Summary
Ce travail présente un nouveau modèle in vivo de lésions rénales segmentaires utilisant du poisson zèbre transgénique GFP rénal. Le modèle permet l'induction de l'ablation ciblée des cellules épithéliales rénales pour montrer les mécanismes cellulaires des lésions et des réparations de néphron.
Abstract
La lésion rénale aiguë (IRA) est une affection médicale commune avec un taux de mortalité élevé. Avec les capacités de réparation du rein, il est possible de restaurer une fonction rénale adéquate après un traitement de soutien. Cependant, une meilleure compréhension de la mort et de la réparation des cellules néphrones au niveau cellulaire est nécessaire pour minimiser la mort cellulaire et pour améliorer le processus de régénération. Le pronephros du poisson zombi est un bon système modèle pour atteindre cet objectif car il contient des segments anatomiques similaires à ceux du néphron des mammifères. Auparavant, le modèle de la gentamicine pharmacologique était le modèle le plus courant utilisé pour étudier les lésions rénales chez les poissons. Cependant, ce modèle ne permet pas un contrôle spatiotemporel précis des blessures, et il est donc difficile d'étudier les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la réparation des reins. Pour surmonter cette limitation, ce travail présente une méthode par laquelle, contrairement à l'approche de la gentamicine, une protéine Fuorecent verte verte (GFP)Le pressage du groupe néphron peut être mis en photo à l'aide d'une lumière laser violette (405 nm). Ce nouveau modèle d'AKI offre de nombreux avantages qu'est d'autres méthodes de lésion épithéliale. Ses principaux avantages sont la capacité de «composer» le niveau de blessure et le contrôle spatiotemporel précis dans le modèle animal robuste in vivo . Cette nouvelle méthode permet d'améliorer considérablement le niveau de compréhension des mécanismes de réparation des blessures rénales et des réparations.
Introduction
Les lésions rénales aiguës (LIR) 1 , 2 , qui peuvent également être appelées insuffisance rénale aiguë, sont largement définies comme une altération soudaine de la fonction rénale 3 . Bien que le niveau de compréhension de cette condition ait été remarquablement remarquable au cours des années, les taux de morbidité et de mortalité sont restés élevés 1 , 2 . Le traitement actuel pour cette condition est principalement favorable, car les résultats de plusieurs essais cliniques de traitement médicamenteux ont été négatifs 4 , 5 . Le rein est unique car il a la capacité de se réparer. Par conséquent, la thérapie de soutien après un diagnostic précoce d'IRA est le meilleur moyen de limiter la morbidité 6 . Cependant, il est difficile de détecter l'IRA tôt, et le taux de mortalité est de 50 à 80% décroissant chez ceux qui ont besoin de dialyse 5. Avec la capacité des reins de se réparer et le manque d'options de traitement pour cette condition, il est important de développer des méthodes pour améliorer ce processus de régénération de néphron.
Il y a eu beaucoup de modèles différents utilisés pour la recherche AKI qui comprend différents agents de blessures et modèles animaux. En termes d'agents de lésions rénales, l'antibiotique aminoglycoside gentamicine a été utilisé comme agent néphrotoxique qui conduit à l'IRA 7 , 8 . Cependant, plusieurs groupes ont constaté que le traitement de gentamicine est mortel pour l'embryon de poisson zèbre 9 . Cela provoque des dommages tubulaires trop graves pour la récupération des embryons, rendant l'étude de la régénération difficile sans intervention. Les modèles de mammifères, comme la souris et le rat, sont également considérés comme précieux, mais ils font face à de nombreuses limitations lors de l'étude de l'IRA. Peut-être le principal inconvénient des modèles de rongeurs est la difficulté de visuaLisant le rein des rongeurs et déterminant ainsi les processus spatiotemportaux précis menant à la mort épithéliale et à la réparation.
Johnson et al. Ont rapporté une technique à base d'ablation au laser pour induire une lésion rénale aiguë chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire 9 . Ils ont utilisé une ablation laser pulsée pour endommager le rein après une injection intramusculaire avec des conjugués de dextrane. La fluorescence des conjugués de dextrane permet de visualiser les dommages et la régénération dans l'épithélium des tubules 9 . Ce modèle surmonte les deux limitations mentionnées ci-dessus, mais cela ne permet pas de niveaux de blessure graduels et est difficile à réaliser sur de grands groupes de cellules arbitraires.
Le nouveau modèle d'AKI à base d'ablation par laser à base d'ablation décrit ici répond à toutes les limitations ci-dessus. Le rein pronephrique dans le poisson zèbre larvaire est un organe mature et fonctionnel qui contient des segments semblables à ceux de la mammifèrePhron, y compris un glomérule, des tubules proximaux et distal, et un conduit collecteur 10 . Les larves de zébrés sont également optiquement transparentes, ce qui permet d'observer le rein à l'aide de techniques de fluorescence. Ainsi, le poisson zèbre est un modèle précieux in vivo de l'IRA, et le rein pronephrique larvaire (5-12 jours après la fertilisation (dpf)) peut être utilisé pour étudier les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans les lésions rénales et la réparation.
Cet article présente une méthode par laquelle des protéines Green Fluorescent Protein (GFP) - exprimant des segments de néphron peuvent être mises en photo à l'aide d'une lumière laser violette à faible énergie (par rapport à un système à laser pulsé) (405 nm). La fluorescence GFP permet de cibler un groupe de cellules, ce qui rend les changements qui se produisent visibles grâce à l'observation du photoblanchiment GFP. En outre, la GFP (en absorbant la lumière violette) sert d'évier d'énergie pour potentialiser la blessure dans les cellules rénales exprimant la GFP. Micros à temporisationLa copie peut ensuite être utilisée pour étudier le processus de réparation. Des études ont révélé que la prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la métaplasie cellulaire 11 , 12 , 13 sont des processus potentiels qui peuvent jouer un rôle important dans la réparation des reins. Cependant, l'importance relative de ces processus et les détails de leur interaction ont été difficiles à découvrir en raison des limites des modèles existants d'AKI. En utilisant cette approche novatrice, il a été possible de montrer que la migration cellulaire joue un rôle central dans la réparation des reins après une blessure aiguë 14 .
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Protocol
Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations du Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de santé. Le protocole a été approuvé par le Comité de soins et de soins pour animaux spécialisés en médecine de l'ostéopathie de NYIT (NYITCOM IACUC). Toute opération chirurgicale et expérimentation in vivo a été effectuée sous anesthésie tricaine, et tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances.
1. Obtention et maintien d'embryons
- Obtenir des embryons en traversant le poisson zèbre fluorescent GFP au rein.
NOTE: Des exemples de lignées transgéniques de poissons zèbres marquées par fluorescence sont listés dans le tableau 1 . - Conserver les embryons à 28,5 ° C dans la solution E3 pendant les 24 heures après la fertilisation.
- Après 24 h, remplacer le milieu par une solution E3 contenant 0,003% de 1-phényl-2-thiourée (PTU).
NOTE: PTU est utilisé car il bloque les étapes dépendant de la tyrosinase dans la mélanogenèseEt empêche donc la pigmentation. Ici, cette solution est appelée E3-PTU. - Augmenter les embryons fécondés à 28,5 ° C jusqu'à ce qu'ils soient> 6 dpf, moment auquel les reins ont vieilli.
NOTE: Il est préférable d'utiliser des larves dans la fenêtre 7-9 dpf. - À l'aide d'un microscope à dissection fluorescent à un grossissement de 40X et des filtres d'émission de fluorescence verte, sélectionnez les larves avec une fluorescence GFP à rein lumineuse.
2. Montage du poisson-zèbre pour l'imagerie en direct
- Si vous photoïlisez les embryons avant 3 dpf, retirez le chorion de tout poisson zèbre non décalé avant de monter le poisson zèbre pour l'imagerie.
- Déchoriser manuellement avec une pince (préférée) ou utiliser un traitement chimique avec un mélange de protéase.
REMARQUE: Dechorination permet les meilleurs résultats d'imagerie.
- Déchoriser manuellement avec une pince (préférée) ou utiliser un traitement chimique avec un mélange de protéase.
- Rincer les débris de chorion dans la boîte de Petri en utilisant la solution E3-PTU et remplir le plat avec E3-PTU.
- PrepaRe 1-2% d'agarose à faible point de fusion (LMP) avec 0,2 mg / ml de solution de tricaine pour monter le poisson zèbre pour la photoablation des reins et l'imagerie en direct.
- Si LMP agarose a déjà été préparé au préalable, réchauffer au micro-ondes pour le faire fondre.
- Une fois l'agarose LMP préparée, placer une boîte de Petri en plastique de 35 mm sur un microscope à dissection. Placez une sonde de verre tirée à proximité pour orienter correctement les larves anesthésiées.
NOTE: Il est important de faire cette étape en temps opportun et d'avoir tout en place, car les embryons doivent être orientés avant que l'agarose ne se solidifie en environ 1 à 3 minutes. - Avant de transférer l'embryon sur l'agarose, assurez-vous que l'agarose est froid ( c'est- à -dire à une température corporelle approximative). Utilisez une pipette de transfert en plastique ou en verre pour placer l'embryon dans la solution d'agarose-tricaine fondue refroidie.
REMARQUE: ceci se fait car l'agarose trop chaud peut nuire à l'embryon, entraînant un arrêt cardiaqueOu la mort - À l'aide d'une pipette de transfert, redessiner l'embryon dans la solution d'agarose et positionner l'embryon / larve au milieu d'un plat de 35 mm.
- Étendez rapidement l'agarose contenant l'embryon / larve pour couvrir uniformément le fond du plat de 35 mm; Le meilleur volume d'agarose à utiliser est ~ 1-1.1 mL.
- Utilisez la sonde de verre pour orienter l'embryon dans la meilleure position possible pour la photoablation et l'imagerie.
REMARQUE: Le film 1 montre la meilleure orientation de l'embryon / larve pour la photoablation unilatérale. Cette étape est la plus sensible au temps et devrait être effectuée rapidement avant que l'agarose commence à se geler, car toute tentative de réorienter le poisson après la gélification commence est néfaste.- Orientez la larve de telle sorte que le segment d'intérêt du rein soit perpendiculaire au trajet du faisceau tandis que le segment contralatéral est éloigné du faisceau laser (voir le film 1 ).
REMARQUE: ceci peut être réalisé en tournant la larve comme le montre le film 1 . - Laisser environ 15 minutes pour que l'agarose se solidifie. Couvrir la boîte à pétrole pour minimiser l'évaporation. Une fois l'agarose solidifiée, l'embryon ou la larve est prêt pour la photoablation.
3. Ablation au laser
- Utilisez le système d'imagerie confocal.
REMARQUE: lorsque vous utilisez la plate-forme d'imagerie référencée (voir la table des matériaux), les paramètres recommandés incluent un grossissement 40X, une lentille de trempage d'eau 0,8 NA et le premier miroir dichroïque pour permettre l'éclairage à la fois de 488 et 405 nm. La détection doit être effectuée sur le canal vert. - Placez le plat contenant le poisson zèbre immobilisé sur une scène confocale.
REMARQUE: cette procédure est optimisée pour la configuration verticale à l'aide d'une lentille de trempage d'eau 40-60X. Cependant, il devrait être possible de modifier la procédure pour un microscope inversé. - Dans la configuration verticale, positionnez la boîte à pétres contenant l'embryon sur un microscOuvrez la glissière et maintenez-la en place à l'aide d'une argile de modélisation ( p. Ex., De la plasticine). Placez la glissière en verre avec la boîte de Petri sur la scène du microscope confocal.
- Ajouter 3 ml de la solution d'imagerie E3-PTU (voir étape 1.3) avec 0,2 mg / mL de tricaine.
REMARQUE: la solution d'imagerie peut également être ajoutée immédiatement avant de placer la diapositive sur la scène. L'ajout d'une solution d'imagerie doit être effectué avec beaucoup d'attention pour empêcher l'agarose de flotter du fond du plat. - Passez à l'objectif de trempage d'eau (40 ou 60X). Relevez lentement la scène, en vous assurant que la lentille est légèrement inclinée pour éviter que l'air ne soit piégé dans le chemin du faisceau. Une fois que l'objectif touche la solution à un angle, concentrez-la afin qu'elle soit dans le champ de vision des embryons.
- Trouvez le segment d'intérêt en utilisant la source de lumière fluorescente. Placez superficiellement la branche destinée à être blessée afin de minimiser la diffusion de la lumière (voir le film 1 ).
REMARQUE: la suiteLes étapes t utilisent un logiciel référencé (voir la Table des matières), mais la procédure peut être facilement adaptée à d'autres plates-formes. - Ouvrez le logiciel. Accédez à "Afficher" | "Contrôle d'acquisition" | "C2plus Compact GUI" et définissez "pixel dwell time" à "1.9 μs", "taille d'image" à "512 x 512 pixels" et "taille d'épingle" à "90 μm". Définir "405 nm (ou 408 nm dans certains systèmes) l'intensité laser" à zéro et "488 intensité laser" à "faible" (de préférence <1%). Ajustez le "gain" pour obtenir une bonne dynamique mais pas pour saturer le signal.
REMARQUE: ces valeurs ne sont pas critiques et sont utilisées pour la cohérence. Lorsqu'un laser de 405 nm est utilisé, il en résultera une augmentation de la fluorescence GFP. Pour éviter la saturation du signal lors du photoblanchage (étape 3.11), la valeur de gain du signal doit être réduite sur le canal vert. Le gain de canal bleu peut être laissé à zéro, car il n'est pas utilisé pour saMpling. - Cliquez sur "Numériser" dans l'interface du logiciel pour scanner le rein en utilisant un laser 488 nm. Trouvez le segment d'intérêt qui est perpendiculaire au chemin du faisceau et qui est bien visualisé, avec une bonne fluorescence GFP. Une fois que cette région a été identifiée, dessinez une région d'intérêt en utilisant une région d'intérêt elliptique (ROI).
- Accédez à "ROI" | "Dessinez le retour sur investissement Elliptique".
REMARQUE: ceci sera utilisé pour mesurer en permanence l'intensité moyenne de la GFP pendant la mise en photo, permettant l'administration d'une dose précise de traitement au laser.
- Accédez à "ROI" | "Dessinez le retour sur investissement Elliptique".
- Accédez à "Afficher" | "Contrôles d'acquisition" | "Zone de numérisation C2plus" et choisissez "Zone de balayage de bandes". Le masque rectangulaire apparaîtra dans cette interface. Définissez manuellement une fenêtre de numérisation rectangulaire à l'aide du curseur ( c.-à-d. Glisser, redimensionner et transformer le masque) pour couvrir le segment ciblé pour l'ablation au laser. Cliquez avec le bouton droit de la souris dansZone de masque pour accepter la sélection.
REMARQUE: seule la région sélectionnée sera numérisée. - Commencez la mesure du temps tout en surveillant le canal vert en utilisant uniquement le laser 488 nm pour activer GFP. Assurez-vous que l'intensité du laser 488 est relativement faible (~ 1%). Mesurez l'intensité moyenne de la GFP dans la région d'intérêt en sélectionnant "Mesurer" | "Mesure du temps". Utilisez les onglets "Graphique" ou "Données" pour surveiller les valeurs moyennes d'intensité dans le ROI.
REMARQUE: le taux d'acquisition est défini par le temps d'attente des pixels et la taille de la fenêtre rectangulaire définie à l'étape 3.9, mais en général, elle permet une surveillance rapide du signal (~ 2-10 images / s). - Induire les cellules rénales avec le laser violet (405 nm) en augmentant l'intensité à 100% en faisant glisser la commande "laser power" tout droit vers la droite. Le laser 488 nm peut rester actif si l'intensité est faible.
- Observer une ligne gRaph en utilisant l'onglet "Graphique" ou les valeurs numériques de l'intensité GFP à l'aide de l'onglet "Données" et attendez qu'il tombe au niveau souhaité, par exemple 50% de la ligne de base (comme le montre la Figure 1 ).
REMARQUE: Un laser de 20 mW a été utilisé dans le cadre de l'unité laser référencée (voir le tableau des matériaux ); L'intensité maximale peut varier selon les systèmes. Une intensité plus faible peut être compensée par une exposition plus longue ( c.- à - d. Utiliser le pourcentage de blanchiment des GFP comme mesure de l'exposition totale).
- Observer une ligne gRaph en utilisant l'onglet "Graphique" ou les valeurs numériques de l'intensité GFP à l'aide de l'onglet "Données" et attendez qu'il tombe au niveau souhaité, par exemple 50% de la ligne de base (comme le montre la Figure 1 ).
- Une fois que l'intensité GFP dans le ROI elliptique (étape 3.8) a chuté à un niveau désiré, diminuez immédiatement l'intensité du laser violet (405 nm) à "0" en déplaçant le curseur "laser power" tout le chemin vers la gauche dans Le panneau de contrôle du logiciel.
- Obtenir une nouvelle base de fluorescence GFP. Confirmez l'ablation en obtenant un rapport X / Y.
REMARQUE: voir la figure1B; Y = intensité moyenne avant l'ablation et X = intensité moyenne après l'ablation, en utilisant en moyenne 4 échantillons consécutifs dans le ROI. Le ratio cible exact (50%, 60%, etc. ) dépend de la quantité de blessure souhaitée pour une expérience donnée.
- Obtenir une nouvelle base de fluorescence GFP. Confirmez l'ablation en obtenant un rapport X / Y.
4. Microscopie temporelle avec coloration au moyen de l'iodure de propidium
- Appliquer des considérations générales de décalage temporel (décrites dans une étude précédente 15 ) pour visualiser la coloration de l'iodure de propidium comme un corrélat de la lésion des cellules rénales après la photoablation.
- Pré-incuber les larves dans une solution de iodure de propidium 30 μM (1% de DMSO dans E3-PTU) pendant 3 h avant l'incorporation et la photoïlation, comme décrit aux étapes 2 et 3.7, respectivement.
REMARQUE: Aucun iodure de propidium supplémentaire n'est nécessaire dans l'agarose ou la solution d'imagerie. - Induire une lésion rénale segmentaire, comme décrit aux étapes 3.1-3.12.
- Obtenir des piles d'images temporelles, en tant que décriDans une étude précédente 14 , à l'aide d'un laser à 488 nm (GFP) et d'un laser 461 nm (Iodure de propidium, PI).
NOTE: Les deux couleurs sont superposées dans des piles confocales pour corréler la disparition de GFP et l'apparition de la coloration au iodure de propidium. - Définissez les paramètres pour l'obtention des piles d'images temporelles comme suit: épaisseur de la tranche virtuelle = 4 μm, intervalle de pile z = 2 μm, durée de vie des pixels = 1,9 μs, dimensions de l'image = 512 x 512 et moyenne = 2.
REMARQUE: ces paramètres permettent un enregistrement continu d'intervalle de 10 à 15 minutes jusqu'à 4 larves et veille à ce qu'il y ait un minimum de photoblanchage de l'échantillon. - Utilisez un logiciel d'imagerie compatible avec le format de fichier d'enregistrement pour visualiser et analyser les données.
- Orientez la larve de telle sorte que le segment d'intérêt du rein soit perpendiculaire au trajet du faisceau tandis que le segment contralatéral est éloigné du faisceau laser (voir le film 1 ).
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Representative Results
Notez que ce protocole a été utilisé avec succès avec un certain nombre de lignes transgéniques GFP rénales, y compris ET (krt8: EGFP) sql11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 et Tg (atp1a1a.4: GFP). Les exemples de résultats présentés ici ont été obtenus en utilisant la ligne ET (krt8: EGFP) sqet11-9.
La figure 1 montre l'exemple de protocole de photoablation. L'intensité GFP moyenne est surveillée dans la région d'intérêt ( Figure 1A et Movie 1 ). Un exemple de trace d'intensité moyenne est illustré à la figure 1B .
Comme le montre la figure 2 , après exposition à une lumière laser de 405 nm, la fluorescence GFP continue de disparaître une cellule à la fois jusqu'à ce que, à 220 min, l'ensemble du groupe ablé perd 100% de sa positivité GFP. Cette perte de GFP fLa fluorescence est en effet due à la mort cellulaire et non pas, par exemple, à la régulation négative de l'expression GFP. Cela se traduit par l'apparition de noyaux positifs pour l'iodure de propidium fluorescent rouge dans les cellules qui perdent la positivité GFP.
L'ampleur de la mort cellulaire peut être évaluée en mesurant la fluorescence moyenne des GFP dans le segment ablé et en la comparant à l'intensité GFP moyenne immédiatement antérieure et postérieure au segment ablé. La figure 3 montre la relation entre l'étendue de l'exposition au laser (mesurée par la quantité initiale de photoblanchage) et l'étendue de la mort cellulaire dans le segment exposé. Cela montre que, en faisant varier l'exposition initiale, il est possible de "composer" la blessure et la réponse de l'épithélium blessé. Avec 10-20% du photoblanchissement GFP initial, pratiquement aucune réduction de la positivité GFP n'est observée à 5 h après les blessures. 50 et 60% de photoblanchissement entraînent une totale disparitionDe la GFP à 5 h, tandis que 30 et 40% de blanchiment entraînent des résultats intermédiaires, avec 50% des décès estimés observés à environ 35% de photoblanchage. Ces résultats sont supportés par la coloration PI ( Figure 3B ). 20% de photoblanchissement n'entraîne pas de coloration pratiquement nul à 100 min après l'ablation. 50% de photoblanchissement conduit à une positivité PI continue dans l'épithélium ablé après 60 minutes, tandis que 30 et 40% de photoblanchage conduit à une incorporation PI intermédiaire. Comme on peut le voir à partir de ces données, cette méthodologie permet l'induction de quantités graduées de lésion épithéliale et pour l'étude de la réponse épithéliale aux lésions mortelles et sub-létales.
Figure 1: Procédure de conversion de photo. ( A ) Schéma montrant l'orientation de l'embryon / larve, l'exposition au laser et la région d'intérêt (ellipse) measLa fluorescence moyenne pour surveiller la quantité de photoblanchissement GFP; Voir Film 1. La boîte rectangulaire indique la fenêtre de numérisation. ( B ) Un exemple d'une trace d'intensité GFP moyenne de région d'intérêt réelle avant, pendant et après une exposition au laser de 405 nm. Les intensités GFP moyennes sur quatre mesures consécutives (montrées à l'intérieur des boîtes vertes) sont indiquées avant (Y) et après (X) la photoablation. Le rapport X / Y est utilisé comme mesure de l'exposition totale à la lumière et est tracé sur l'axe X de la figure 3 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Mort de cellule épithéliale après exposition au laser de 405 nm. Exemples de cadres séquentiels montrant la disparition de GFP etD l'apparition de la coloration par l'iodure de propidium après la photoablation (40% de photoblanchage initial). Les cadres sont à 0, 130, 170 et 220 min après exposition à la lumière violette (405 nm). La disparition de GFP coïncide avec l'apparition de la positivité nucléaire PI fluorescente rouge. Veuillez noter que la fluorescence PrI est détectée en utilisant le canal rouge. La fluorescence rouge observée à l'extérieur du rein est due aux chromophores et à la présence de PI dans la lumière intestinale. Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Réponse de la dose de lésion épithéliale à la quantité de photoablation. ( A ) La mesure de la photo est mesurée par le pourcentage de réduction initiale de la fluorescence GFP dans les expositionsSegment ed. Ceci est comparé à la baisse de la fluorescence moyenne des GFP dans le segment blessé à 5 h post-blessure. Cette mesure est normalisée par rapport à la quantité moyenne de fluorescence en amont et en aval du segment blessé. Les doses cibles étaient de 10, 20, 30, 40, 50 et 60% du photoblanchage initial. Les montants réels sont légèrement plus importants, ce qui représente 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 et 62,1% de photoblanchissement, ce qui représente 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 et 37,9% de fluorescence restante, n = 2 - 6 / cible groupe. Les barres d'erreur représentent l'écart type le long des axes X (pourcentage de fluorescence restant immédiatement après la photoablation) et Y (pourcentage de fluorescence restante 5 h après la photo). ( BE ) La coloration IP est parallèle à la disparition globale de la positivité GFP. Pratiquement aucune coloration IP n'est observée à 20% (80% de fluorescence restante) photoblanchage à 100 minutes d'exposition post-laser ( B , panneau droit). ( C et
| Transgénique | Motif d'expression | Les références |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomérule, un PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distal to glomerulus | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distal to glomerulus | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | Late DT, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | Distal to glomerulus | [14] |
| Tg (CD41: GFP) | Cellules multi-coordonnées | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sql11-9 | PT droit, DT précoce | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | PT compliqué | [16,17] |
| PT = tube proximal | ||
| DT = Tubule Distal | ||
| PD - Dose Pronephric |
Film 1: Animation Résumé de la procédure de décalage de photo. Dans la première partie du film, l'orientation de l'embryon / larve est démontrée. Les deux branches du rein sont montrées en vert. Une sonde de verre est utilisée pour orienter le poisson dans l'agarose. Ceci est fait si une branche de contrôle, non blessée est souhaitée. La pêche au poisson permet l'exposition au laser sur une seule branche du rein pronephrique. Dans la deuxième partie du film, la procédure d'ablation par laser est décrite. L'ellipse indique la région d'intérêt dans le segment soumis à l'ablation utilisée pour surveiller la quantité de photobleac initialeHing. La fenêtre rectangulaire permet un réglage précis de la taille et de la position du segment ablé. Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)
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Discussion
Il convient de noter que la puissance laser totale varie selon les systèmes. Cependant, l'utilisation du pourcentage de photobloc GFP permet de lire l'énergie totale livrée au rein fluorescent, indépendamment de la variation de l'énergie laser et compensée par la durée d'exposition. Cependant, gardez à l'esprit que la réponse des différents tissus à cette méthode de photoablation varie. Même pendant la maturation des reins, il est significativement plus difficile d'obtenir une réduction de 50% de la fluorescence des GFP chez les embryons plus jeunes que dans les larves matures. Ces différences dans la réactivité des tissus à la photoablation devraient être prises en compte lors de la modification et de l'adaptation de ce protocole à différentes applications. Ainsi, il est essentiel de surveiller le pourcentage de réduction de la fluorescence GFP pour mesurer correctement la quantité de blessure et la réponse prévue de l'épithélium rénal blessé.
Les principaux avantages de cette méthode par rapport à d'autres méthodes de lésions rénales dansLe poisson zèbre est que cela permet un contrôle précis de l'emplacement spatio-temporel de la blessure. En outre, il permet aux chercheurs de composer le niveau de blessures vers le haut et vers le bas. Cette capacité à contrôler la quantité de blessure devrait permettre d'examiner les réponses des cellules épithéliales et devrait aider à la prise de décision en termes de récupération par rapport à l'apoptose par rapport à la nécrose. Par exemple, il est possible de montrer que la migration cellulaire est une réponse initiale de l'épithélium survivant à l'ablation segmentaire et que la prolifération cellulaire est un processus secondaire, entraîné par des forces mécaniques générées par la migration cellulaire 14 .
En plus de la capacité d'étudier le processus de réparation au niveau cellulaire, il existe d'autres avantages à cette méthodologie. Tout d'abord, les techniques de photoablation précédentes avaient un contrôle limité sur la quantité de photodamate 9 . Cependant, ce modèle permet un contrôle gradué de la quantité de blessure, ce qui faciliteMener des études futures. De plus, dans cette approche, il est possible de cibler des groupes arbitraires de cellules fluorescentes GFP, permettant ainsi une ablation facile de segments entiers. Bien que cela puisse être réalisé avec la technique du laser pulsé, il est plus laborieux, ce qui limite le potentiel de conception expérimentale. L'utilisation de GFP pour cibler et potentialiser les lésions épithéliales est un autre avantage, car il existe tant de poissons zèbre transgéniques GFP disponibles (le tableau 1 n'est qu'une liste partielle). D'autres protéines fluorescentes exprimées par des espèces transgéniques ont également été étudiées, telles que la protéine rouge Killer, mais ces transgéniques de poissons ne sont pas largement disponibles 16 . Un avantage supplémentaire de l'utilisation de GFP est que, avec différentes longueurs d'onde laser, l'expression GFP peut être utilisée soit pour la photoablation (405 nm), soit pour l'imagerie (488 nm). Cependant, il convient de noter que la méthode publiée par Johnson et al. 9 peut être appliqué à des éléments non fluorescentsLe poisson zèbre et peut donc être utilisé plus largement que cette approche.
Une autre limitation de ce modèle d'ablation par laser est qu'il peut ne pas prendre en compte tous les différents facteurs qui peuvent conduire à une IRA humaine. Il peut y avoir une chaîne d'événements qui mènent à la nécrose cellulaire dans le corps humain, ainsi que l'apoptose cellulaire qui est induite lors des blessures rénales. Il n'est pas clair si l'environnement différent produit lors de l'ablation par laser peut imiter tous les aspects de la pathophysiologie de l'IRA chez l'homme 10 . Néanmoins, ce modèle d'ablation au laser présente de nombreux avantages par rapport aux modèles alternatifs. En permettant l'étude de la mort et de la réparation des cellules rénales à haute résolution en temps réel, cette méthode devrait conduire à une meilleure compréhension des mécanismes de réparation des reins et jeter les bases de nouvelles approches du traitement AKI.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Iain Drummond et le Dr Vladimir Korzh pour avoir partagé des lignes transgéniques GFP rénales. Nous souhaitons également remercier NYITCOM de fournir les ressources nécessaires pour mener à bien ce travail. Cette étude a été partiellement soutenue par des subventions: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), et HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
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