Summary
ترتبط الأمراض المرتبطة بالعمر مع عيوب متعددة في مكونات السيتوبلازم. هنا، نقدم بروتوكول لإعداد الحويصلات غشاء البلازما من الخلايا الجذعية نخاع العظم الوسيطة. ويمكن استخدام هذه التقنية كوسيلة للعلاج استبدال السيتوبلازم لتحسين أو حتى عكس الظواهر المرتبطة بالعمر.
Abstract
لقد سبق أن أبلغنا عن توليد حويصلات غشاء البلازما (بمفس) من خلال البثق الميكانيكي للخلايا الثدييات. اندماج من بمفس مع خلايا Ro0 ناقصة الميتوكوندريا استعادة النشاط الانقسامي في ظل ظروف الثقافة العادية. تصلب الشرايين، داء السكري من النوع الثاني، مرض الزهايمر، والسرطان هي الأمراض المرتبطة بالعمر التي تم الإبلاغ عنها أن ترتبط بالعديد من العيوب الميكانيكية والوظيفية في السيتوسول وعضيات مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. الخلايا الجذعية الوسيطة النخاع العظم (بمسك) تمثل خلية فريدة من السكان من نخاع العظام التي تمتلك قدرات التجديد الذاتي مع الحفاظ على تعددها. مكملات خلايا الشيخوخة مع السيتوبلازم الشباب من بمسس ذاتي عن طريق الانصهار من بمفس يوفر نهجا واعدا لتحسين أو حتى عكس الظواهر المرتبطة بالعمر. يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد بمفس من بمسك عن طريق قذف من خلال غشاء البولي مع 31؛ م المسام، وتحديد وجود الميتوكوندريا وفحص الحفاظ على إمكانات الغشاء داخل بمفس باستخدام المجهر متحد البؤر، وتركيز بمفس بواسطة الطرد المركزي، وتنفيذ الحقن في الجسم الحي من بمفس في عضلة الساق من الفئران.
Introduction
وقد كرس قدرا هائلا من الجهد لوضع نهج للعلاجات الجينات والإنزيم، واستبدال الخلايا. وقد أدى هذا إلى اختراقات كبيرة وحتى التطبيقات السريرية 1 ، 2 ، 3 . في الآونة الأخيرة، تم تطبيق العلاج البديل الميتوكوندريا المثير للجدل على أساس تكنولوجيا نقل النواة إلى الإخصاب في المختبر للنساء في سن الشيخوخة أو تحمل طفرات الحمض النووي الميتوكوندريا القاتلة 4 . العيوب الموجودة في الأمراض المرتبطة بالعمر، بما في ذلك تصلب الشرايين، داء السكري من النوع 2، مرض الزهايمر، والسرطان، وعادة ما تكون متعددة الأوجه. وقد تم توثيق أن تراكم قطرات الدهون. وترسب البروتين اميلويد. الاحتفاظ بالبروتينات تكشفت في الشبكة إندوبلازميك. و بروتاسوم معيبة، أوتوفاغوسوم، والميتوكوندريا تسهم في تطوير أو تفاقم هذه الأمراض"كريف"> 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . في الوقت الحاضر، لا توجد آلية متاحة تهدف إلى معالجة مباشرة من خلل في السيتوسول والعضيات، والذي يسبب شيخوخة والشيخوخة المظاهر.
لقد ذكرنا سابقا على توليد حويصلات غشاء البلازما (بمفس) من خلال البثق الميكانيكي للخلايا الثدييات 12 . وباستثناء النواة، تم العثور على مكونات في الغشاء أو السيتوسول، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي الريبي، وكذلك العضيات، مثل الميتوكوندريا، في بمف. أساسا، يمكن أن ينظر إلى بمف على أنه خلية مصغرة مستأصلة. الأهم من ذلك، اندماج من بمفس مع خلايا Ro0 الناقصة الميتوكوندريا استعادة النشاط الانقسامي في ظل ظروف الثقافة العادية. هذا هو أول تقرير عن إستابليشينج نهجا يحتمل أن تكون فعالة لعلاج السيتوبلازم استبدال.
نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة (بمسك) هي الخلايا السلف متعددة الأشكال التي يتم إنشاؤها بشكل روتيني من نخاع العظام ويتم توسيعها بسهولة في الثقافة. وقد تم الكشف عن علامات الخلايا الجذعية الجنينية Oct4، نانوغ، و SOX2 عند مستويات منخفضة في مسس 13 . نشاط تيلوميراز هو أيضا قابلة للقياس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم وجود جزيئات التحفيز المشترك وجزيئات مستضد الكريات البيض البشرية (هلا) من الدرجة الثانية، فضلا عن انخفاض هلا الفئة الأولى التعبير على اللجان الدائمة، وجعلها خلايا مثالية ل ألوجنيك، أو "من على الرف"، واستخدام في سواء الطب التجديدي والتطبيقات المناعية 14 .
هنا، نحن تصف كيفية إعداد بمفس من الماوس بمسس عن طريق قذف من خلال غشاء البولي مع المسام 3 ميكرون، وتحديد وجود الميتوكوندريا ودراسة الحفاظ على إمكانات الغشاء في بمفس باستخدام كونفوكالمجهر، وإعداد المركزة بمفس ولكن لا تجميعها بواسطة الطرد المركزي، وتنفيذ الحقن في الجسم الحي من بمفس في عضلة الساق من الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء 8 إلى 12 الفئران بالب / ج عمرها أسبوع واحد من مركز شنغهاي التجريبية الحيوانية (شنغهاي، الصين)، وتربية في منشأة حيوانية خالية من مسببات الأمراض ومكيفة محددة. وكانت رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية متوافقة مع المبادئ التوجيهية لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية التي أنشأتها جامعة شانتو.
1. جمعية الجهاز
- لضمان العقم، بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية من هود ثقافة الأنسجة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- فك وحدة تصفية 25 مم القابل للتصرف وغمر غطاء وأسفل الوحدة في كوب زجاجي 200 مل مليئة الايثانول 75٪ لمدة 30 دقيقة. تتكون الوحدة من البولي بروبلين الطبي.
- التقاط غطاء وأسفل الوحدة باستخدام ملقط، هزة من الايثانول المتبقية باليد، والسماح للأجزاء للهواء الجاف لمدة 10 دقيقة في غطاء محرك السيارة.
- الرطب غشاء البولي 19 ملم في برنامج تلفزيوني ووضعه بعناية على رأس مصفوفة دعم بوتوم من الوحدة. فيلم البوليمر لديه على نحو سلس، سطح مستو والمسار المحفور 3 ميكرون المسام.
- أعد تجميع الوحدة عن طريق شد الغطاء بإحكام ضد القاع. تأكد من أن الغشاء لا يتم إزاحة من المركز.
- إزالة الإبرة من حقنة الأنسولين 1 مل ورسم 1 مل من برنامج تلفزيوني. إرفاق حقنة إلى وحدة التصفية ومن ثم دفع برنامج تلفزيوني من خلال وحدة لرطب التجمع واختبار إذا كان هناك أي تسرب.
2. جيل من حويصلات غشاء البلازما (بمفس)
- إنشاء ثقافة بمسك، كما ذكرت نيميث وآخرون. 15 ، في وسط ثقافة دمم تحتوي على 15٪ فبس و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. زراعة الخلايا في لوحة 6 جيدا في حاضنة ترطيب تحتوي على 5٪ كو 2 عند 37 درجة مئوية.
- لنشر الخلايا، وإزالة الوسط والثقافة وشطف جيدا مع 0.5 مل من بس خالية من الكالسيوم.
- إضافة 0.5 مل من 0.25٪ التربسين-إدتا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئويةلمدة 3 دقائق. اضغط على لوحة ضد كف اليد بضع مرات لتسهيل مفرزة الخلية. وقف الهضم بإضافة 1 مل من الوسط الثقافي.
- جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل وتدور في 200 x ج لمدة 2 دقيقة في جهاز الطرد المركزي أعلى مقاعد البدلاء. ريسوسبيند الخلايا في 4 مل من زراعة المتوسطة وقسامة الخلايا إلى بئرين من لوحة 6 جيدا.
ملاحظة: الخلايا تصل عادة التقاء في حوالي 24 ساعة. - لتوليد بمفس، وحصاد الخلايا من بئر واحدة (حوالي 5 × 10 5 خلايا) من لوحة 6 جيدا عن طريق التريبسين الهضم و مونوديسبيرز الخلايا في 0.5 مل من وسط الاستزراع.
- تحميل الخلايا في حقنة الأنسولين، إرفاقه إلى وحدة التصفية، ودفع المكبس بسرعة للضغط على الخلايا من خلال التصفية. تجاهل المتوسطة مقذوف لأنه يجب أن يكون هناك سوى بضعة بمفس داخله.
- تحميل 0.5 مل إضافية من المتوسطة في حقنة ودفعه بسرعة من خلال مرشح. جمع وسط القذف الثاني، التي تحتوي علىs بمفس من مختلف الحجم.
- تحميل 150 ميكرولتر من الوسط الذي تم جمعه إلى طبق من الزجاج 35 ملم القاع والسماح لل بمفس لتسوية إلى أسفل لمدة 10 دقيقة. فحص بمفس تحت مقلوب المرحلة المجهر المقابل مجهزة كاميرا كسد باستخدام عدسة الهدف 20X.
3. فحص المحتوى داخل بمفس باستخدام المجهري متحد البؤر
- لتنفيذ ترنسفكأيشن في بمسك، تمييع 2 ميكروغرام من دنا البلازميد سوبيركويلد و 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن الموجبة (على سبيل المثال، بوليجيت) في 50 ميكرولتر من دمم خالية من مصل الدم. دوامة لخلط جيدا وتدور لفترة وجيزة لجمع كل السائل من جانبي الأنبوب.
- إضافة الحل المخفف (من الخطوة 3.1) قطرة في حل الحمض النووي المخفف، دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة، وتدور لفترة وجيزة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- استبدال المتوسطة القديمة على بمسكس، التي تم تصنيفها في حوالي التقاء 30٪ بين عشية وضحاها، مع 2 مل من وسط ثقافة جديدة وإضافة دنA ترنسفكأيشن خليط قطرة.
- استبدال مع 2 مل من المتوسطة الطازجة بعد 12 ساعة من ترنسفكأيشن.
- لتتبع البروتينات المحلية سيتوبلازماسيكالي، ترانسفيكت الخلايا مع البلازميد تحتوي على كاسيت التعبير إغف (بيجف-N1)، كما هو موضح أعلاه. حصاد الخلايا عن طريق التربسين الهضم 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن لجيل بمف، كما هو موضح أعلاه.
- لتتبع الميتوكوندريا، وصمة عار الخلايا مع صبغ الميتوكوندريا (1 ميكرومتر، ميتوتراكر) في وسط ثقافة جديدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- للكشف عن إمكانات الغشاء من الميتوكوندريا، وصمة عار الخلايا مع سيانين صبغ جس-1 (5،5 '، 6،6'-تيتراكلورو -1،1'، 3،3'- تيترايثيلبنزيمي-دازوليلكاربوسيانين يوديد) (10 ميكروغرام / مل) في وسط الزراعة الطازجة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ومن ثم حصاد الخلايا عن طريق التربسين الهضم لجيل بمف، كما هو موضح أعلاه.
- تحميل 150 ميكرولتر من ميد جمعهاأيوم في طبق من الزجاج القاع 35 ملم والسماح لل بمفس لتسوية إلى أسفل لمدة 10 دقيقة. فحص بمفس تحت المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة الهدف النفط 100X.
- للكشف عن إغف أو صبغ الميتوكوندريا، بدوره على الليزر 488 نانومتر وجمع إشارة في 505-530 نانومتر. للكشف عن جس-1، تشغيل الليزر 488 نانومتر و 543 نانومتر وجمع الإشارات في 505-530 نانومتر و 560-615 نانومتر. تعيين قيمة الثقب إلى حوالي 1.4.
4. إعداد بمفس المركزة بواسطة الطرد المركزي
- حصاد الخلايا عن طريق التربسين الهضم وتوليد بمفس، كما هو موضح أعلاه، في 0.5 مل من وسط الثقافة.
- تدور بمفس في 1200 x ج في الطرد المركزي بينشتوب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح بعناية طاف و ريسوسبيند بيليه في 100 ميكرولتر من وسط الثقافة مع دوامة لطيف.
- تحميل 50 ميكرولتر من بمفس في طبق 35 مم الزجاج السفلي والسماح لهم لتسوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. فحص بمفستحت المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة الهدف النفط 40X.
- إضافة سلسلة من محلول بولي إثيلينيمين المخفف (بي) إلى ثقافة بمسك لمدة 1 ساعة والتحقق من وجود علامات السمية الخلوية.
ملاحظة: هنا، تم اختيار بي في 2 ميكروغرام / مل لأنه لم يتم الكشف عن أي علامة على سمية في بمسك. - حصاد الخلايا عن طريق التربسين الهضم وإضافة بي في 2 ميكروغرام / مل لمدة 1 ساعة لشحن غشاء الخلية كوسيلة لمنع التجميع. توليد بمفس، كما هو موضح أعلاه، في 0.5 مل من وسط الثقافة. تركيز بمفس وفحصها تحت المجهر متحد البؤر، كما هو موضح أعلاه.
5. حقن بمفس في العضلات غاسترونيميوس
- لصمة عار الغشاء، إضافة سم-دي (الكلوروميثيل ديكال-إندوكاربوسيانين) (10 ميكرومتر) صبغ في 1 مل من وسط ثقافة جديدة إلى بمسك لمدة 30 دقيقة.
- حصاد الخلايا (حوالي 5 × 10 5 ) عن طريق التربسين الهضم و ريسوسبيند لهم في 0.5 مل من وسط الثقافة. إضافة بي (2 ميكروغرام / مل) ل 1ح. توليد وتركيز بمفس في 100 ميكرولتر من الوسط والثقافة، كما هو موضح أعلاه.
- تخدير بال / c الماوس عن طريق حقن الصوديوم باربيتال (10 ملغ / كلغ) بعد 12 ساعة من الصيام.
- تنظيف خارج العضلات الساق مع 75٪ من الإيثانول. حقن ببطء بمفس (100 ميكرولتر) في عضلة الساق باستخدام حقنة الانسولين 30 G.
- بعد إعطاء التخدير، ضع الشاش الرطب على العينين لمدة التجربة ودافئة الماوس مع ضوء ساطع حتى يستيقظ. منزل الماوس وحده في قفص التهوية الفردية.
- لحصاد العضلة الساق 12 ساعة بعد العملية، وقتل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- رش الإيثانول 75٪ على عضلة الساق، وفتح الجلد مع مقص، وقطع كامل عضلة الساق في كلا الطرفين.
- شطف العضلات مع برنامج تلفزيوني ودراسة تحت المجهر مضان باستخدام عدسة الهدف 20X.
- تقليم العضلات معشفرة حلاقة حادة لإزالة الأجزاء مع عدم وجود مضان. قطع الأجزاء مع مضان أحمر قوي في حوالي 9 ملم 3 مكعبات.
- تضمين كل مكعب في الأمثل درجة حرارة القطع المتوسطة (أكتوبر)، غمره في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق، وتخزينه في الفريزر -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- قطع المقاطع المجمدة إلى قطع 20 ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد والتمسك كل قسم على شريحة زجاجية. شطف القسم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- رسم دائرة حول القسم مع القلم دائرة وصمة عار وإضافة 100 ميكرولتر من دابي (1 ميكروغرام / مل). نضح الحل دابي بعد 10 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة في الظلام وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إسقاط تصاعد النفط على العينة، وتغطيته مع زلة الزجاج، وختم الشريحة مع طلاء الأظافر. فحص القسم تحت المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة الهدف النفط 100X.
- للكشف عن سم-دي، بدوره على الليزر نانومتر 543 وجمع إشارة في 560-615 نانومتر. لاكتشاف دابي، شغل 405نانومتر الليزر وجمع إشارة في 420-480 نانومتر. تعيين قيمة الثقب إلى حوالي 1.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مفتاح الإعداد الناجح لل بمفس يعتمد بشكل كبير على التجمع الصحيح للوحدة مرشح ( الشكل 1 )، والتي يمكن اختبارها عن طريق دفع 1 مل من برنامج تلفزيوني من خلال الغشاء. في حالة حدوث تسرب، أعد تجميع وحدة المرشح واختبر مرة أخرى. ومع ذلك، لا يمكن إلا أن يتم اختبار تسرب موثوق عندما يتم دفع الخلايا من خلال الغشاء. إذا تم الكشف عن عدد قليل فقط من بمف تحت المجهر العادي باستخدام الهدف 10X، أو إذا كان حجم بمف في الغالب حوالي 1 ميكرون، وهذا من شأنه أن يشير إلى أن معظم الخلايا محاصرين داخل الوحدة بسبب التجمع غير صحيح. بمفس مع حجم في حدود حوالي 3 ميكرون في القطر كانت سائدة عند فحصها تحت المجهر المرحلة النقيض باستخدام الهدف 20X ( الشكل 2 ). منذ بمفس من حجم نانومتر لم تصور بسهولة، كانت نسبة كبيرة بمفس من حيث العدد منخفضة. وقد تبين أن من المفيد الضغط على حقنة بسرعة لإعادةدوس كمية من الحطام الغشاء، والتي على ما يبدو فشل لتشكيل بمفس كروية. وعلاوة على ذلك، تم العثور على بمفس أحجام أصغر (أقل من 1 ميكرون) في وسط البثق الأول، مع أكبر بمفس استردادها في البثق الثاني.
وكان الجانب الأكثر تميزا من بمفس هو ضم المكونات الخلوية جانبا من النواة 12 . تم ترانزفكتد بمسك مع كاسيت التعبير من إغف لمدة 48 ساعة قبل استخدامها لإعداد بمف. وأظهرت النتائج أن البروتين إغف محلية سيتوبلازميا يمكن مغلفة في بمفس ( الشكل 3A ). وقد ثبت الضميمة من الميتوكوندريا من تلطيخ صبغ الميتوكوندريا، والتي تبين أن جزءا كبيرا من، ولكن ليس كل، بمفس تحتوي على النقاط الفلورية الخضراء، مؤشرا على الميتوكوندريا ( الشكل 3 ). بعض من بمفس، حتى تلك التي يبلغ قطرها كبيرة مثل 3 ميكرون، لم تظهر أدلة على احتواء الميتوكوندريا، مما يشير إلىفي بعض القيود الميكانيكية قد تمنع تغليف الميتوكوندريا في بمفس. تم الكشف عن إمكانات الغشاء من الميتوكوندريا التي تلطيخ جس-1، والتي تنبعث مضان أحمر عندما الميتوكوندريا لديها إمكانات طبيعية. وتظهر النتيجة أن مضان أحمر في الواقع تم الكشف عن في بمفس ( الشكل 3 )، في حين أن مضان الأخضر لم يتم الكشف عنها (لا تظهر البيانات)، مما يشير إلى أن الميتوكوندريا داخل بمفس كانت وظيفية.
وهناك حاجة إلى عملية تركيز ل بمفس، وخاصة بالنسبة للتطبيق في الجسم الحي للحد من حجم وكذلك لإزالة المكونات الخلوية صدر خلال قذف. بعد الطرد المركزي في 1200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تم العثور على عدد قليل جدا من بمفس من حجم أصغر في طاف. لتسهيل إعادة تعليق بيليه، تم استخدام أنبوب 2-مل جولة القاع للطرد المركزي. ومع ذلك، فإن معظم بمف تم تجميعها في بيليه، وخاصة Pمفس أحجام أصغر ( الشكل 4 ). وربما يرجع ذلك إلى جزيئات الالتصاق على الغشاء. وبالتالي تم تكملة الوسيط مع بي (2 ميكروغرام / مل)، الذي تم تصميم تركيزه ليس له سمية للخلايا ملحوظة. شحنة إيجابية من بي تعلق على غشاء الخلية منع تجميع بمفس أثناء الطرد المركزي ( الشكل 4 ).
وأخيرا، وصفت أغشية بمسك مع سم-دي صبغ قبل إعداد بمفس ( الشكل 5 ). بعد التركيز، تم حقن بمفس في عضلات الساق من الفئران، والتي تم حصادها 12 ساعة بعد العملية وفحصها تحت المجهر متحد البؤر. تم فحص أقسام المجمدة من عضلة الساق لوجود مضان أحمر، الذي تم الكشف عنه داخل ميوفيبر ( الشكل 5 )، مما يدل على أن بمفس تم تسليمها إلى السيتوبلازم، وربما عن طريق الإلتقام. من المذكرة، فلوري الأحمر تم العثور على سنس حول محيط ميوفيبر (لا تظهر البيانات)، مشيرا إلى أن جزء كبير من بمفس إما لم إندوسيتوسد أو كانت فقط في بداية الإلتقام في 12 ساعة بعد الحقن.
الشكل 1: تجميع وحدة المرشح. ( أ ) الأغشية البولي المتاحة تجاريا. ( B ) المسام محفورا المسار من 3 ميكرون في القطر، ينظر تحت المجهر الضوئي مع هدف 20X. شريط مقياس = 50 ميكرون. ( C ) وضعت الغشاء على رأس المصفوفة الداعمة لوحدة تصفية يمكن التخلص منها. ( D ) وحدة تصفية تجميعها مع غشاء داخل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الصفحة = "1"> 
الشكل 2: توليد بمفس من بمسك. ( A ) تم زراعة بمسك من الفئران في لوحة 6 جيدا. ( ب ) بمسك (5 × 10 5 ) تم حصادها عن طريق التربسين الهضم و مونوديسبيرسد في 500 ميكرولتر من الوسط والثقافة. وقد أخذت صور من بمسس المرفقة ومعلق تحت مجهر بصري مع هدف 20X. ( C ) تم تحميل الخلايا في حقنة الأنسولين قبل أن تعلق على وحدة التصفية. ( D ) تم تحميلها بمفس المولدة من بمسك في طبق القاع 35 ملم وفحصها تحت مجهر مقلوب المرحلة مقلوب باستخدام عدسة الهدف 20X. مقياس الحانات = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليس / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
الشكل 3: الكشف عن محتوى بمف بواسطة المجهر متحد البؤر. وقد تم إنشاؤها بمفس من ( A ) بمسكس ترانزفكتد مع بيغف-N1 لمدة 48 ساعة لتتبع البروتين إغف المترجمة سيتوبلاسميكالي، ( B ) بمسكس ملطخة صبغ الميتوكوندريا (1 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة لتتبع وجود الميتوكوندريا، أو ( C ) بمسك تلطيخ مع جس-1 (10 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة لتأكيد إمكانات الغشاء من الميتوكوندريا. تم تحميل بمفس ولدت من بمسك على طبق من الزجاج القاع 35 مم وفحصها المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة الهدف النفط 100X. مقياس الحانات = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تركيز بمف s بواسطة الطرد المركزي. تم حصاد بمسك (5 × 10 5 ) عن طريق الهضم التربسين ومعلق في 0.5 مل من الوسط الثقافي، والتي تم استكمالها مع أو بدون 2 ميكروغرام / مل من بي. تم نسج بمفس ولدت في 1200 غرام لمدة 5 دقائق، معلق في 100 ميكرولتر من الوسط والثقافة، وفحصها تحت المجهر متحد البؤر مع هدف النفط 40X. ( A ) تخطيطي من بمف التجميع ربما الناجمة عن تفاعل جزيئات الالتصاق بعد الطرد المركزي. ( B ) تخطيطي من بمفس الحفاظ على مونوديسبرزيون بعد اتهامه مع بي. ( C ) بمف المجمعة بعد الطرد المركزي. ( D ) بمفس تظهر أقل التجميع بعد الطرد المركزي بسبب الشحن الإيجابي مع بي. مقياس الحانات = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
غور 5 "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
الشكل 5: تسليم بم-دي-بمف المسمى لعضلة الساق. تم إنشاء بمفس من 5 × 10 5 بمسك، تتركز بواسطة الطرد المركزي في حجم 100 ميكرولتر، وحقن ببطء في عضلة الساق من الماوس بالب / ج. ( A ) تخطيطي من حقن بمف. ( ب ) بمسك المسمى مع سم-دي. شريط مقياس = 20 ميكرون. ( C ) بمفس ولدت من سم-دي-بمس المسمى وفحصها المجهر متحد البؤر. شريط مقياس = 10 ميكرون. ( D ) غاسترونيميوس العضلات تحصد 12 ساعة بعد العملية. شريط مقياس = 20 ميكرون. ( E - H ) قسم المجمدة من عضلة الساق فحصها من قبل المجهر متحد البؤر. شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة لي كا شينغ، ومشروع جامعة قوانغدونغ رفيع المستوى "التكنولوجيات الخضراء للصناعات البحرية"، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (http://www.nsfc.gov.cn/ منحة رقم 30971665، 81172894، 81370925)، وقسم التعليم في قوانغدونغ (http://www.gdhed.edu.cn/ منحة رقم cxzd1123).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 mL |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/mL |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75,000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H.
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
