को सावधानी से छानना उपयोग के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 एमएल स्क्रू-सेप्टेड ट्यूबों में वजन, रिकॉर्ड और स्टोर के नमूने।
- 3 मेगावाड़ पर सूक्ष्म बर्फ पर संक्रामक केससम नमूनों को गाढ़ा-विकिरण करें ताकि उन्हें बीएसएल -2 प्रयोगशाला में उपयोग करने के लिए असुरक्षित और सुरक्षित प्रदान किया जा सके।
2. टीएचपी -1 कोशिकाओं से केस्यूम सरोगेट के विट्रो जनरेशन में
- टी 175 सेल कल्चर फ्लास्क (80 एमएल / फ्लास्क) में आरपीएमआई 1640 मध्यम (2 मिमी एल-ग्लूटामाइन और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम) में टीएचपी -1 मोनोसाइट्स बढ़ो। 3-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 वायुमंडल में बोतल सेते हैं।
- एक टी 175 फ्लास्क से संस्कृति को दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 5 मिनट के लिए 150 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्याग दें और आरपीएमआई 1640 मीडिया के 10 एमएल में गोली निलंबित करें।
- इस संस्कृति के 5 μL पिपेट में 1.5 एमएल ट्यूब में 45 μL टी होते हैंrypan नीला। pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिला लें। स्थानांतरण एक hemocytometer करने के लिए 10 μL और व्यवहार्य THP-1 monocytes (अस्थिर) एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (10X आवर्धन) का उपयोग कर की संख्या की गणना। संस्कृति के प्रति मिली व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना। 1.25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम घनत्व के RPMI मीडिया के साथ यह पतला।
- लोड 40 एक बड़ी सेल संस्कृति प्लेट (50 x 10 6 कोशिकाओं / प्लेट) पर संस्कृति के एमएल। 100 माइक्रोन पीएमए (phorbol 12 myristate13-एसीटेट इथेनॉल में तैयार) के 40 μL जोड़ें और कोशिकाओं इनक्यूबेटर में रातोंरात पालन करने के लिए अनुमति देते हैं।
नोट: पीएमए के अंतिम एकाग्रता 100 एनएम है। - 0.1 एम (यानी 31.7 μL 968.3 μL इथेनॉल में OA) की एकाग्रता के लिए इथेनॉल में शुद्ध ओलिक एसिड (OA) (0.89 ग्राम / एमएल) पतला। 10 मिमी की एकाग्रता के लिए नए सिरे से पूर्व गर्म RMPI मीडिया में इस समाधान पतला। RPMI माध्यम 0.4 मिमी (अंतिम काम कर रहे एकाग्रता) को यह OA निलंबन पतला 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम।
- मौजूदा मीडिया और गैर निकालेंसेल संस्कृति प्लेटों से बने कोशिकाओं और धीरे-धीरे एचपी -1 मैक्रोफेज (एचएचपी-एम) के लिए 0.4 एमएम ओए के 40 एमएल जोड़ें। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
- प्रत्येक THP-M में कई लिपिड बॉडी इनवर्जन की मौजूदगी की पुष्टि करने के लिए 40x बढ़ाई पर प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें। सेल संस्कृति प्लेट्स से सभी आरपीएमआई मध्यम निकालें और धीरे-धीरे 50 मिलीलीटर स्राविक विंदुक का उपयोग करके फॉस्फेट बफ़ेड खारा (पीबीएस) के साथ दो बार पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें।
नोट: लिपिड निकाय टीएचपी-एम के कोशिका द्रव्य में छोटे, स्पष्ट, गोलाकार संरचना के रूप में दिखाई देते हैं। - प्रत्येक प्लेट में पीबीएस में 5 एमएम एथिलीनएमीनियानेटेट्रैक्टिक एसिड (ईडीटीए) में 40 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं
- 10 एमएल सेरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पूरे प्लेट की सतह पर बार-बार pipetting और नीचे फ़िनी मैक्रोफेज (एफएम) को अलग करें। सेल निलंबन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ट्रांसफ़र करें और 5 मिनट के लिए 150 ग्राम पर स्पिन करें।
- 10 एमएल पीबीएस (तीसरे पीबीएस वॉश) में सेल गोली को फिर से खोलेंपूर्व-तंबाकू 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए फिर से 150 xg पर स्पिन करें एक सेरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को ध्यानपूर्वक महाप्राणण करना और त्याग दें।
- मैट्रिक्स में प्रोटीन का विरोध करने के लिए 20 से 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को बोलने और 75 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते रहने के लिए एफएम छर्रों को 3 फ्रीज-पिघलना चक्रों के अधीन करें। उपयोग के लिए तैयार होने तक छल्ले -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. रैपिड इक्विबिबिलेशन डायलिसिस (लाल) परख
- डाइमिथाइल सल्फ़ॉक्साइड (डीएमएसओ) में सभी परीक्षण यौगिकों के 10 मिमी शेयर समाधान तैयार करें। प्रत्येक परख से पहले डीएमएसओ में 500 माइक्रोन काम करने वाले समाधानों को पतला।
- केस्यूम सरोगेट गोली युक्त ट्यूब का वजन। अकेले गोली के वजन को प्राप्त करने के लिए खाली ट्यूब का वजन घटाएं। प्रति ट्यूब 2-3 धातु मोतियों को जोड़ें और प्रत्येक मैट्रिक्स के 10x पतला निलंबन को प्राप्त करने के लिए 1/200 स्ट्रोक / मिनट में 1 मिनट के लिए एक ऊतक homogenizer का उपयोग करके, केसम या पीबीएस (1: 9 वा / वी) में सरोगेट मैट्रिक्स को बाधित करें।
- 500 की स्पाइक 6.5 μL5 माइक्रोग्राम (≤ 1% डीएमएसओ) और भंवर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए होमोजीनेट के 643.5 μL में परीक्षण परिसर के सुक्ष्ममापी समाधान।
- लाल आवेषण को बेस प्लेट में रखें। प्रत्येक लाल रंग के डाक्टर चैम्बर (लाल अंगूठी) और प्रत्येक रिसीवर चैम्बर में 350 μL पीबीएस में ड्रग-स्पाइक्ड मैट्रिक्स के 200 μL जोड़ें। प्रत्येक परीक्षण परिसर (तीन प्रतियों के लिए 3 आवेषण तैयार करें) चिपकने वाली प्लेट सील के साथ प्लेट सील करें और थर्मोमिक्सर पर 37 आरपीएम (1 एक्सजी) पर 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, धीरे-धीरे 2-3 बार pipetting द्वारा दाता और रिसीवर कक्षों की सामग्री मिश्रण। दाता कक्षों से homogenate के 20 μL aliquots बाहर पिपेट और एक 1.5 एमएल ट्यूब (1: 1) में साफ पीबीएस के 20 μL जोड़ें। इसी तरह, रिसीवर चैंबर से पीबीएस नमूनों के 20 μL अलक्षकों को बाहर निकालें और 20 μL को स्वच्छ समरूप (मैट्रिक्स मिलान) में जोड़ें। 8
नोट: मैट्रिक्स-मिलान समाप्त नहीं करता हैमात्रात्मक विश्लेषण के लिए 2 अलग अंशांकन घटता (एकांत और पीबीएस में) के लिए एड। दाता कक्ष की सामग्री समय के साथ तलछट हो सकती है। अल्कोव्स को निकालने से पहले धीरे-धीरे पिपेट करके सामग्री को मिलाएं।
4. एलसी-एमएस मात्रा और डेटा विश्लेषण
- 1: 1 मेथनॉल के 160 μL जोड़ें: प्रत्येक ट्यूब के लिए 500 एनजी / एमएल डाइक्लोफेनैक या 10 एनजी / एमएल वरामामिल्म (आंतरिक मानक) युक्त एसीटोनिट्रील प्रोटीन को फैलाने के लिए। तरल क्रोमैटोग्राफी-जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसीएमएस) विश्लेषण के लिए 96-अच्छी तरह से गहरे-अच्छी तरह प्लेटों में तैरने वाले तत्वों को स्थानांतरित करने और स्थानांतरण करने के लिए 5 मिनट के लिए 10,000 xg में अपकेंद्रित्र। 7
- ऊपर दिए नमूने के रूप में एक ही मैट्रिक्स संरचना रखते हुए प्रत्येक परीक्षण परिसर के लिए 1-1,000 एनएम से अंशांकन घटता बनाएं। एलसी-एमएस पद्धति का उपयोग करते हुए दाता और रिसीवर कक्षों के नमूने में परीक्षण परिसर की एकाग्रता को बढ़ाएं।
- अनबाउंड अंश की गणना करें ( एफ यू ) ओच पतला मैट्रिक्स समीकरण 1. का प्रयोग करने में दवा समीकरण 2 (डी = 10 के कमजोर पड़ने कारक) का उपयोग कर undiluted मैट्रिक्स में च यू की गणना। 14
- समीकरण 3 का उपयोग स्थिरता / चयापचय / गैर विशिष्ट बंधन मुद्दों के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए प्रत्येक यौगिक की वसूली (जन संतुलन) की जाँच करें।
नोट: वसूली आम तौर पर 70% और 130% के बीच गिर जाता है। 15
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम ने कथित तौर पर मस्तिष्क की पक्की आंखों पर अपनी भविष्यवाणी की दक्षता के लिए तपेदिक दवा के विकास के यौगिकों की जांच की है। चित्रा 1 चित्रा 1 लाल परख की बुनियादी अवधारणाओं visualizes। लाल आवेषण का डायलिसिस झिल्ली अनबाउंड छोटे अणुओं को दाता से अच्छी तरह से रिसीवर तक फैलाने के लिए अनुमति देता है, अंततः दोनों डिब्बों के बीच एक संतुलन प्राप्त कर रहा है। छोटे अणु जो प्रोटीन या लिपिड जैसे अणुओं के लिए बंधे हैं दाता अच्छी तरह से फंस रहे हैं। दोनों डिब्बों के नमूनों का मात्रात्मक विश्लेषण, केसम या सरोगेट मैट्रिक्स में प्रत्येक छोटे अणु के अनबाउंड अंश ( एफ यू ) की गणना के लिए अनुमति देता है। यह अंश प्रत्यक्ष रूप से विवो में केस्यूम में दवा के प्रवेश के साथ सीधे संबंध में दिखाया गया है। 7 जैसा कि चित्रा 2 में MALDI (मैट्रिक्स-सहाययुक्त लेजर डिस्स्थापन / आयनाईकरण) जन स्पेक्ट्रोmetry छवियों, उच्च च यू, अधिक बड़े पैमाने पर दवा पनीर में diffuses। इसलिए, यह परिकल्पना है कि दवा अणुओं घाव के सेलुलर परतों, किलाटी बड़े अणुओं के लिए बाध्य के साथ इसके इंटरफेस से पनीर के बाहरी रिम में विसरित के रूप में दवा sequesters, आगे किलाटी कोर में diffusing से रोकता है के साथ सहमत हैं। 18 विरोधी तपेदिक दवाओं का एक नमूना पैनल दोनों पनीर और सरोगेट में अपने च यू के साथ तालिका 1 में सूचीबद्ध है। 3 चित्र दिखाता है के रूप में, मैट्रिक्स THP-1 व्युत्पन्न झागदार मैक्रोफेज से तैयार सच पनीर के लिए एक प्रभावी किराए की है। दोनों मैट्रिक्स में बाइंडिंग दृढ़ता से एक दूसरे के साथ संबद्ध करता है।
चित्र 1: लाल परख का चित्रण। ऊष्मायन के दौरान दवा अणुओं है कि में बड़े अणुओं को अबाध रहनेमैट्रिक्स डायलिसिस झिल्ली भर में फैल गया। समय के साथ, दाता और रिसीवर कुओं दोनों में अनबाउंड ड्रग अणुओं की एकाग्रता के बीच एक संतुलन स्थापित किया गया है। सभी अणुओं (प्रोटीन, लिपिड, आदि ) और बाध्य दवा अणु दाता कक्ष के भीतर फंस रहे हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: विवो में ड्रग प्रवेश छद्म ट्यूबरकुलोसिस दवाओं के लिए माल्डि (मैट्रिक्स-सहायोजित लेजर डिस्स्थापन / आयनाईकरण) मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग द्वारा निर्धारित आंशिक भाग के बीच संबंध ( एफ यू ) और विवो में केस्यूम के बीच संबंध। आयन नक्शे प्रतिनिधि फेफड़ों के घावों के होते हैं और सिग्नल की तीव्रता को बाईं तरफ के पैमाने के पट्टी से दर्शाया जाता है। एच ematoxylin और eosin (एच एंड ई) आसन्न वर्गों का धुंधला आयन नक्शे नीचे दिखाया गया है। काला / सफेद समोच्च पंक्तियों प्रत्येक घाव के किलाटी केंद्र पर प्रकाश डाला। पुनर्प्रकाशित (अनुकूलित) सारथी एट अल से अनुमति के साथ। 7 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: पनीर में 18 विरोधी तपेदिक दवाओं और किराए की मैट्रिक्स की अबाध अंशों के बीच सहसंबंध (च यू)। सबसे फिट लाइन रेखीय प्रतीपगमन का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। फिट की अच्छाई आर 2 मूल्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। पुनर्प्रकाशित (अनुकूलित) सारथी एट अल से अनुमति के साथ। 7K "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
कैसम एफ यू (%) | सरोगेट फ यू (%) | |
एथेमब्युटोल | 35.2 ± 4.4 | 38.8 ± 5.6 |
isoniazid | > 99.9 | > 99.9 |
एसिटाइल आइसोनियाज़िड | > 99.9 | > 99.9 |
पी -मिनेलोसलिसिसिल एसिड | 54.7 ± 1.4 | 51.1 ± 11.2 |
रिफैम्पिसिन | 5.13 ± 0.2 | 7.3 ± 0.6 |
Rifapentine | 0.5 ± 0.1 | 1.1 ± 0.1 |
moxifloxacin | 13.5 ± 3.7 | 16.8 ± 1.8 |
लिवोफ़्लॉक्सासिन | 8.34 ± 0.4 | 16.3 ± 3.1 |
Gatifloxacin | 16.3 ± 4.2 | 18.8 ± 2.9 |
लिनेज़ोलिद | 29.3 ± 3.6 | 27.9 ± 2.2 |
Posizolid | 10.7 ± 1.7 | 17.6 ± 4.5 |
Sutezolid | 30.1 ± 8.7 | 21.7 ± 1.7 |
Radezolid | 5.2 ± 0.8 | 7.6 ± 1.9 |
Tedizolid | 8.8 ± 1.8 | 13.7 ± 2.7 |
Clofazimine | <0.01 | <0.01 |
Bedaquiline | <0.01 | <0.01 |
PA-824 | 7.31 ± 2.2 | 3.6 ± 0.2 |
OPC67683 | 0.04 ± 0.02 | 0.02 ± 0.002 |
तालिका 1: केस्यूम में 18 टीबी ड्रग्स का परीक्षण किया गया है और बाध्यकारी अभिकर्मक को किराए पर लेना। सभी परिणाम माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किए जाते हैं सराय एट अल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित (अनुकूलित) 7
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Discussion
पल्मोनरी परिगलित घावों और तपेदिक से संक्रमित रोगियों में cavities बैक्टीरिया है कि नशीली दवाओं के उपचार के लिए अड़ियल हैं की उप-जनसंख्या होते हैं। इन संरचनाओं की किलाटी कोर एक बाह्य वातावरण में इन persisters को शरण देने के लिए विशेष रूप से जिम्मेदार हैं। इन दूरदराज के स्थानों में विरोधी बैक्टीरियल एजेंट के 16 अनुकूल वितरण तपेदिक दवा का प्रभावकारिता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक माना जा रहा है। इस प्रोटोकॉल के सत्यापन करने से पहले, वहाँ कोई इन विट्रो तकनीक कि किलाटी घावों में दवाओं की खोज यौगिकों के वितरण का अनुमान लगा सकते में उपलब्ध थे। नतीजतन, इन महत्वपूर्ण फोकी में दवा वितरण के मूल्यांकन भारी पशु संक्रमण मॉडल, घाव केंद्रित फार्माकोकाइनेटिक पढ़ाई और MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग तकनीक पर निर्भर था। 5, 17
इन विट्रो परख वह वर्णितफिर से वही फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों में टेडियम और लागत के बिना तपेदिक के घावों में दवा का अनुमान लगाने का एक तेज़ और प्रभावी तरीका है। प्रोटोकॉल प्लाज्मा प्रोटीन बाइंडिंग परख का एक संशोधन है जो मूल रूप से लाल डिवाइस के उपयोग के लिए था। ऊतक के नमूनों का विंदुक-सक्षम स्थिरता में होमोजिनायझेशन ऊतक प्रोटीन को एक ही डिवाइस का उपयोग करके मापा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल केस्यूम के साथ आयोजित किया जा सकता है अगर यह पशु संक्रमण मॉडल से उपलब्ध है। जैसा कि चित्रा 1 बताता है, दवा अणु, केसम / सरोगेट होमोजेनेट में मैक्रोमोलेक्लस से जुड़ा है, इसे दाता कक्ष में रखते हुए, जबकि अनबाउंड दवा अणु रिसीवर कक्ष में अर्ध-पारगम्य झिल्ली में फैल जाने के लिए स्वतंत्र हैं। उबाऊ अंश ( एफ यू ) ऊष्मायन अवधि के दौरान दोनों डिब्बों के बीच संतुलित करता है। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, बहुत ऊपरी यौगिकों ( एफ यू ≤ 1%) जो अल्मो हैंदाता कक्ष के भीतर पूरी तरह से फंसे हुए सीट को कैप्सम पर प्रसारित करने में प्रभावी नहीं है। दूसरी ओर, कम-बाध्य यौगिकों (1% < F u <100%) अलग-अलग डिग्री करने के लिए कैसर कोर में फैल जाती हैं; जितना ऊँचा होगा, उतना ही बड़े पैमाने पर यह नेक्रोटिक्स क्षेत्र में व्याप्त है।
प्रोटोकॉल का इस्तेमाल लिपिड लोडेड THP-1 मैक्रोफेज से लिया गया एक सरोगेट मैट्रिक्स के साथ किया जा सकता है जो ओलिक एसिड के साथ प्रेरित किया गया है। लिपिड बॉडी संचय की प्रेरण के लिए कई शर्तों का परीक्षण टीएचपी -1 एस पर किया गया था। इनमें हाइपोक्सिया, विकिरणित एम। ट्यूबरकुलोसिस के संपर्क में और मायकोबैक्टीरियल सेल की दीवार से उत्पन्न 6,6-डिमॉइलोलेट (टीएमडी) के त्रोहोस के संपर्क में शामिल हैं। 400 माइक्रोन का अंतिम ओलिक एसिड इन्सुबेशन एकाग्रता सेल व्यवहार्यता और आसंजन के साथ समझौता किए बिना चोटी के लिपिड शरीर गठन को प्रेरित करने के लिए सिद्ध किया गया था। 7 प्री-वार्मिंग मीडिया में ओलिक एसिड का कमजोर पड़ना अधिकतममा को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैफैटी एसिड का विघटन परिणामी सरोगेट मैट्रिक्स में सही कैस्यूम के साथ तुलनीय कोलेस्ट्रॉल सामग्री होती है, लेकिन क्रमशः उच्च और निम्न ट्राइग्लिसराइड और प्रोटीन सामग्री होती है। 7 जैसा कि चित्रा 3 बताता है, सरोगेट मैट्रिक्स के लिए 18 एंटी-ट्यूबरक्युलोसिस यौगिकों की बाध्यकारी उनके केसियम के लिए बंधन के साथ दृढ़ संबंध है। हाल ही के अध्ययन में जिसमें अपरिभाषित जीवाणुनाशक गतिविधि के साथ गैर-वाणिज्यिक यौगिकों को भी शामिल किया गया, यह साबित करता है कि एफएम-व्युत्पन्न मैट्रिक्स केस्यूम के लिए एक प्रभावी सरोगेट है। 7 पशु संक्रमण मॉडल की आवश्यकता को हटाकर, सरोगेट मैट्रिक्स सफलतापूर्वक इस परख के प्रवाह को बढ़ाता है जबकि इसे अधिक लागत प्रभावी बनाता है
यह बहुमुखी प्रोटोकॉल भी एक साथ कई यौगिकों (कैसेट परीक्षण) का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमने पहले यह दिखाया है कि इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करते हुए प्रत्येक डालने में 5 माइक्रोग्राम के सभी 5 नशीली दवाओं का परीक्षण, प्रभावी रूप से परिसर को रैंक कर सकता हैएस अपने समय के बाध्यकारी संबंधों पर आधारित समय और सामग्री की बचत करते हुए। केसम / सरोगेट के एशेज और बैचों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए मोक्सिफ्लॉक्सासिन जैसे छठे नियंत्रण परिसर को एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कैसेट में जोड़ा जा सकता है। 7 महत्वपूर्ण रूप से, प्रोटोकॉल 10 एमएम मिश्रित स्टॉक (<< 1 मिलीग्राम एक मिश्रित) के रूप में छोटा रूप में 20 μL के साथ चलाया जा सकता है। ड्रग की खोज की प्रक्रिया में यह बहुत बड़ा लाभ है जब कैमिस्टर्स स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए प्रत्येक परिसर के सीमित मात्रा में संश्लेषित होते हैं। लाल डिवाइस तंत्र स्वचालन के अनुकूल हैं; बेस प्लेट के माइक्रोप्लेट पदचिह्न मानक 96 अच्छी तरह प्लेटें को संभालने के लिए डिज़ाइन स्वचालित सिस्टम के साथ संगत बनाता है।
यद्यपि सरोगेट मैट्रिक्स को पूर्व vivo caseum ( चित्रा 3 ) के बाध्यकारी गुणों की सफलतापूर्वक नकल करने के लिए दिखाया गया है, हालांकि हम स्वीकार करते हैं कि यह कुछ यौगिकों को गलत रूप से प्रोफाइल कर सकता है THP-1 मैक्रोफेज सामान्यतः में उपयोग किया जाता है केस्यूम सरोगेट बाइंडिंग परख तपेदिक दवा की खोज में एक उपयोगी उपकरण है और इसे कई सीसा अनुकूलन कार्यक्रमों में उपयोग किया जा रहा है। यह भी अधिक ef डिजाइन करने में मदद कर सकता हैविभिन्न घावों-प्रकारों की विभिन्न परतों में विभाजित करने के लिए व्यक्तिगत दवाइयों की क्षमता के आधार पर फ्लेक्टिव संयोजन प्रारम्भ। अन्य बीमारियों के लिए ड्रग की खोज को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रोटोकॉल भी अनुकूलित किया जा सकता है जो कि घावों या फोड़े के गठन के लक्षण हैं, जहां दवा का प्रवेश सीमित है लेकिन सफल उपचार के लिए महत्वपूर्ण है।
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Disclosures
कोई प्रतियोगी वित्तीय हितों नहीं हैं
Acknowledgments
हम क्रमशः बेडकाक्लीन, पीए -824 (प्रीटीमनिड), एजेडी 5847, रेडेज़ोलिड और टेडिज़ोलिड प्रदान करने के लिए जॉनसन एंड जॉनसन, टीबी एलायंस, एस्ट्रा जेनेका, रिब-एक्स और ट्रूज़ थेरेपीटिक्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। ब्रेंडन प्राइडोक्स, मैथ्यू ज़िमेर्मन, स्टीफन जुजुइन, एम्मा रे-जुराडो, नैन्सी रुएल, लीयन ली और डेनिएल वेनर ने मालाडी विश्लेषण, जैव-विश्लेषणात्मक विधियों, केसमोज किराए की तैयारी, रासायनिक संश्लेषण की तैयारी और खरगोश के केसम के अलगाव को समर्थन प्रदान किया। यह काम बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से फंडिंग के साथ आयोजित किया गया, # ओपीपी 1044 9 66 और ओपीपी 10404050 वी। डार्टोईस, एनआईएच साझा इंस्ट्रुमेंटेशन ग्रांट एस 10OD018072, साथ ही विधेयक और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से संयुक्त धन और उत्कृष्टता केंद्र के लिए वेलकम ट्रस्ट विकासशील विश्व के रोगों के लिए पी। वायट के लिए लीड ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
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