Summary
Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.
Abstract
Nieuwe technologieën die gebruikmaken van de capillaire gebaseerde immunoassay beloven eiwit sneller en meer kwantitatieve beoordeling ten opzichte van traditionele immunoassay. Gelijkaardig aan andere testen antilichaam gebaseerde eiwit, optimalisatie van capillaire gebaseerde immunoassay parameters, zoals de eiwitconcentratie, antilichaam verdunning en de blootstellingstijd is echter een belangrijke voorwaarde voor het genereren van zinvolle en betrouwbaar gegevens. Metingen moeten vallen binnen de lineaire reeks van de test waar veranderingen in signaal zijn recht evenredig met de veranderingen in de concentratie van de lysate. Het proces van het kiezen van de juiste lysate concentraties, antilichaam verdunningen en blootstelling tijden in de menselijke bronchiale epitheliale cellijn, BEAS-2B, is hier aangetoond. Assay lineariteit wordt weergegeven over een aantal hele cel extract eiwit concentraties met p53 en α-tubuline antilichamen. Een voorbeeld van signaal burnout is te zien op de hoogste concentraties met lange belichtingstijden en een α-tubuline antilichaam verdunning kromme wordt weergegeven met het aantonen van verzadiging. Daarnaast worden voorbeeld experimentele resultaten gerapporteerd voor Doxorubicine behandelde cellen met behulp van geoptimaliseerde parameters.
Introduction
Capillaire elektroforetische immunoassay eiwit expressie in de cel lysates met behulp van grootte of heffing scheiding systemen meten en bieden verschillende voordelen ten opzichte van de traditionele immunoassay. Bijvoorbeeld, in vergelijking met westelijke vlek, de geautomatiseerde capillair gebaseerde procedure elimineert de noodzaak voor gels, transfer devices, en handleiding wast. Bovendien, is de absolute hoeveelheid eiwit nodig ongeveer 10 keer minder, waardoor capillaire gebaseerde systemen ideaal voor gebruik met zeldzame celtypes of beperkte steekproef1,2. Resultaten worden verkregen in zo weinig als 3 h met gebruikmaking van geautomatiseerde systemen en hebben eerder aangetoond meer kwantitatieve en reproduceerbare dan conventionele westelijke vlek procedures3,4,5. Het proces voor de grootte gebaseerde testen bestaat uit het laden van de monsters met natrium dodecyl sulfaat (SDS), dithiothreitol (DTT), en fluorescently label molecuulgewicht markeringen in capillaire kolommen met stapelen en scheiding matrices. Spanning toegepast op de haarvaten scheidt de eiwitten in de monsters volgens grootte en UV-licht ummobiliseerd de gescheiden eiwitten van de capillaire wanden. Het capillair is dan immuno-gesondeerd met doelgroepen gerichte primaire antilichaam en horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam. Luminol en peroxide katalyseren chemiluminescentie lichte generatie die is gemeten door een lading gekoppelde apparaat (CCD) camera en geanalyseerd om te kwantificeren van eiwit.
Ondanks de relatief gemak en de snelheid van een geautomatiseerde capillair gebaseerde elektroforetische immunoassay platform is optimalisatie van assay voorwaarden zoals eiwitconcentratie, antilichaam verdunning en de blootstellingstijd belangrijk voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare resultaten. In het algemeen moeten de volgende procedures voor het optimaliseren van een assay voor deze systemen worden uitgevoerd:
1) een scherm moet worden uitgevoerd om te evalueren en kies antilichamen voor signaal en specificiteit naar het doel van het eiwit. Indien beschikbaar, kan gezuiverde eiwit of doel epitoop worden gebruikt voor het beoordelen van specificiteit; het is echter nog steeds belangrijk voor het beoordelen van mogelijke niet-specifieke signaal in totaal eiwit afkomstig uit de modelsysteem.
2) vervolgens moet het dynamisch bereik van de bepaling worden vastgesteld. In een ideale situatie, wordt signaal verdubbeling (gemeten met behulp van piekoppervlakte) waargenomen als monster concentratie is verdubbeld; echter in de praktijk is een evenredige wijziging in signaal om in te voeren op een voorspelbare wijze (bijvoorbeeldlineaire passen) voldoende voor eiwit kwantificering. Bovendien, zal deze optimalisatie eiwitconcentratie met hoog signaal maar nog steeds binnen het lineaire bereik voor de experimentele model bepalen.
3) Bepaal de concentratie van de optimale antilichaam met behulp van de vaste eiwitconcentratie gekozen in stap 2 van de optimalisatie. Aangezien de antilichaam-concentratie stijgt, loopt het signaal op tot het randplateau bij verzadiging. De concentratie van een antilichaam in de buurt van deze saturatie niveau is vereist voor nauwkeurige meting van de eiwitconcentratie.
Het proces waarmee eiwit concentraties, antilichaam verdunningen en blootstelling tijden voor een geautomatiseerde capillair gebaseerde grootte assay6 optimaliseren is aangetoond door middel van de hele cel extracten van BEAS-2B, een SV-40 getransformeerd mens bronchiale geïsoleerd epitheliale cellijn. Eiwit isolatie van extracten van de cel of het weefsel kan worden uitgevoerd met behulp van een aantal gepubliceerde protocollen7,8,9 en worden hier niet behandeld. Uitkomsten van een proef experiment met de geoptimaliseerde voorwaarden worden ook gemeld voor totaal en phosphorylated (serine 15, serine 20) p53 in culturen blootgesteld aan Doxorubicine (een gemeenschappelijk chemotherapeutische agent die cel apoptosis10 induceert) 1.2, 1.8, en 2.4 µg/mL media voor 4 h voorafgaand aan de oogst. De p53 piek gebieden zijn genormaliseerd naar ɑ-tubuline, die wordt gebruikt als een besturingselement laden.
Protocol
Opmerking: ervoor zorgen dat alle reagentia en monsters zijn bereid volgens de fabrikant ' s-protocol, zoals hieronder beschreven. Gelieve correcte persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens deze procedure, waarin nitril handschoenen, laboratoriumjas, gesloten-toed schoenen en veiligheidsbril dragen. Een tabel van specifieke materialen, reagentia en apparatuur die nodig is afzonderlijk verstrekt. Totaal eiwitconcentratie van monsters moet worden bepaald vooraf met behulp van gevestigde methoden die compatibel met de lysate buffer gebruikt, zijn zoals Bradford assay 11.
1. bereiding van de monsters en reagentia van de standaard pack als opgegeven door de fabrikant
- om te bereiden de 400 mM werkende oplossing van dithiothreitol (DTT), voeg 40 µL gedeïoniseerd water naar de duidelijke buis met de meegeleverde voorraad van de fabrikant. Het is belangrijk om te voorkomen dat de invoering van bubbels om de oplossing door het mengen van de oplossing met langzame en zachte pipetteren.
- Voeg toe 20 µL 10 X monster buffer en 20 µL van de bereid 400 mM DTT oplossing aan de roze buis met fluorescerende 5 X master mix (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: De Master Mix (MM) die door de fabrikant met een folie omslag is verzegeld en moet worden doorboord door een tip van de pipet. Meng zachtjes door langzame pipetteren te vermijden DTT spetteren in de pipet.
Vervolgens voegt u - toe 16 µL gedeïoniseerd water, 2 µL van 10 X monster buffer en 2 µL van de bereid 400 mM DTT oplossing aan de witte biotinyleerd ladder buis geleverd door de fabrikant geleverd. Meng voorzichtig en breng kwantitatief over in een tube van 0,6 mL voor denaturering.
- Voorbereiden 0.1 x monster buffer door verdunning van de meegeleverde 10 X oplossing 1:100 met water. Bereiden van genoeg 0.1 x monster buffer om te verdunnen van alle monsters.
- Berekent het bedrag van 0,1 x monster buffer die wordt toegevoegd aan een monster, dat af van de gewenste eindconcentratie van de totale proteïne hangt. Meng 1 deel 5 x TL MM met 4 delen verdunde monster te bereiken van de gewenste uiteindelijke eiwitconcentratie.
- Berekenen volumes als volgt: (i) Volume 5 x TL MM = (gewenste uiteindelijke eiwitconcentratie) / 5; (ii) hoeveelheid eiwit voorraad = (gewenste uiteindelijke eiwitconcentratie x totale benodigde volume) / eiwit voorraad concentratie; (iii) volume 0.1 x monster buffer = totaalvolume - 5 x MM volume - eiwit voorraad volume.
2. Denaturatie van monsters en ladder
- plaats bereid monsters en biotinyleerd ladder in een 95 ° C warmte blok voor 5 min. Vortex buizen onmiddellijk na incubatie, voeren een spin voor ~ 5 s in een tafelblad centrifuge en op ice.
Opmerking: Sommige eiwitten mogelijk zachter denatureren voorwaarden (bijvoorbeeld, 70 o C gedurende 10 minuten) preventie van aggregatie van eiwitten en verbetering van de migratie in de capillaire matrix. Overwegen deze optie als er zware smeren op het hoger molecuulgewicht (zie video bijvoorbeeld).
3. Voorbereiding van antilichamen
- zoals bepaald door optimalisatie (Zie Vertegenwoordiger resultaten en video), bereiden de gewenste dilution(s) van primair antilichaam (bijvoorbeeld, 1:50, 1:100) in het meegeleverde antilichaam Verdunningsmiddel 2.
Opmerking: Antilichamen worden meestal gebruikt bij hogere concentraties voor viscometerbuizen gebaseerde immunoassay dan voor de traditionele westelijke bevlekken. De meegeleverde secundair antilichaam is klaar voor gebruik zonder verdunning.
4. Voorbereiding van Luminol-S en Peroxide
- bereiden een 1:1-mengsel van luminol-S en peroxide.
- Vortex te mengen en bewaren op ice.
Opmerking: Het is belangrijk dat dit mengsel voor elk experimenteel assay vers is bereid. 250ul totale mix is nodig om te draaien een volledige plaat.
5. Voorbereiding van de test-plaat
- zoals weergegeven in Figuur 1, laden de monsters en reagentia bereid boven in de assay-plaat. Zie gedetailleerde instructies hieronder voor elke rij. Om te minimaliseren van verdamping uit de putten, ervoor zorgen dat het deksel van de plaat is vervangen tussen reagens toevoegingen.
- In rij A, Pipetteer 5 µL van biotinyleerd Ladder in goed A1. Voor de resterende rij, Pipetteer bereid monsters (elk 5 µL) in putten A2-A25.
Opmerking: Het is absoluut noodzakelijk dat de A1 ook altijd ladder bevat, zoals de eerste capillair in de cartridge is geoptimaliseerd voor het uitvoeren van deze standaard. - In rij B, Pipetteer 10 µL van antilichaam verdunningsmiddel 2 in elk putje (B1-B25).
- In rij C, Pipetteer 10 µL van antilichaam verdunningsmiddel 2 in goed C1. In de resterende rij C wells, Pipetteer 10 µL van primair antilichaam (wells C2-C25).
- In rij D, Pipetteer 10 µL van daar-HRP in goed D1. In de resterende rij D wells, Pipetteer 10 µL van secundair antilichaam (wells D2-D25).
- In rij E, Pipetteer 10 µL van de vers bereide luminol-peroxide mix in elk putje (E1-E25).
- Ten slotte, voeg 500 µL was buffer plaatsen per compartiment aan elk van de top 3 rijen van buffer wells.
Opmerking: Het is belangrijk om te minimaliseren van de luchtbel vorming door zachtjes pipetteren en niet het verdrijven van het uiteindelijke volume van de tip zoals bubbels kunnen interfereren met het capillair laden en uitvoeren. - Zodra alle putjes zijn geladen, centrifugeer de plaat bij ~ 1000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bubbels verwijderen en ervoor zorgen dat de vloeistof is in de bodem van de putten. Pop zichtbare bellen met een kleine pipet tip of schone naald (bv, 25 meter steriele " rep top " naald).
Figuur 1 . Pipetting sjabloon voor assay plaat. Juiste reagentia en monsters (tot 24 totaal) toegevoegd aan de plaat assay vertegenwoordigt kleurcodering. Toevoegen van biotinyleerd ladder aan goed A1 (oranje), bereid monsters uit putten A2 tot A25 (lichtblauw), antilichaam verdunningsmiddel 2 putjes B1-B25 en C1 (lichtgroen), primair antilichaam aan putjes C2 tot C25 (blauw), streptavidine-HRP aan goed D1 (donker roze), secundair antilichaam aan Wells D2 tot D25 (donkergroen), en luminol-peroxide mix aan putjes E1 tot E25 (paars). Wash-buffer wordt toegevoegd aan de eerste drie rijen van de grotere halverwege plaat wells (donkerblauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
6. starten van de capillaire immunoassay instrument
- Zorg ervoor dat het instrument en de bijbehorende computer zijn ingeschakeld. Geen warming-up tijd nodig is.
- Open de instrumentatie-software op de computer. Selecteer eerst de " Assay " tabblad aan de rechterkant van het venster en " nieuwe Assay " onder het " bestandsmenu " aan de linkerkant. Selecteer de grootte, groottewaaier (bijv., 12-230 kDa) en cartridge type (bijvoorbeeld, 25 capillair) dat werd gebruikt voor de bijzondere assay.
Opmerking: Één mei ook input assay parameters, inclusief eiwitconcentratie, type antilichaam en verdunning, indien gewenst, maar deze zijn niet vereist voor voorsprong de assay. - De deur van het instrument door het indrukken van de knop op de bovenzijde van het oranje paneel openen.
- Verwijder zorgvuldig de capillaire cassette uit de verpakking. Zonder het aanraken van de haarvaten van het glas zelf, plaatst u de cartridge in de houder van de cartridge. Controleer of cartridge zitplaatsen door het observeren van de interieurverlichting wijzigen van orange naar blauw.
- Houdt de plaat stevig op de Bank en zorgvuldig afschilferen van het zegel van de verdamping van het onderste gedeelte van de plaat. Pop bubbels gezien in deze scheiding matrix putten met een smalle Pipetteer tip of schone naald (bv, 25 meter steriele " rep top " naald).
- Plaats van de assay-plaat op de plaat houder, ervoor te zorgen het zit volledig, en sluit de deur instrument.
- Klik op de " Start " knop in de software.
Opmerking: Als er geen Start-knop wordt weergegeven, de verbinding met het instrument is verloren gegaan. Instrument kiezen in het bovenste linker menu en sluit vervolgens. Een pop-up venster moet verschijnen met het serienummer van het instrument; Selecteer deze optie en klik op verbinding maken. De startknop moet nu worden weergegeven. - Wanneer de run is voltooid, gooi de plaat. Verwijder de cassette en plaats in een slijpsel container voor de verwijdering, samen met eventuele naalden die kan zijn gebruikt om pop bubbels. Laat de macht op om verbindingsproblemen te voorkomen als het instrument wordt regelmatig gebruikt (bijvoorbeeld ten minste wekelijks).
7. Experimenteren analyse
- analyse, zorg ervoor dat de volgende kwaliteitscontroles worden uitgevoerd.
- De fluorescerende normen controleren door het selecteren van de " normen Toon " pictogram. Controleer of de normen correct zijn geïdentificeerd in het " grafiekweergave " tabblad. Als ze onjuist zijn, gaat u naar de " één weergave ", klik met de rechtermuisknop op de juiste peak en selecteer " Force standaard ", of klik met de rechtermuisknop op de onjuiste peak en selecteer " niet een standaard ". Deze controle uitvoeren voor elke nieuwe capillair.
- Controleren biotinyleerd ladder door te klikken op de " monsters " en " één weergave " pictogrammen. Selecteer de ladder in de experiment-tabblad. Als een piek is onjuist geïdentificeerd, klik met de rechtermuisknop op het in " grafiekweergave " en selecteer " verwijderen piek ".
Opmerking: bijvoorbeeld, de ladder van de biotinyleerd gebruikt voor de 12-230 kDa kit moet geven 12, 40 66, 116, 180 en 230 kDa sizing pieken. Als deze stap is niet uitgevoerd, de grootte van de pieken van de steekproef wordt onjuist berekend, valse resultaten oplevert. - Weergeven en analyseren monster pieken. Ontlenen van gegevens uit de tabel pieken, met inbegrip van moleculair gewicht, piekoppervlakte piekhoogte en signaal aan lawaai (S/N), zo nodig voor experimentele berekeningen.
Representative Results
Belichtingstijd - Vaststellen signaal burn-out
Signaal burnout kan optreden wanneer het luminol en peroxide substraat is te snel uitgeput. Dit kan worden bepaald door het onderzoek van de gegevens op verschillende Chemoluminescentie belichtingstijden. In de analysesoftware, ga naar "Bewerken - > analyse - > afbeeldingen". Posities variëren van 5 tot 480 s. De y-as in een electropherogram meldt signaal/tijd, zodat de gegevens van elke blootstelling een soortgelijke signaal/tijd coëfficiënt moet. Deze coëfficiënt afneemt met opeenvolgend langere blootstelling als luminol wordt uitgeput, zoals gezien bij het p53-1 antilichaam (Figuur 2). Vanwege substraat inzakking, deze bepaling kan worden beschouwd als meetbare tot de 0,2 µg/µL concentratie alleen op de posities van 5-30 s. Dus in dit voorbeeld, 15 s was vastbesloten om de optimale data analyse belichtingstijd voor p53 worden.
Lysate titratie - Bepalen van lineaire dynamisch bereik
Het is belangrijk dat de metingen worden verricht binnen het lineaire dynamische bereik van elke assay, waar veranderingen in signaal zoals gemeten door piekoppervlakte in verhouding staan tot wijzigingen in de hoeveelheid eiwit in de steekproef. Met behulp van de optimale belichtingstijd van 15 s gekozen in de vorige sectie, assay lineariteit is aangetoond dat p53 zowel ɑ-tubuline over groter is dan een 15-fold aantal concentratie (Figuur 3). In onze ervaring, een R-waarde van2 > 0.9 van een lineaire regressie passen wordt beschouwd als aanvaardbaar voor een verdunningsreeks van gezuiverde proteïne van bekende hoeveelheid (als assay een absolute kwantitatieve meting is) of monster lysate onbekend doel eiwit (als test is een relatieve kwantitatieve meting).
Optimalisatie van antilichaam verdunning
Met behulp van antilichamen bij het verzadigen van concentraties helpt ervoor te zorgen dat eventuele wijzigingen van de signaal gemeten slechts het gevolg zijn van veranderingen in de hoeveelheid eiwit zijn. Als een demonstratie, werden twee BEAS-2B cellijn hele cel extracten (0,2 µg/µL totaal eiwit in de bepaling geladen) gesondeerd met serieel verdunde ɑ-tubuline antilichaam concentraties variërend van 1:25 - 1:800 (Figuur 4). Chemiluminescentie signaal (hier, gemeten als piekoppervlakte) was uitgezet tegen antilichaam verdunning. Verzadiging werd waargenomen in de buurt van de 1:50 verdunning waar de curve een merkbaar plateau begint.
Experimentele trial - Doxorubicine behandeling in BEAS-2B cellen
Geoptimaliseerde assay voorwaarden gebruiken, de cultuur van de cel van de BEAS-2B werd behandeld met drie verschillende concentraties van Doxorubicine (1.2, 1.8 en 2.4 µg/mL) voor 4 h (Figuur 5, tabel 1). Activering van p53 via posttranslationele modificaties bemiddelt verscheidene cellulaire reacties, met inbegrip van de celcyclus arrestatie, senescentie en apoptosis12. In het bijzonder is de fosforylatie van serine 15 toegeschreven aan transcriptionele activering van p53, resulterend in apoptosis na Doxorubicine behandeling13. In deze demonstratie vormt en genormaliseerd ɑ-tubuline piek gebieden worden gepresenteerd als schoot van de controle. Interessant, 3.5 tot 4-fold stijgingen van de p53 fosforylatie op serine 15 en 2-fold stijgingen van het niveau van de p53 phosphorylated op serine 20 werden waargenomen na 4 uur blootstelling aan Doxorubicine. Deze resultaten geven aan activering van p53; echter geen dosis-respons wordt gezien voor de gekozen concentraties (omgekeerd, de laagste dosis getest ontlokte de hoogste reactie). Totale p53 deed dit modelsysteem niet een reactie duidelijk behandeling aantonen. We hebben eerder activering van fosforylering van de p53 in de afwezigheid van verhoogde niveaus van totale p53 onder vergelijkbare omstandigheden waargenomen in zink-behandelde BEAS-2B cellen14.
Figuur 2 . Blootstelling afbeelding vergelijking te detecteren signaal burn-out. Lane views Toon PM10 eiwit voor BEAS-2B lysates gesondeerd met p53 antilichaam van de-1 bij een verdunning 1:500. Chemoluminescentie signaal coëfficiënten, gerapporteerd als piekhoogten in de instrument software, zijn erover. In tegenstelling tot de piekhoogten, zijn de visuele band intensiteiten automatisch gegenereerd en aangepast door het instrument om het bekijken van de bands en zijn niet te vergelijken vanuit een deelvenster naar een ander. Opmerking de afname van de Chemoluminescentie signaal als de verhogingen van de tijd van de blootstelling, met het signaal begint te verdwijnen (split piek) op de twee langste posities, met vermelding van de uitputting van het substraat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Lysate titratie tonen de lane-weergaven. Lysate titratie tonen de rijstrook views (A) van de BEAS-2B lysate wanneer gesondeerd met 1:500 p53-1 of 1:50 ɑ-tubuline. In tegenstelling tot de piekwaarden gebied, zijn de visuele band intensiteiten automatisch gegenereerd en aangepast door het instrument om het bekijken van de bands en zijn niet te vergelijken vanuit een deelvenster naar een ander. Lineaire regressie-analyse (B) bevestigt dat de testen zijn lineair over het gehele bereik getest, van 0.01 0,20 µg/µL en 0,025 tot 0,40 µg/µL, met R2 waarden van 0.999 en 0.985, respectievelijk. Totaal eiwit concentraties in het midden van het lineaire bereik werden gekozen voor de potentiële doelgroep eiwit variatie in beide richtingen (bijvoorbeeld, 0,2 µg/µL voor α-tubuline). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Α-tubuline antilichaam verdunning buigt voor twee aparte BEAS-2B eiwit lysates met en zonder basislijn normalisatie. Een duidelijke departure uit lineariteit is te zien op de 1:50 (0.02) verdunning, met vermelding van verzadiging. 1:50 werd daarom gekozen als de optimale verdunning voor dit antilichaam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Effect van 4 h Doxorubicine (DXN) behandeling op totaal en serine phosphorylated p53 eiwituitdrukking BEAS-2B cellen. Pieken zijn genormaliseerd naar α-tubuline en uitgezet als schoot van de controle (CTL). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1. Effect van behandeling van 4 h Doxorubicine (DXN) op totaal en serine phosphorylated p53 eiwituitdrukking BEAS-2B cellen. Klik hier voor een grotere versie van deze tabel.
Discussion
Voor decennia, er is aanhoudende belangstelling voor de ontwikkeling van capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay methoden vanwege lage monster en reagens uitgaven, daalde verwerking tijd in vergelijking met traditionele methoden, en hoge compatibiliteit met automatiseren van de procedure4,15. Er zijn een aantal verschillende protocollen voor de scheiding van proteïnen toe die hebben gebruikt haarvaten, inclusief elektroforetische, elektrokinetische, polymeer zeven en elektrisch methoden, die eiwitten (respectievelijk door verschillende eigenschappen isoleren, elektrostatische lading, partitie evenwicht, zeven eigenschappen van de scheitrechter matrix, en pH)16. Hier beschrijven we een antilichaam-gebaseerd (of immunoassay) capillaire elektroforese methode, met behulp van een polymeer zeven scheiding, die is geautomatiseerd en commercieel aangenomen3. Voordelen van dit systeem zijn gebruiksgemak en bewerking, gestandaardiseerde en verkrijgbare reagentia, en betrouwbare, gevoelige metingen die minder reagens en monsters in vergelijking met traditionele eiwit assays zoals westelijke vlek, vereisen Enzyme-linked immunoassay, en andere formaten3,4,5. Er wordt opgemerkt in eerdere evaluaties van deze technologie dat de groottewaaier van eiwit dat kan worden beoordeeld heeft is beperkt door de beschikbare scheiding matrix4, maar recente aanbod hebben uitgebreid de meetbare variëren van 2 tot 440 kDa17 . Bovendien, dat sommige lysate buffers zitten bekend voor zitten onverenigbaar is met de assay18, dan ook moet selectie van de experimentele gebruikte reagentia beschouwd vooraf.
Een groot voordeel van een geautomatiseerde procedure met verkrijgbare componenten is consistentie van resultaten door middel van gestandaardiseerde methoden en reagentia. Dit minimaliseert kansen van assay mislukking door het automatiseren van kritische stappen binnen de procedure. Het is echter belangrijk op te merken dat bepaalde praktijken tijdens het protocol tot een minimum beperken van problemen met de capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay moeten worden nageleefd. Ten eerste is het essentieel dat het luminol-S/peroxide mengsel bereid is fris en onmiddellijk voordat de plaat geladen. Consistente timing zal resulteren in consistente luminescentie nadat de oxiderende agent is toegevoegd, die in een consistente metingen voor een bepaald antilichaam assay na assay resulteren zal. Het is bovendien belangrijk dat niet-verlopen reagentia worden gebruikt, die vooral van invloed is op de potentie van de oxiderende agent. Daarnaast is het belangrijk dat de volgorde van laden van monsters, antilichamen en andere reagentia strikt worden gevolgd (Zie Figuur 1). Elk reagens afgepipetteerde misplaatst zal resulteren in assay falen en een verspilde run.
Naast deze kritische stappen, kunnen de primaire problemen ervaren met de techniek in het algemeen dankzij optimalisatie worden overwonnen. Inderdaad, deze voorwaarden zijn specifiek voor elk model systeem/antilichaam combinatie en daarom moeten empirisch worden bepaald voor elke nieuwe assay. In dit artikel focussen we op drie gemeenschappelijke optimalisatie procedures: belichtingstijd, lysate titratie en primair antilichaam verdunning. De mogelijkheid om meetbare resultaten te genereren, is afhankelijk van analyse van een blootstellingstijd wanneer het luminol substraat niet snel, als substraat uitputting resulteert in verlies van signaal uitgeput is. Lysate titratie bepaalt het lineaire dynamische bereik van elke assay, die met verschillende modelsystemen, evenals verschillende antilichamen, zelfs voor hetzelfde eiwit doel verschillen kan. Antilichaam verdunningen gekozen op of nabij het verzadigen van concentraties zorgen voor veranderingen in signaal zal niet worden beïnvloed door een tekort aan vrije antilichaam, maar alleen door verschillende hoeveelheid beschikbare eiwit doel epitoop. Andere overwegingen tijdens het optimalisatieproces eventueel antilichaam-incubatietijd en stapelen/monster laadtijd. In de meeste gevallen bieden de standaardinstellingen voor het instrument de beste balans tussen resolutie en gevoeligheid. Echter in sommige gevallen kan slechte resolutie of gevoeligheid worden verbeterd door deze parameters aan te passen.
Capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay methoden bieden eiwit van snelle, efficiënte en reproduceerbare metingen. Terwijl deze methoden voornamelijk in onderzoek en ontwikkeling instellingen gebruikt hebben, heeft de consistentie van deze technologieën potentiële nut in regelgevings- en klinische toepassingen. Bijvoorbeeld, kan de identificatie van voor de ziekte vatbare subpopulaties toxische stoffen in het milieu of patiënten met progressie van de ziekte worden gebaseerd op proteïne biomarkers gemeten in toegankelijk matrices, zoals bloed, urine en speeksel. Als reagens en daling van de kosten van de operatie en het aantal monsters en doelen die gelijktijdig beoordeeld toeneemt kunnen, zullen we waarschijnlijk zien capillaire elektroforetische gebaseerde immunoassay methoden die worden gebruikt voor dit soort toepassingen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. Dit manuscript is beoordeeld door de nationale gezondheids- en milieu-effecten Research Laboratory en goedgekeurd voor publicatie. De inhoud weerspiegelt niet noodzakelijk de standpunten van het US EPA, noch vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.
Acknowledgments
De auteurs bedank Keith Tarpley van het US EPA Office van onderzoek en ontwikkeling-Research Triangle Park (ORD-RTP) grafische en Media team voor ontwikkeling, taping, en bewerken van de instructie-video. Wij willen ook bedank Deborah Pritchett van ProteinSimple voor nuttige gesprekken met betrekking tot de optimalisatie van onze gegevens. JM Guynn werd gesteund door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderzoek/deelname onderwijsprogramma op het ons Environmental Protection Agency.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
| P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
| phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
| phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
| alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
| Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
| 12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
| www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
| BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
| keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
| keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
| Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
| Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
| INCLUDES: | |||
| Lysis Buffer AM1 | |||
| 1M dithiothreitol (DTT) | |||
| Protease Inhibitor Cocktail | |||
| 10X PBS | |||
| Phosphatase Inhibitors |
References
- Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. Hematopoietic stem cell protocols. 1185, Springer. (2014).
- Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways. Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).
- Chen, J. Q., et al. Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system. Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. J Transl Med. 13, 182 (2015).
- Liu, S., et al. The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized & Translational Medicine Research. J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).
- ProteinSimple Western. Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. J Vis Exp. (84), e51149 (2014).
- Thorn, C. F., et al. Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).
- Ernst, O., Zor, T.
- Taira, N., Yoshida, K. Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets. Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).
- Thompson, T., et al. Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis. J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).
- Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells. PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).
- Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
- Shintani, H. Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , 1, Springer. Netherlands. (1997).
- Wes reagents and consumables :: ProteinSimple. , https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html (2017).
- Simple Western Size Assay Buffer Compatibility. , http://www.proteinsimple.com/documents/SW_Buffer_Compatibility_Table_rev_D.pdf (2017).
