Summary
Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.
Abstract
T-cellen zijn cruciaal voor veel immunologische processen, waaronder opsporen en elimineren van virus-geïnfecteerde cellen voorkomen autoimmuniteit, assisteren bij B-cel en plasma-cel productie van antilichamen, opsporen en elimineren van kankercellen. De ontwikkeling van MHC-tetrameer kleuring van antigeen-specifieke T-cellen geanalyseerd door stroom cytometry heeft een revolutie teweeggebracht in ons vermogen te bestuderen en begrijpen van de Immunobiologie van T-cellen. Terwijl uiterst nuttig voor het bepalen van de hoeveelheid en het fenotype van antigeen-specifieke T-cellen, kan niet stroom cytometry bepalen wat de ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T-cellen naar andere cellen en structuren in de weefsels, en huidige aggregatieniveau technieken om uit te pakken van de T die nodig zijn cellen voor stroom cytometry hebben beperkte doeltreffendheid in niet-lymfoïde weefsels. In situ MHC-tetrameer kleuring (IST) is een techniek om te visualiseren van T-cellen die specifiek voor antigeen van belang in de weefsels zijn. In combinatie met immunohistochemistry (IHC), kunt IST bepalen de overvloed, locatie en fenotype van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels. Hier beschrijven we een protocol om de vlek en inventariseren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, met specifieke fenotypen gelegen binnen specifieke weefsel compartimenten. Deze procedures zijn dezelfde die we in onze recente publicatie door Li et al. gebruikt, getiteld "Simian Immunodeficiëntie Virus-producerende cellen in de follikels gedeeltelijk onderdrukt door CD8+ cellen In Vivo." De beschreven methoden zijn breed toepasbare omdat ze kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren, fenotype, en in wezen een antigeen-specifieke CD8 T-cel waarvoor MHC tetramers beschikbaar zijn, in elk weefsel te kwantificeren.
Introduction
T-cellen zijn cruciaal voor veel immunologische processen, waaronder opsporen en elimineren van virus-geïnfecteerde cellen voorkomen autoimmuniteit, assisteren bij B-cel en plasma-cel productie van antilichamen, opsporen en elimineren van kankercellen. De ontwikkeling van peptide/MHC klasse I tetrameer kleuring van antigeen-specifieke CD8 T cellen1 en de meer recente ontwikkeling van de MHC klasse II tetrameer kleuring van CD4 T cellen2 door stroom cytometry een revolutie teweeggebracht in ons vermogen te bestuderen en begrijpen de Immunobiologie van T-cellen. Terwijl uiterst nuttig voor het bepalen van de hoeveelheid en het fenotype van antigeen-specifieke T-cellen, stroom cytometry niet mogelijk voor de detectie van de ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T-cellen naar andere cellen en structuren in de weefsels, en de huidige aggregatieniveau technieken om uit te pakken van de T-cellen die nodig zijn voor stroom cytometry hebben beperkte doeltreffendheid in niet-lymfoïde weefsels3.
Wij en anderen hebben ontwikkeld methoden met peptide-geladen MHC klasse I en klasse II tetrameer of multimer reagentia vlek van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. deze IST methoden voor de bepaling van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels verlenen en een middel om het detecteren van deze cellen ten opzichte van andere cellen en structuren in de weefsels. Onze fractie heeft uitgebreid gebruikt voor MHC-ik tetrameer vlekken om te bestuderen van humaan immunodeficiëntie virus (HIV)- en simian immunodeficiëntie virus (SIV) - specifieke CD8 T-cellen in de lymfoïde, genitale en rectale weefsels een inzicht van HIV en SIV immunopathogenese en te identificeren correlaten van succesvolle vaccinatie strategieën14,15,16,17. Daarnaast ontwikkeld we ook een techniek die IST met in situ hybridisatie (ISH combineert) te lokaliseren en te kwantificeren van virus-specifieke CD8 T cellen en virus-geïnfecteerde cellen in weefsels en om te bepalen van de in vivo effector-tot-streefpad niveaus 18 , 19.
Hier beschrijven we een protocol met behulp van peptide-geladen MHC-ik tetramers om vlek van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in de weefselsecties van vers, tot counterstain weefsels met behulp van IHC en te kwantificeren van cellen met specifieke fenotypen in specifieke weefsel compartimenten. Deze procedures zijn dezelfde als in onze recente publicatie werden gebruikt door Li et al., waarin wij de locatie, overvloed en fenotype van SIV-specifieke T-cellen in de lymfoïde weefsel tijdens chronische SIV infectie in Makaken20 vastbesloten.
Voor deze procedure, verse weefsels zijn gesegmenteerd en 's nachts geïncubeerd met peptide-geladen MHC-ik tetramers geconjugeerd met fluoresceïne kaliumthiocyanaat moleculen (FITC). Ze worden dan opgelost met paraformaldehyde. Na de vaststelling van het weefsel, wordt het signaal van de MHC tetramers versterkt met behulp van konijn anti-FITC antilichamen en geïncubeerd met fluorescently tagged anti-konijn IgG antilichamen, die het signaal van de afhankelijke tetramers verder te versterken. IHC wordt gebruikt in combinatie met IST te karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen en de omringende cellen. Antilichamen die herkennen epitopes op het oppervlak van cellen of in de extracellulaire ruimte zijn opgenomen in de primaire incubatie met de tetramers. Antilichamen die intracellulaire epitopes herkent vereisen permeatie van de celwand voorafgaand aan kleuring. De gekleurde weefselsecties zijn beeld met behulp van een confocal microscoop en geanalyseerd met behulp van de confocal software. Gelabelde cellen worden gekwantificeerd aan de hand van de confocal microscopie software of ImageJ. De beschreven protocol kan worden gebruikt om vlek in wezen een antigeen-specifieke CD8 T cel in elk weefsel voor welke MHC-ik tetramers zijn beschikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dag 1: verse weefsel segmenteren en primaire incubatie
- gebruik een scalpel aan verse weefsel in kleine (ongeveer 0.5 cm breed door 0.5 cm hoog) stukjes gesneden. Afzonderlijk lijm van elk weefsel naar een zuiger en insluit met 4% laag-smelt agarose 3-5 mL in PBS. Label de zuiger met de informatie van de weefsel met behulp van een sticker. Zet het in een gekoeld houder in een ijsemmer te stollen.
- Inschakelen de microtoom en de dikte van de secties naar 200 µm. installeren een scheermesje op de microtoom en steek de zuiger gemonteerd met weefsel in het bad microtoom.
- Bereiden met fosfaat gebufferde zoutoplossing met heparine (PBS-H) door toevoeging van 100 µg/mL of 18,7 U/mL heparine aan PBS voor het behoud van het RNA en toe te staan van de toepassingsmogelijkheden van ISH stroomafwaarts. Vul de microtoom bad, die betrekking hebben op het ingesloten weefsel, met 100-120 mL gekoeld, steriele PBS-H. PBS-H ijsblokjes toevoegen aan het bad om de temperatuur bij 0 - 2 ° C. Start de microtoom en knip het weefsel in secties van 200 µm.
Opmerking: Het is belangrijk om te houden van de weefsels gekoeld op ijs te minimaliseren van cellulaire activiteit binnen de weefsels en omdat verse weefsel gemakkelijker aan sectie is wanneer het is gekoeld. PBS alleen kan worden gebruikt als er geen plannen voor downstream ISH zijn. - Als alternatief voor weefsels die doen niet goed met een microtoom (bijvoorbeeld darm en Long), gesneden gebruik een scalpel of scheermesje te snijden het weefsel in dunne reepjes als dicht mogelijk tot 200 µm.
- Label het deksel van 24-well weefselkweek platen met de experimentele voorbeeldgegevens en plaats de weefsel kamers in de overeenkomstige putten. Gebruik een penseel over te dragen van de secties aan een weefsel kamer instellen in de put van een 24-well weefselkweek plaat met 1 mL gekoeld PBS-H.
Nota: Herbruikbare weefsel kamers moeten worden gemaakt alvorens aan te vangen kleuring. Weefsel kamers kunnen worden gemaakt met behulp van een module-cap tube voor 14 mL polypropyleen ronde onderkant en draad mazen. Gebruik een scherp scheermesje af te snijden de onderkant van een 14 mL polypropyleen ronde onderkant module-cap buis. Knip het gaas in een cirkel aan het gat aan de onderkant van de buis. Verwarm de wire mesh cirkel met behulp van een Bunsenbrander, totdat het gloeiende. De wire mesh cirkel zeer snel vastgelegd en duwen de buis op de Maas. Controleer of de gaas is goed op de onderkant van de buis aangesloten en vervolgens zorgvuldig afgesneden van de bovenkant van de buis op de 3 mL merk met behulp van een scherp scheermesje. Zet maximaal 3 weefselsecties in elke kamer van het weefsel, of maximaal 1 cm 2 van weefsel per putje. Houden van ten minste één lege goed tussen putten met verschillende antilichaam combinaties te voorkomen van kruisbesmetting. - Doorgaan op primaire tetrameer en antilichaam kleuring onmiddellijk na het beëindigen van de overdracht van alle gesneden secties in de weefsels kamers. De secties ondergedompeld en gekoeld in 1 mL PBS-H te allen tijde houden.
- Broeden de weefselsecties overnachting met 0,5 µg/mL FITC-geconjugeerd, peptide-geladen MHC-ik tetramers verdund in PBS-H met 2% normale geit serum (NGS). Muis of andere niet-konijn antilichamen gericht extracellulaire epitopes van belang in deze incubatie bevatten (bijvoorbeeld rat anti-CD8 antilichamen verdund 1:500 in PBS-H met 2% NGS). Plaats 1 mL verdunde antilichamen in elk putje.
Opmerking: Zorg moet worden genomen bij het selecteren van CD8 antilichamen, zoals sommige vergroten kunt en sommige MHC tetramers binden aan T-cel-receptoren 4 , 21 kunnen remmen. De rat anti-menselijke CD8 antilichaam hier beschreven is onstabiel en soms resulteert in een enigszins zwakke kleuring. Het wordt hier gebruikt voor het drievoudige labelen want het is de enige niet-konijn en niet-muis CD8 antilichaam die gekleurd rhesus makaak CD8 T cellen getest. - Gebruik 1 mL van oplossing per putje voor het primair antilichaam en alle volgende incubations, en het uitvoeren van dit en alle latere incubations bij 4 ° C, met de platen op een rockende platform.
Opmerking: Weefsels moeten vrij zweven in de zaal.
2. Dag 2: Fixatie en secundaire incubatie
- na de primaire incubatie, wassen de secties tweemaal met 1 mL van gekoeld PBS-H gedurende 20 minuten elke wassen. Dit doen door de overdracht van de kamers van het weefsel op een bord van de verschillende 24-well weefselkweek met 1 mL gekoeld PBS-H in de overeenkomstige putjes.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te druppelen van inhoud uit een experimentele monster naar de andere tijdens het verplaatsen tussen de kamers van het weefsel. Voor alle daaropvolgende incubations en wast, moet u de zaal weefsel ook overbrengen in een schoon plaat met de passende oplossing. Zorg ervoor dat controleren van de secties in het weefsel kamers tijdens de procedure om ervoor te zorgen dat de secties niet blijven aan de zijkanten van de kamers van het weefsel steken. Als ze, duw ze terug in de oplossing. - Het herstellen van de secties met 1 mL van de verse PBS-gebufferd 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (niet overdreven oplossen). Wassen met koud PBS-H tweemaal voor 5 min.
Let op: Paraformaldehyde is giftig; passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.
Opmerking: Als antigeen ophalen en permeabilization nodig is voor het detecteren van intracellulaire epitopes, kunnen de antigenen worden opgehaald door het koken van de secties in 0,01 mol ureum na de fixatie paraformaldehyde. - Overbrengen van de secties in 24-well cultuur platen met 0,01 mol ureum en plaats deze platen in een magnetron. Kook de secties driemaal voor ongeveer 10 s elk, voor een totaal van 30 s.
Opmerking: Wees heel voorzichtig, als het kookt de oplossing kan dwingen de secties uit de putten. Als dit gebeurt, gebruik een verfkwast terug te duwen in de secties van de zijkanten van de kamer van weefsel of van het deksel van de plaat in de bodem van de kamer van de juiste weefsel. - Voorafgaande aan de incubatie van secundair antilichaam, permeabilize en de weefselsecties blokkeren door ze aan het broeden in blokkerende oplossing met PBS-H, 0,3% wasmiddel (PBS-H-T) en 2% NGS op een rocker gedurende 1 uur bij 4 ° C. uitvoeren volgende antilichaam incubations met PBS-H-T/2% NGS.
- Voor de secundaire incubatie, overbrengen in de secties in het weefsel chambers putten met konijn anti-FITC antilichaam verdund 1:10,000 in PBS-H-T/2% NGS. Na een nacht bebroeden.
- Uitvoeren counterstaining via muis anti-CD20 antilichaam verdund 1:200 in PBS-H-T/2% NGS. Voor deze optie, halen de epitopes indien nodig, de cellen doordringen en voorafgaand aan deze incubatie, blokkeren zoals hierboven beschreven.
3. Dag 3: Tertiaire incubatie
- na de tweede incubatie, wassen de secties drie keer in PBS-H bij 4 ° C gedurende ten minste 20 min.
- Voeren een definitieve incubatie met de juiste fluorescently label antilichamen (bijvoorbeeld geit anti-konijn geconjugeerd groenachtig geel, geit anti-rat geconjugeerd veel rode kleurstof en geit anti-muis geconjugeerd groene kleurstof antilichamen verdunde 1:5, 000, 1:5, 000 en 1:2, 000, respectievelijk, in PBS-H-T/2% NGS). Na een nacht bebroeden.
Opmerking: op dit punt, de incubatie kan worden verlengd tot drie dagen indien nodig. Houden van de secties beschermd tegen licht door inwikkeling van de platen in aluminiumfolie tijdens deze incubation stap en daarna, zoals licht fluorophores lest.
4. Dag 4: Montage van de secties
- Wash de secties drie keer in PBS-H voor ten minste 20 min.
Opmerking: Als plan voor downstream ISH 19, bevestigen de secties in 4% paraformaldehyde voor 1 h voor de beveiliging van de tetramers en de antilichamen in plaats en daarna wassen de secties tweemaal met PBS-H voor elke 5 min.
Let op: Paraformaldehyde is giftig; passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen. - Gebruiken een penseel over te dragen van de secties aan een microscoopglaasje. Wees voorzichtig niet om het weefsel te veel steken. Jas elke sectie met glycerol/gelatine met 4 mg/mL n-propyl gallate of een ander montage opslagmedium met een conserveermiddel fluorophore. Dek af met een dekglaasje aan.
- De dia's opslaan in een licht beveiligde dia verpakking bij -20 ° C. Spoel de weefselkweek platen en verwijderen van de etiketten op het gebruik van alcohol deksels.
Opmerking: De platen kunnen worden hergebruikt.
5. Verwerving van de Confocal Microscoop beelden
- de hoge resolutie beelden vastleggen met een confocal microscoop, met behulp van de juiste lasers en filters voor elke fluorophore ( figuur 1A en B).
Opmerking: In dit voorbeeld een confocal microscoop (Zie de Tabel van materialen) werd gebruikt. Beelden werden verzameld met behulp van de 561 nm laser op 20% kracht voor de groenachtig geel-geëtiketteerden antigeen-specifieke T-cellen, de laser van de 488-nm op 10% kracht voor groen-geëtiketteerden CD20-uiten B-cellen en de laser van de 640-nm op 15% kracht voor ver rood gemerkte CD8 T-cellen. De 20 X doelstelling en een numerieke diafragma van 0,8 dienden. - Verzamelen sequentieel z-serie op 3 µm (of andere) intervallen in de drie kanalen in meerdere 800 x 800 pixel velden. Bouwen van een montage van de verzamelde velden ( Figuur 1 c -E). Elke afbeelding van de montage op basis van de gegevens van de bijbehorende dia een naam geven en opslaan voor analyse.
- Uitvoeren van kwantitatieve beeldanalyse met behulp van de respectieve confocal microscoop analyse en kwantificering software of het gebruik van ImageJ.
6. Kwantitatieve beeldanalyse
Opmerking: kwantitatieve beeldanalyse kan worden bereikt met behulp van de confocal microscoop analyse en kwantificering software of met behulp van ImageJ software. Hier, ImageJ werd gebruikt als een voorbeeld.
- Open een confocal montage door deze te slepen naar het venster ImageJ ( figuur 2A).
Opmerking: ImageJ kunt montages verzameld door vele verschillende confocal microscopen rechtstreeks openen. Wanneer de montage niet rechtstreeks worden geopend door ImageJ, de geselecteerde z-scan als een TIFF-bestand te openen it. exporteren - Dupliceren de geselecteerde z-scan p.a. (" beeld "-> " dupliceren ") ( figuur 2B).
- De verschillende kanalen splitsen (" beeld "-> " kleur "-> " kanalen splitsen ") ( figuur 2C).
- Trekken de ROI voor kwantitatieve analyse in het overeenkomstige kanaal doelstelling en toe te voegen aan de ROI-manager door te drukken op " T " op het toetsenbord. Meten van het gebied.
Opmerking: De manager van de ROI van ImageJ geeft het gebied in µm 2 ( figuur 2D). - Aanpassen van de fluorescentie helderheid en het contrast van het kanaal om te worden geanalyseerd (" beeld "-> " aanpassen "-> " Helderheid/Contrast ") ( figuur 2E).
- De ROI op de afbeelding afvlakken (" ROI manager "-> " Flatten ") ( figuur 2F).
- Kwantificeren van de positieve cellen in de afbeelding met behulp van de " Multi-Point " gereedschap ( Figuur 2 g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont hoe verzamelt confocal beelden met behulp van een confocal microscoop. Figuur 2 toont kwantitatieve beeldanalyse ImageJ gebruiken. Figuren 3 en 4 tonen vertegenwoordiger beelden van lymfeklier weefsels van een SIV besmet resusaap gekleurd met MHC tetramers, CD8 antilichamen en CD20 antilichamen, en dienen om aan te tonen van de specificiteit van de MHC-tetrameer kleuring. Figuur 3 vergelijkt MHC klasse I tetramers geladen met een peptide van SIV in vergelijking met de secties van de dezelfde weefsel gekleurd met de MHC klasse I tetramers geladen met een irrelevant peptide. Figuur 4 laat zien dat cellen gekleurd met de MHC/SIV-peptide tetrameer mede gekleurd met CD8 antistoffen, maar geen CD20 antistoffen, die vlekken van B-cellen. Figuur 5 ziet u een voorbeeld van een montage gemaakt uit meerdere confocal z-serie velden gebruikt voor de kwantificering van tetrameer gekleurd cellen met specifieke fenotypen in verschillende anatomische compartimenten op de lymfeklier. De uitbreiding geeft een gebied van de lymfeklier met een B-cel follikel afgebakend door CD20 kleuring en omliggende T cel zone, waarin MHC tetrameer-gebeitste cellen kunnen worden opgespoord, waarvan sommige express mede Ki67 die een marker van T cel activatie en proliferatie is. Deze kleuring combinatie zorgt ervoor dat de bepaling van het fenotype van SIV-specifieke CD8 T-cellen binnen en buiten B-cel follikels, in relatie naar SIV-specifieke CD8 T-cellen en naar andere Ki67 waarin cellen, en B cellen.
Figuur 1: Vertegenwoordiger Screenshots het tonen van hoe verzamelt Confocal beelden met behulp van een Confocal Microscoop. (A) acquisitie modus gebruikt voor het verzamelen van de confocal beelden. (B) kanalen gebruikt voor foto collectie. (C) 20 X doelstelling en 800 x 800 pixel velden werden gebruikt in beeld-collectie. (D) een sequentiële z-stack werd verzameld 3 µm tussenpozen. (E) tegels werden aangenomen om af te bakenen en het verzamelen van beelden in meerdere velden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Vertegenwoordiger Screenshots tonen kwantitatieve beeld analyse met behulp van ImageJ. (A) Open een confocal montage door deze te slepen naar het venster ImageJ. (B) dubbele de geselecteerde z-scan voor analyse. (C) splitsen de verschillende kanalen. (D) trekken de ROI voor kwantitatieve analyse in het overeenkomstige kanaal toe te voegen aan de ROI-manager door te drukken op "T." te worden van de doelstelling (E) aanpassen de fluorescentie helderheid en het contrast van het kanaal te analyseren. (F) Flatten de ROI op de afbeelding. (G) graaf de positieve in de afbeelding cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : IST gecombineerd met IHC in axillaire lymfeklieren secties van een SIV-geïnfecteerde resusaap. Mamu - A * 02 tetramers geladen met SIV Nef YY9 peptiden werden gebruikt voor de vlek van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en soortgelijke tetramers geladen met een irrelevant FLP peptide van het hepatitis B-virus werden gebruikt als een negatieve controle (rood). Muis anti-CD20 antilichamen werden gebruikt om vlek CD20+ B cellen (groen), en rat anti-CD8 antilichamen werden gebruikt om vlek CD8+ T cellen (blauw). (A) A representatief beeld van een sectie van de axillaire lymfeklieren gekleurd met YY9 tetramers, CD20 en CD8 antilichamen. (B) hetzelfde beeld als in deelvenster een tonen de YY9 tetrameer alleen vlek. (C) representatief beeld van een sectie van de dezelfde axillaire lymfeklieren, gekleurd met FLP tetramers en CD20 en CD8 antilichamen. (D) het zelfde beeld als in deelvenster C met het FLP tetrameer vlek alleen. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : IST gecombineerd met IHC tonen de specificiteit van MHC-tetrameer kleuring. Representatieve axillaire lymfeklieren sectie gekleurd met Mamu - A * 02 tetramers geladen met Nef YY9 peptiden label SIV-specifieke CD8 T-cellen (rood), muis anti-CD20 antilichamen naar label B cellen (groen) en rat anti-CD8 antilichamen tegen label CD8 T cellen (blauw) (A ). Een SIV-specifieke CD8 T-cel is tetrameer + (B), CD20- (C), en CD8+ (D). Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: IST gecombineerd met IHC om te laten zien van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen. (A) representatieve axillaire lymfeklieren sectie gekleurd met Mamu - A * 02 tetramers geladen met Nef YY9 peptiden label SIV-specifieke CD8 T-cellen (rood), Ki67 antilichamen tegen label delende cellen (groen) en IgM-antistoffen naar label B cellen (blauw). Schaal bar = 100 µm. (B) uitbreiding van een geselecteerd gebied in het deelvenster A. IgM kleuring definieert de folliculaire gebied, die is gemarkeerd als "F;" het extrafollicular gebied is gemarkeerd als "EF." Tetrameer+ cellen worden aangegeven met pijlen. Schaal bar = 100 µm. representatieve tetrameer+ Ki67- cel (C, D, E) en tetrameer+ Ki67+ cel (F, G, H). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IST gecombineerd met IHC biedt een essentieel instrument voor het opsporen, karakteriseren, en kwantificeren van antigeen-specifieke CD8 T cellen in native omgevingen met de context van andere cellen en weefsel structuren. Hier, beschreven we gedetailleerde procedures voor het IST gecombineerd met IHC, gevolgd door kwantitatieve beeldanalyse, om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in de lymfeklieren van rhesus makaken. Soortgelijke kleuring kan worden toegepast op de mens, muis, of andere soorten weefsels voor welke MHC-ik tetramers zijn beschikbaar. Daarnaast kan peptide MHC Class II tetrameer of dextramer kleuring worden uitgevoerd met behulp van relatief vergelijkbare methoden voor het label van antigeen-specifieke CD4 T-cellen in weefsels4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST kan ook worden gecombineerd met ISH te bepalen, bijvoorbeeld in vivo effector-to-target cel niveaus18,19. In de toekomst zal het interessant zijn om te dragen IST/IHC verder door het combineren van IST/IHC met geavanceerde in situ RNA en DNA detectie methoden. Recente vooruitgang in de in situ hybridisatie tests omvatten de ontwikkeling van RNAscope en DNAscope24. Deze technieken voldoende zijn voor de detectie van doel RNA en DNA in weefsels. Het is spannend om deze methoden combineren met IST en IHC voor gelijktijdig speurder virus-specifieke-CD8 T-cellen, virale RNA, virale DNA en gelabeld antilichaam antigeen van belang.
Terwijl we oorspronkelijk beschreven IST methoden met verse weefsels, weefsels die werden vastgesteld voor een korte duur, en bevroren weefsels4, in de afgelopen jaren hebben we uitsluitend verse weefselsecties, gebruikt, omdat zij consequent de vlekken van de hoogste kwaliteit produceren en zorgen voor het onderzoek van cellen in dikke weefselsecties. Als alternatief voor de procedures hier gepresenteerd, een kan tetramers van toepassing op weefsels, na een nacht bebroeden, positiebepaling, insluiten en cryopreserve in het bevriezen van middellange (bijvoorbeeld OCT), bevroren dunne secties produceren en uitvoeren van IHC later22. Ook wij routinematig vlek een subset van weefselsecties met tetramers alleen en dan bevriezen de secties in de LGO te voorzien in extra counterstaining combinaties in de toekomst. Daarnaast kan Qdot 655-geconjugeerde peptide-MHC multimeren worden gebruikt om te visualiseren direct antigeen-specifieke T-cellen in de cryopreserved weefsel secties13.
Wij hebben hier beschreven indirecte tetrameer kleuring. Directe kleuring met behulp van APC - of PE-geconjugeerde tetramers heeft ook aangetoond dat werken4,22. In dit geval is de concentratie van MHC tetrameer nodig hoger dan die in het indirecte tetrameer kleuring gebruikt. In onze handen werd een concentratie van 20 µg/mL APC-geëtiketteerden tetrameer effectief bij de opsporing van antigeen-specifieke cellen. De intensiteit van kleuring was echter veel lager dan die verkregen met indirecte labelen, waaronder versterking met anti-FITC antilichamen.
We vonden dat het gebruik van compressie gebaseerde microtome (Zie de Tabel van materialen) voor verse weefsel snijden versoepeld het proces van snijden van verse weefselsecties als vergeleken met een vibrerende microtoom23. In gevallen waar een compressie gebaseerde microtoom niet beschikbaar is, kan een vibrerende microtoom of scalpel echter worden gebruikt voor het segmenteren van vers weefsel.
Een belangrijke beperking van deze techniek is het gebruik van nieuwe weefsels. Met behulp van nieuwe weefsels is veel moeilijker dan vaste of bevroren weefsels, omdat zij onmiddellijke aandacht en verwerking vereisen. We hebben met succes verzonden vers weefsels 's nachts op ijs in weefsel kweekmedium of PBS-H. Echter zijn er af en toe problemen met scheepvaart; sneeuwonweren hebben bijvoorbeeld de verzending van weefsels voor 48 uur of meer uitgesteld. In deze gevallen vonden we dat verse weefsels gesegmenteerd en die gekleurd 48u na extractie in het algemeen specifieke kleuring tonen, met tekenen van aantasting van sommige weefsel; weefsels gekleurd 72 h na extractie zijn ook gedegradeerd voor kleuring. Ook vonden we dat de overbrenging van vers weefsels met ijsblokken die te koud of te dicht bij dat de weefsels kunnen het bevriezen van de weefsels tijdens de verzending; deze bevriezing vernietigt in het algemeen de weefsel voor kleuring. Het is dus uiterst belangrijk om het schip van verse weefsels gekoeld, maar niet bevroren, en tot inleiding IST kleuring binnen 24 h. verse weefsel verwerking ook vergt veel van student en personeel tijd, als weefsels van meerdere dieren of studiedeelnemers niet kunnen worden verzameld en gebeitst samen op een latere datum. Ondanks deze moeilijkheden vinden we dat verse weefselsecties de beste keuze voor mooie, specifieke IST/IHC kleuring zijn.
Een andere beperking van de hier beschreven methode van IST/IHC is de indirecte kleuring benadering. Als gevolg van beperkingen op het aantal verschillende soorten dieren beschikbaar om te genereren secundair antilichaam combinaties zijn wij beperkt door indirecte antilichaam kleuring methoden aan slechts drie of vier TL antilichaam kleuring combinaties op een moment. Dit beperkt de hoeveelheid informatie die kan worden verzameld op een weefsel plaat. Directe IHC kleuring overwint deze beperking en de mogelijkheden, opsporen van acht of meer gelabeld antilichaam antigeen gelijktijdig, zij het met elke antilichaam produceren een veel zwakkere fluorescent signaal vergeleken met indirecte methoden kunt uitbreiden. Dus kan indirecte IHC worden gebruikt als alternatief voor indirecte IHC voor counterstaining IST gebeitste weefsels, waardoor voor de detectie van toegenomen aantallen van cellulaire antigenen in combinatie met de IST-detectie van antigeen-specifieke CD8 T-cellen.
In sommige gevallen treedt aanzienlijke autofluorescence en/of aspecifieke tetrameer of antilichaam binding met IST/ISH. Vanwege dit zijn goede positieve en negatieve controles nodig om het onderscheiden van specifieke vlekken van achtergrond en autofluorescent vlekken. Goede negatieve controles voor MHC ik tetramers omvatten negatieve controle weefsels (bijvoorbeeld niet-geïnfecteerde weefsels; weefsels gekleurd met MHC ik tetramers geladen met irrelevante peptiden of irrelevant MHC tetramers; of, in een snuifje, weefsels gekleurd met Nee tetramers, maar met het sturen van antilichamen).
Kortom is MHC I IST gecombineerd met IHC een waardevol instrument om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in weefsels. Deze methode zorgt voor de opsporing van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in native omgevingen, met de relatieve localization voor andere soorten cellen en weefsel structuren onderhouden. Deze methode is breed toepasbare, omdat het kan worden gebruikt voor het lokaliseren, fenotype, en kwantificeren in wezen naar een antigeen-specifieke CD8 T cel voor welke MHC tetramers beschikbaar zijn, in elk weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Public Health Service verleent van de National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
