Summary
Vi beskriver användningen av laser fånga lokalt att erhålla prover av olika cellpopulationer från olika hjärnregioner för gen- och mikroRNA analys. Denna teknik tillåter studier av differentiella effekter av traumatisk hjärnskada i specifika regioner i råtthjärna.
Abstract
Möjligheten att isolera delar av hjärnan av intresse kan hindras i vävnad disassociation tekniker som inte bevarar deras rumsliga fördelning. Sådana tekniker skeva också potentiellt gen uttryck analys eftersom själva processen kan förändra uttrycksmönster i enskilda celler. Här beskriver vi en laser fånga lokalt (LCM) metod för att selektivt samla delar av hjärnan påverkas av traumatisk hjärnskada (TBI) med hjälp av en modifierad Nissl (tolyloxi violett) färgning protokoll och vägledningen av en rat brain atlas. LCM ger tillgång till hjärnan i sina ursprungliga positioner och förmågan att använda anatomiska landmärken för identifiering av varje specifik region. I detta syfte har LCM använts tidigare att undersöka hjärnan regionen specifika genuttryck i TBI. Detta protokoll tillåter granskning av TBI-inducerade förändringar i genen och mikroRNA uttryck i olika hjärnområden inom samma djur. Principerna för detta protokoll kan ändras och tillämpas på ett brett utbud av studier som undersöker genomisk uttryck i andra sjukdom eller djurmodeller.
Introduction
Däggdjur hjärnan är anmärkningsvärt komplex och heterogen med hundratals till tusentals cell typer1. Faktiskt, studier på människa har visat att i regioner såsom främre hjärnbarken, strukturella och funktionella skillnader i vit och grå materia återspeglas i distinkt och divergerande transkriptionell profiler2. Hjärnan heterogenitet har varit ett stort hinder att tolka gen uttryck data och i fältet av hjärnskada. Denna tvetydighet i prekliniska studier har därefter lett till hundratals misslyckade kliniska prövningar av behandlingar för hjärnan skada3.
Vi använder laser fånga lokalt (LCM) metoder för att studera traumatisk hjärnskada (TBI)-inducerade genen dysreglering råtta hjärnan4, med fokus på hippocampus, en hjärnregionen som är nödvändig för inlärning och minne5. Förmågan att laser fånga och analysera genuttryck i både dö och överleva nervceller ger oss en större förståelse för rollen som stochasticity i genuttryck för att kora (neuronal överlevnad) efter TBI6. LCM tekniker har också visat sig användbara för att utforska effekterna av TBI på Hippocampus nervceller när man jämför unga och åldrande möss7 eller råttor8.
I senare studier har undersökt vi andra regioner i råtthjärna negativt av TBI, med fokus på områden hos råtta och människa TBI-patienter som är associerade med verkställande funktionen (dvs frontala cortex9) och TBI samsjuklighet; dessa sjukdomstillstånd inkluderar depression (dvs nucleus accumbens10) och dygnsrytmen störningar (suprachiasmatiska kärnan11). I tidigare studier, Huusko och Pitkanen12 och Drexel o.a. 13 brukade LCM undersöka genuttryck i thalamus och hypothalamus. Vår studie bygger på dessa tidigare observationer och inkluderar fyra andra regioner i hjärnan. För att studera de region-specifika molekylära förändringar inducerade efter TBI, var det nödvändigt att få kompetens att identifiera och få celltyper i dessa regioner som använder ett LCM-system. UV-skära och infraröd (IR) lasrar möjliggör exakt lokalt av önskad hjärnregioner. Här beskriver vi hur vi använder LCM systemet, vägledda av stereotaxic koordinater i rat brain atlas14, för att identifiera och laser fånga fyra råtta regioner i hjärnan som påverkas differentially av metoden experimentella vätska-slagverk hjärnan skada 4.
Protocol
Obs: alla djurförsök är godkända av institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas som regisserades av den nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av Försöksdjur (8: e upplagan, nationella forskningsrådet).
1. vävnad insamling, regionen identifiering och Sectioning
- angående vuxen, manlig, Sprague-Dawley-råttor, cirka sex veckor gamla och 250-300 g, till experimentella vätska slagverk skada, enligt beskrivningen i Shimamura et al. 4.
- tjugofyra timmar efter experimentell TBI, humant euthanize djuren genom att placera dem i en kammare med en isofluran koncentration 4% tills djupt sövda. Se till döden genom halshuggning, punktskatter hjärnor och genast frysa i pulverform torr-is. Store frysta hjärnor i-80 ° C frys till snittning.
- Före alla LCM-rutiner som innehåller transkriptionell analys, rengör alla ytor med RNase eliminera tvättmedel för att minska risken för kontaminering och RNA nedbrytning.
Obs: Denna rengöring omfattar den areal som används för färgning, kryostaten där vävnad är sektioneras, och området runt LCM enheten. - Hämta hjärnvävnad från lagring och plats i en kryostat kyls till -20 ° C. Tillåt hjärnan temperera till temperaturen av kryostatkammaren för ~ 10 min.
- Placera den hjärna ventral Sidan upp på en gasväv ark ovanpå kryostaten scenen. Med en ren, RNase-fri rakblad, skära av den bakre delen bara rostralt till lillhjärnan (kan sparas eller kastas) och delen bara Anterior till den optiska chiasm (och).
- Placera en liten mängd optimal styckning temperatur (ULT) medium i två separata cryomolds. Placera hjärnan (som innehåller frontala föreningen cortex (FrA) och nucleus accumbens core (AcbC)) in i cryomolds främre sidan ner. Lägg till tillräcklig OCT medium för att täcka vävnaden.
- Upprepa detta med hjärnvävnaden som innehåller hippocampus (Hp) och suprachiasmatiska kärnan (SCN).
- Tillåta OCT mediet att frysa helt för ~ 20 min i kryostaten.
- När den vävnaden och OCT medium är helt frysta, pressa en liten mängd OCT på en montering huvud och trycker på den frysta cryomolds som innehåller vävnaden på montering huvudet. Tillåta ULT att frysa helt så att mögel som innehåller vävnaden är ordentligt ansluten till huvudet.
- Säkra huvudet kvarstad snittningen fästet och dra åt skruven. Justera skärning vinkeln i förhållande till bladet kryostaten med justering spakarna att säkerställa sektioner skärs jämnt.
- Ange snittjockleken till 30 µm. När snittningen blocket vävnad som innehåller FrA och AcbC, först börjar snittning tills hjärnbarken är uppenbar och sedan börja samla.
- Hänvisning till Rat Brain Atlas 12, avsnitt och samla hjärnan avsnitt av försiktigt placera rumstemperatur polyeten napthalate (PEN) membran bilder ovanpå sektionerad vävnaden för FrA tills sekundära motoriska cortex (M2 ) uppnås vid Bregma 5,16 mm.
- Visuellt säkerställa anslutning att glida genom att inspektera om vävnad och ULT smälts helt på objektglas. Lagra alla bilder med vävnadssnitt i kryostaten tills färgning.
- Fortsätta snittning tills främre commissure (aca) blir synlig och förenar till en komplett commissure under de nu uppenbara laterala ventriklarna (LV) vid Bregma 1,80 mm.
- Samla avsnitten tills LVs visas att ansluta med aca på Bregma 0.84 mm.
- När snittningen för FrA och AcbC har slutförts, bort blocket monterade vävnad, och ersätta med block som innehåller HP och SCN.
- Avsnitt tills och tillplattad på Bregma-0.48 mm, när den tredje ventrikeln (3V) framkommer.
- Samla sektioner för SCN från denna punkt fram till Bregma -0,72 mm, när den supraoptic decussation (sox) börjar.
Obs: Det kan vara nödvändigt att samla in mer vävnadssnitt hela och som SCN är enkelt förbigås. - För HP insamling, avsnitt tills hornsna av granule cellen lager dentate gyrus (GrDG) är synligt uppenbara på Bregma-3.00 mm.
- Samla avsnitt tills de Hippocampus CA delfält smälts i koronalt avsnitt på Bregma-4.78 mm. Denna detalj möjliggör komplett samling av hippocampus under den kraniotomi och skada webbplatsen.
Obs: Som visat i tidigare publikationer från denna lab, mest skadade celler blir synliga inom denna spänner och det är lämpligt för analys för uttryck av genen eller mikroRNA.
2. Färgning protokoll
- före till färgning, tvätta alla porslin och området färgning i kemiska dragskåp med RNase-eliminera rengöringsmedel. Detta preparat motverkar risken för RNA nedbrytning på grund av kontaminering.
- Förbereda alla färgning reagenser och lösningar i nuclease gratis vatten.
- Ta ett rack av bilder som lagrats i kryostaten och plats i dragskåp. Tillåta diabilder att värma för 30 s. ställe dem i färgning lösningar (förberedd med nuclease gratis vatten) enligt följande: 75% EtOH för 1 min, nuclease gratis vatten för 1 min, 1% tolyloxi violett för 1 min, nuclease gratis vatten för 30 s, nuclease gratis vatten för 30 s , 95% EtOH för 30 s, 100% EtOH för 30 s, xylen i 3 min och xylen för 3 min.
- Tillåt racket lufttorka för mer än 10 min i rumstemperatur i dragskåp. Alternativt placera rack i ett Rnase-fri vakuum exsickator för snabbare torkning. När torkat, omedelbart gå vidare till LCM.
3. Stereotaktisk Atlas guidade Laser fånga lokalt med LCM systemet
- innan du påbörjar något LCM förfarande för RNA analys, torka området samling och området runt enheten med RNase-eliminera tvättmedel och 100% EtOH.
- Vänd strömbrytaren på IR laser genererande enhet innan du slår på mikroskopet bas, och systemet ska initiera innan program startas från skrivbordet.
Obs: Om inte slutförs i denna ordning, programvaran kommer inte att erkänna mikroskopet. - När programmet har startat upp och köra igenom dess initiera steg, tryck på den " nuläget " knappen i mjukvaran " Setup Panel. " modulära scenen kommer att flytta in i position där LCM makro Caps och diabilder kan lastas och lossas.
- Placera pennan membran glasen i hållarna (upp till tre åt gången) med frostat kanten vänd rightward.
Obs: Om placeras i hållaren i fel riktning, programvaran kanske inte kunna korrekt identifiera önskad IR eller UV klippområdet. - Klicka på den " Mem " kryssrutan i den " Cap och hantering av bildområdet " bredvid den respektiva bilden (dvs., A, B eller C). Detta steg anger om bilden är en membran glasskiva. Klicka på den önska bilden fångas först.
- Att göra kameran ta en kaklad bild för vävnad läge och orientering för cap placeringar, Välj " bild " på verktygsfältet och välj " förvärva översikt. "
Obs: Om användaren är bekant med den vävnad som samlas, detta steg kan utelämnas av använda manuell rullningskulan för att placera den " regionen Center " för samling. - Placera markören över området på kaklade bild (eller relativa läge utan kaklade bild), högerklicka och välj " plats Cap vid Region Center. " programvaran kommer automatiskt att placera ett lock över den valda positionen.
- Välj en plats.
Obs: För att säkerställa att IR laser justeras korrekt och kommer att plocka upp endast områden där ställen är fastställda i programvaran måste den vara placerad innan du fortsätter.- Flytta till ett område inom den gemensamma jordbrukspolitiken där ingen vävnad finns. Klicka på " jag " i den " Microdissect verktyg fönstret " och välj den " IR lokalisera " fliken. Från fönstret brand en IR testbild för att bedöma där IR laser bränning och storleken på plats.
- Med markören, högerklicka mitt i IR plats och välj " ligger IR plats. "
Obs: Storlek och intensitet för IR-strålen kan ändras genom att manuellt ändra den " makt, Diameter eller varaktighet " under varje strålpunkt beteckning eller genom att flytta den glidande skalan längst ned i dialogrutan. Flera provbilder kan behöva bli avskedad för att säkerställa korrekt strålpunkt. IR laser skall åter placeras varje gång positionen för den gemensamma jordbrukspolitiken förändringar eller diabilder kopplas. - För UV skärning, lokalisera den UV-lasern genom att välja de " UV lokalisera " fliken i dialogrutan.
Obs: Eftersom lasern UV och IR laser flytta unisont, det finns ingen anledning att ständigt åter hitta den UV-lasern varje gång positionen ändras.
- Välj de " frihandsteckning " alternativet i den " väljer verktyg fönstret ". En pekskärm stylus Rita runt omkretsen av regionen av intresse samtidigt noga med att inte förlora kontakten mellan pekskärmen och stylus huvudet. Se till att ansluta början och slutpunkter tillsammans.
Obs: IR ställen kommer att fastställas automatiskt via programvaran men kan användaren välja att fastställa ytterligare ställen att säkerställa vävnaden följs den gemensamma jordbrukspolitiken efter UV styckning har utförts. - För FrA samling, utföra en brutto laser fångst av kortikal vävnad upp till när M2 cortex visas på Bregma 5,16 mm.
Obs: Denna detalj kan ändras så att endast vissa delar av FrA eller specifika celltyper samlas. - För AcbC samling, laser fånga ett område nära i närhet till aca.
Kärnan och skalet av AcbC utför olika funktioner och är fysiologiskt unika. Därför är det viktigt att följa hjärnan atlas så nära som möjligt. Det rekommenderas att samla in från längre förbi bregma 0.84 mm, som två underregioner bli alltför intimt förknippade med varandra. - För Hp samling, laser fånga den CA 1, 2 och 3 Hippocampus delfält börjar på Bregma 3,00 mm och använda den helt bildade GrDG som en fysisk landmärke för morfologisk identifiering.
Obs: För tillämpningen av denna studie, samla inte förbi Bregma-4.78 mm, som visuellt kan avgränsas som punkten när de Hp delfält är smält och punkten ventralt. Detta område valdes som mest skadade nervceller kan upptäckas direkt under den skada webbplats 6. - För insamling av SCN, först visuellt identifiera den tätt packade kärnor som sitta rygg och och sedan samla.
- Efter insamling av regioner (ovan), flytta LCM makro mössor till de " QC position " och inspektera för komplett vävnad följsamhet genom att visuellt säkerställa UV skära vävnaden är kopplad till membranet. Snabbt placera den cap ontoan RNase-fri 0,5 mL tunna muromgärdade reaktionsröret innehållande 100 µL av cell lyseringsbuffert.
- Vortex prover kort att säkerställa fullständig lysis och lagra vid-80 ° C. Vid denna punkt, LCM kan pausas och prover sparas tills används för nedströms genomanalys 6.
Representative Results
Den schematiska presenteras i figur 1 illustrerar det totala arbetsflödet för atlas guidade LCM av delar av hjärnan och potentiella nedströms analys program. Denna studie fokuserar på fyra områden i hjärnan relevanta för TBI patofysiologi och utvecklingen av samsjuklighet: FrA, AcbC, SCN och Hp. En begränsning som är närvarande i LCM av delar av hjärnan är att anatomiska lokalisationerna döljs ofta av bristande definierade gränser, som kan ses i figur 2 (A, D, G, J). Användning av en hjärna atlas att vägleda snittning och laser tillfångatagandet av specifika regioner minskar risken för provet kontaminering med hjärnregioner än målet. När vård tas att följa vävnad sevärdheter, både vid snittning och efter Nissl-färgning, kan LCM teknik ge ett mycket konsekvent sätt att förvärva diskreta populationer av celler, kärnor eller regioner15. De långsiktiga målen i dessa studier är att identifiera gener och mikroRNA som potentiellt kan fungera som surrogat, icke-invasiv biomarkörer för regionen specifika hjärnskada. Det första steget i denna biomarkör utveckling pipeline är karakterisering av vävnadsspecifika transkriptionell förändringar efter experimentell TBI. Dessa data kan sedan korreleras med nervskade-inducerad förändringar i cirkulerande kroppsvätskor.
De presenterade förfaranden var optimerad för att minska risken för RNA nedbrytning för att möjliggöra RNA analys via omvänd Transkription av total LCM-RNA innan kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR). Total-RNA (inklusive små och stora RNA-arter) isolerades med en kolumn-baserade isolering metod på vävnad som var laser-tagna från enskilda hjärnregioner. För att bedöma RNA integritet, kvalitet och kvantitet efter isolering förfaranden, var RNA prover kort denatureras vid 70 ° C och kör på en RNA-analysator. Kvalitativa mätningar ingår analysera peak amplituderna för 18s 28s rRNA banden och ()figur 3), som kan vara företrädare för övergripande nedbrytning, och med hjälp av ”RNA integritet nummer” (RIN). Om använder försiktig RNase-fri tekniker, isoleras RNA från LCM prover vanligtvis resultat i RINs som sträcker sig från 6-8. En lägre RIN kan innebära dålig RNA kvalitet och kan potentiellt minska riktigheten av genen och mikroRNA uttryck analys. Däremot kan en högre RIN förbättra förtroendet i giltigheten av resultaten som genereras från RNA analys.
RT-qPCR utfördes med primer/probe set för enskilda gener och mikroRNA (figur 4). Cirka 1 ng av total-RNA var omvänd-transkriberas till cDNA och pre förstärks innan qPCR utfördes enligt tillverkarens protokollet. Skada-relaterade gener som bedöms i denna studie ingår BCL2 associerade X, apoptos Regulator (Bax), B-Cell KLL/lymfom 2 (Bcl-2), kaspas 3, Apoptosis-Related cystein-hämmare (Casp3) , Hjärnan som härrör neurotrofa faktorn (Bdnf) och CAMP Responsive Element bindande Protein 1 (Creb). MiR-15b valdes eftersom det har visats att ändras efter experimentell TBI i enskilda döende nervceller. Det har också experimentellt validerade och bioinformatically förutspådde gen mål med Pro överlevnadsfunktioner (opublicerade data). Normaliserade-faldig förändring nyckeltal beräknades genom ΔΔCt metoden jämföra genen och mikroRNA uttrycksnivåerna hos TBI djur och naiva kontroller, med normalisering till endogena genen (Gapdh) eller små RNA (U6), respektive. En-faldig förändring över 1 anger en övergripande uppreglering i gen eller mikroRNA, och omvänt, en vik ändra lägre än 1 indikerar en nedreglering. Statistisk analys visade betydande förändringar i genuttryck mellan TBI och naiva kontroll (p ≤ 0,05) som var hjärnregionen beroende. Inga signifikanta förändringar i miR-15b uttryck upptäcktes mellan TBI och naiva kontroll, men det fanns trender mot högre och lägre uttryck i en hjärnan regionen beroende mode. Dessa data tyder på att ytterligare optimering är nödvändigt att bedöma förändringar i mikroRNA uttryck. Det är också möjligt urvalsstorleken var för liten att få statistisk signifikans, delvis på grund av inneboende variabilitet i uttryck. Framtida studier kommer att omfatta sham manövrerade djur för att säkerställa att genen och mikroRNA uttryck förändringar hänförs till TBI och inte på grund av kirurgisk beredning.
Figur 1. Arbetsflödet för Atlas-guidad LCM för nedströms genomanalys. (A-F) Förfaranden från animaliska förberedelse till nedströms qPCR-analys: (A) vuxen, manlig Sprague Dawley-råttor (~ 6 veckors ålder och väger 300 g) är sövd, utsatts för vätska slagverk TBI och humant avlivas 24 h efter skada. (B) seriell avsnitt (30 µm) av färska frusna hjärnor är baserade på koordinaterna för delar av hjärnan (FrA, AcbC, Hp, SCN) från Paxinos och Watsons The Rat Brain atlas. (C) avsnitt är fasta, Nissl-färgade (1% tolyloxi Violet), uttorkad, och lufttorkas. (D). LCM utföras på identifierade regioner i hjärnan med en LCM-System. (E) LCM makro Caps överförs till ett RNase-fri 0,5 mL rör med 100 μL lyseringsbuffert cell och lagras vid-80 ° c tills RNA isolering för nedströms genomisk analys. RNA kan sedan vara omvänd-transkriberas för genen eller mikroRNA RT-qPCR-analys att undersöka differentiell uttryck för molekylär hanteringspaketobjekt efter TBI eller mellan regioner i hjärnan av intresse (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. LCM av TBI påverkas hjärnregioner. Representativa bilder av vävnadssnitt insamlade från den ipsilaterala sidan skadan webbplats med IR och UV-laser funktioner på LCM systemet (A-jag). Vävnaden var sektioneras på en kryostat (30 µm) och samlas in på pennan membran bilder. Avsnitten var sedan fast, Nissl-fläckade tolyloxi violett (1%), och uttorkad för att identifiera specifika hjärnregioner baserat på anatomiska landmärken som refereras i Paxinos och Watsons The Rat Brain Atlas. (A-C) Ett område av frontala föreningen cortex (FrA) (D-F) komponenter i CA1, CA2 och CA3 pyramidal lager av hippocampus (Hp) ligger bredvid fullt bildade hornen av lagrets granule av dentate gyrus (GrDG). (G-I) Ett område av nucleus accumbens coRe (AcbC) proximala och rostralt om främre commissure (aca). (J-K) Suprachiasmatiska kärnan (SCN) rostralt om den supraoptic chiasm (och). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representant skanningar av RNA kvalitet. Representant elektroferogrammen och associerade gel bilder av RNA som härrör från LCM samlat vävnad (A-D). Elektroferogrammen och associerade gel bilder visar intakt RNA baserat på utseendet på 18s och 28s rRNA toppar och gel band. Detta RNA är lämplig för alla efterföljande program, inklusive genomisk och proteomiska analyser. (A) frontala föreningen cortex (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) kärnan accumbens core (AcbC) RNA. RIN 7,3. (D) suprachiasmatiska kärnan (SCN) RNA. RIN 7,6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Efterföljande analys av hjärnan regionspecifika genen och mikroRNA uttryck via RT-qPCR. Enskilda RT-qPCR för gener av intresse (Bcl-2, Casp3, Bdnf, Bax, Creb) och mikroRNA sevärdheter (miR-15b) utfördes på laser fångas av hjärnan efter TBI (Hp och AcbC n = 5, FrA n = 4) och jämfört oskadd naiva djur (n = 4). Analys av gener besläktade med TBI patogenes utfördes för Hp, AcbC, FCx. Data presenteras som normaliserade fold change nyckeltal jämfört naiv kontroll av hjärnan (oparat t-test med Welchs korrigering ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differentiell uttryck för miR-15b i olika hjärnregioner presenteras som normaliserade fold ändringar jämfört naiv kontroll (± SEM) (B). Data från SCN (n = 2) ingår inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Molekylära studier av däggdjur hjärnan, har LCM blivit en viktig teknik. Denna artikel visar att använda en kombination av IR och UV-skära lasrar i LCM systemet kan fånga genomiska förändringar i någon region av hjärnan som däggdjur. Dessa regioner omfattar de identifierbara med konventionella LCM-kompatibel fläckar, såsom tolyloxi violett eller hematoxylin och eosin. Hastigheten på laser-fånga processen och förmåga att utföra LCM på tjockare 30 µm sektioner på pennan membran bilder tillåter inte bara erhålla tillräckliga kvantiteter av cellprover, men också att isolera RNA från LCM prover av lämplig kvalitet för alla typer av nedströms Genomanalys; dessa analyser inkluderar microarrays16, PCR matriser17och kvantitativ realtids PCR-18.
Våra data ge en motivering för studier som använder LCM vävnad. Finner vi att miR-15b är uppreglerad i hippocampus och cortex (figur 4) men nedreglerade i kärnan accumbens och kan vara biologiskt relevanta för förståelsen av differentiella effekter av TBI i hjärnan. En tidigare studie föreslog att ökningar av kortikala neuronala sårbarhet för skada resultera från överuttryck av flera MicroRNA som negativt reglerar Pro överlevnad gener, såsom Bcl-219. Målet scan analys visar Bcl-2 regleras också av miR-15b; alltså våra data tyder på en mekanistisk förklaring till varför vissa regioner av hjärnan (dvs., FCx) selektivt kan utsättas för TBI. Det är viktigt att komma ihåg de flesta gener regleras av flera MicroRNA och korrelera förändringar i någon en miRNA till en specifik gen är svårt. Dessa data indikerar dessutom att vissa förändringar i genen och mikroRNA uttryck kan användas som biomarkörer för region-specifika hjärnskador. Ja, vi använder dessa data i studier av hur nya nervskyddande läkemedelssubstanser med antidepressiva egenskaper differentially kan påverka genen och mikroRNA uttryck i regioner av hjärnan kopplade till neuropsykiatriska funktionsnedsättningar. En begränsning av vår studie är att under flera steg i bild bearbetningsprocesser för LCM, RNA integritet kan bli nedsatt. Det här protokollet beskriver nödvändiga åtgärder för att minska risken för RNA nedbrytning. En annan begränsning är den relativt lilla urvalet används för statistisk beräkning. I framtida bör studier, ökande stickprovsstorlek minska effekterna av genen och miRNA uttryck variationer bland enskilda djur.
Nyttan av LCM realiseras i translationell genomisk studier med hjälp av djurmodeller av mänskliga sjukdomar och sjuk vävnad20,21,22,23. Utan förmågan att fånga specifika cellpopulationer, vore transkriptionell profiler för olika hjärnregioner en omöjlig och undecipherable mix av många celltyper. Med hjälp av LCM metoder i hjärnan skada studier har lett till nuvarande ansträngningar att avgränsa hjärnan regionen specifika biomarkörer och förstå hur de korrelerar med cirkulerande biomarkörer för TBI.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna Elizabeth Sumner för hennes hjälp med att redigera Detta manuskript. Finansiering för projektet lämnades delvis av The Moody Project för translationell traumatisk skada hjärnforskning och RO1NS052532 till HLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
| Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
| Lightcycler 96 System | Roche |
References
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).
- Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
- Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
- Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
- Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
- Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
- Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
- Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscience. 267, 30-45 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
- Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).
- Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).
- Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).
- Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
- Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
- Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163 (2010).
