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制药行业因不锈钢表面不洁净导致的清洁验证失败

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DOI：

10.3791/56175

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2017年8月11日

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1Analytical Research and Development, Novartis Pharmaceuticals Corporation

本文内容

摘要

在清洁验证过程中，回收率低且结果不稳定的主要原因是缺乏一种能够持续有效清洁试片表面的明确定义的操作程序。本文描述了清洁不锈钢试片的正确方案。

摘要

本研究旨在确定影响从不锈钢试片表面回收药物残留物的参数。评估了一系列因素，包括药品加标水平、加标方法、药物-辅料比例、不同分析人员之间的差异、日内差异以及试片的清洁程序。结果发现，缺乏一种能够 consistently 清洁试片表面的明确定义的操作流程，是导致回收率低且变异较大的主要原因。采用原位清洗溶液（CIP）对试片表面进行清洁的评估结果显示，无论先前评估的条件如何，回收率均较高（>90%），且结果具有良好的重现性（Srel≤4%）。该方法已成功应用于小分子（分子量 <1,000 Da）以及大分子生物药物（分子量高达 50,000 Da）的清洁验证。

引言

在中间体和活性药物成分（API）生产过程中，非专用设备在更换产品时必须验证其清洁度，以防止交叉污染，并确保其在后续使用前符合要求。清洁程序应包含足够的细节，以便操作人员能够以可重复且有效的方式清洁各类设备，并且这些程序应根据美国食品药品监督管理局（FDA）的要求进行验证1。FDA已多次发出警告信，指出存在清洁不充分2,3,4、未能验证清洁验证方法以及未遵守清洁程序等问题5。21 CFR §211.67 规定了成功实施清洁验证所需满足的要求。

行业标准要求，在与生产设备具有相同表面/光洁度的不锈钢试片上进行清洁验证分析方法的验证。在实验室中，使用不锈钢试片（例如，50 cm2）代表设备表面进行清洁验证实验。在这些分析方法的开发与验证过程中，将目标残留物（即，应从设备表面回收的残留物）加标至不锈钢试片上，其加标量由最大允许残留携带量（MACO）限值确定。该限值基于可接受暴露限（AEL）确定，后者定义为患者暴露后不会产生不良健康影响的限值（无可见不良反应水平，NOAEL）。

执行擦拭取样的分析人员或生产操作人员必须遵循结构化的操作程序，以确保无论由谁执行取样，回收率均可重现。该程序应明确说明擦拭拭子的类型、使用的拭子数量、稀释液、所用溶剂的体积、精确的擦拭轨迹、在取样表面施加的擦拭次数、擦拭/提取样品所用的时间，以及检测方法（紫外光、荧光、质谱、总有机碳） 等等。），拭子头部样本的提取技术等

除了上述所有影响样品回收率的因素外，试样表面以及因此设备的表面也起着重要作用。试样表面可能由于表面沉积了一层薄薄的物质，或由于不锈钢中一种或多种元素的氧化态发生变化而被改性。例如，铁（Fe）、铬（Cr）和镍（Ni）6,7,8不锈钢片表面再生至原始状态对于定量转移过程的成功至关重要。研究表明，若不锈钢片未得到充分清洁，会导致回收率出现差异，这种差异可能源于不同分析人员、不同药物或不同的加标水平。9,10,11单个试样上十次重复的回收率标准偏差可达14%，五个试样上的标准偏差可达26%9需要注意的是，相对标准偏差（Srel）值随着重复次数的增加或所用试片数量的增加而升高（即，五个试样而非在同一试样上重复加样五次）11在这种情况下，变异性不能被解释为随机波动。然而，他们的结果可以通过我们的发现来解释，即试片表面的清洁程度会影响回收率。本文所述结果表明，在对不锈钢试片表面进行适当清洁后，回收率显著提高，变异性显著降低。

原位清洗（Clean-in-place, CIP）是一种自动化清洗设备表面的方法，其特点是在清洗过程中几乎无需或完全无需拆卸设备。在CIP清洗过程中，按照既定程序，依次使用碱液和酸液进行连续清洗，以去除设备表面的有机和无机残留物。通常在CIP清洗液中添加表面活性剂、螯合化合物或络合剂，以提高从设备表面清除残留物质的效率。清洗效果取决于多个参数，包括CIP清洗液的种类和浓度（即，碱、酸和表面活性剂的类型与成分，清洗时间，温度（通常为60 - 80 °C），污染物类型，以及是否存在难以清洗的部件12根据药物产品的类型，选择CIP溶液100和200用于清洁用于清洁验证的不锈钢试片，因其可模拟用于清洁生产设备的CIP过程。

本研究报道了影响不锈钢片表面药物残留回收率的各种因素，并推荐了针对小分子、治疗性蛋白质和抗体的分析性清洁方法开发的最佳实践。研究发现，缺乏明确定义且能持续清洁片材表面的程序是导致回收率低且结果不稳定的主要原因。当片材表面得到适当清洁时，可获得高且可重复的回收率13。

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方案

1. 样品溶液

  1. 根据治疗剂量标准下的最大允许残留量（MACO），计算药物的清洁限度（CL）。
    注：此处，根据治疗剂量标准下的最大允许残留量（MACO），已计算出药物A的清洁限度（CL）为每50 cm2 2.4 µg。清洁验证分别在清洁限度的50%、100%和150%水平下进行。已针对两种制剂（2.5%和60% w/w 药物载量）进行了清洁验证评估。

2. 样片的清洗程序

  1. 初始方法
    1. 用清水冲洗并擦拭样品表面 10 - 15 秒，重复两次，再用甲醇重复清洗两次，以去除任何残留物。由于甲醇具有毒性和高挥发性，该操作应在通风橱中进行。
  2. 进阶方法
    1. 使用原位清洗溶液
      1. 将超声波清洗器设置为室温。该超声波清洗器无功率调节功能，因此需通过设定时间以获得充分的清洗效果。
      2. 将样品浸入高效液相色谱（HPLC）级水中，超声处理 2 分钟。
      3. 将样品浸入含 0.1% 碱性洗涤剂的 HPLC 级水溶液中，超声处理 2 分钟。
      4. 将样品浸入 HPLC 级水中，超声处理 2 分钟。
      5. 将样品浸入含 0.1% 酸性洗涤剂的 HPLC 级水溶液中，超声处理 2 分钟。
      6. 将样品浸入 HPLC 级水中，超声处理 2 分钟。
    2. 使用酸-碱-过氧化物
      ​注：此为一种替代方法，使用酸、碱和过氧化物，而非碱性和酸性洗涤剂。
      1. 将超声波清洗器设置为室温。该超声波清洗器无功率调节功能，因此需通过设定时间以获得充分的清洗效果。
      2. 将样品浸入水中，超声处理 2 分钟。
      3. 将样品浸入 0.1 M 氢氧化钠溶液中，超声处理 2 分钟。
      4. 将样品浸入水中，超声处理 2 分钟。
      5. 将样品浸入 0.1 M 盐酸溶液中，超声处理 2 分钟。
      6. 将样品浸入水中，超声处理 2 分钟。
      7. 将样品浸入 0.1 mg/mL NaNo2 溶液中，超声处理 2 分钟。
      8. 将样品浸入水中，超声处理 2 分钟。

3. 擦拭操作步骤

  1. 使用双面胶带将不锈钢试片固定在250 mL（或500 mL）塑料烧杯底部。
  2. 握住烧杯以便于进行加标和拭子采样操作，同时也能最大限度地减少某些不良事故的发生，例如拭子采样时超出角落范围。
  3. 以特定浓度和配方注入确定体积的溶液例如使用正排量移液器，以旋涡方式将200 µL含12 µg/mL药物A（载药量为2.5% w/w）的溶液加至样品表面。
  4. 等待试片表面干燥（约 3 - 10 分钟，具体时间取决于样品的挥发性）。
  5. 将干燥的拭子浸入含有2 mL稀释液（甲醇：甲酸，100:0.2，体积/体积）的小瓶中。
  6. 通过将拭子按压在小瓶内壁上来去除多余的溶剂。
  7. 用均匀、重叠的左右擦拭动作，用力擦拭试片表面，直至总行程达到50 cm2 用湿棉签的一侧擦拭测试区域。
  8. 使用棉签的同一面重复擦拭步骤（步骤 3.7）。
  9. 用拭子将样片的四条边缘各擦拭两次。
  10. 翻转棉签至另一侧，将拭子垫旋转90°，顺时针或逆时针方向均可，从而使拭子涂抹方向旋转90°。
  11. 重复步骤 3.7 - 3.9 中所述的拭子采样操作。表面采样完成后，用剪刀将拭子头剪入溶剂小瓶中。
  12. 用第二根棉签重复拭子操作，同时将样本片朝之前选定的相同方向旋转90°。
  13. 将含有两个拭子头的试管超声处理5分钟，然后涡旋振荡10秒。
  14. 将溶液转移至高效液相色谱小瓶中，并标记为工作溶液。

4. 回收率的计算

  1. 样品回收
    1. 通过将每种试纸加标溶液各200 µL与1,800 µL稀释液混合，制备对照溶液。
    2. 按照表1中列出的条件运行色谱系统。
    3. 根据工作溶液的峰面积（AW）与对照溶液的峰面积（AC）计算拭子工作溶液的回收率。
    4. 在三个试纸上重复该过程，并计算平均回收率及相对标准偏差（Srel）。
      注：此处使用的所有分析方法均依据ICH Q2(R1)指南进行验证。色谱条件见材料部分。

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结果

药物A清洁验证初始尝试的代表性结果总结见表2。在按照实验部分所述详细步骤对样品片进行清洁之前，在不同加标水平、不同原料药/辅料比例、不同实验人员之间，甚至同一实验人员在不同日期的操作中，均获得了不一致的结果。回收率的这种变异性需要解决，因为部分结果未能满足验证要求（60% < 回收率 < 150%），例如在所有清洁限值下，60%药物载量的回收率均不符合要求。

在表2中观察到的第一类变异性是精密度的变异性，这从大多数回收率结果所对应的较高Srel值（括号中列出的数值）可以看出。除了预期的分析人员间变异性（参见参考文献13中的数据），即使其他条件保持不变，单个分析人员在不同天之间也表现出日间变异性，如表2中前两次实验（在2.5%药物载量下）所示。在不同的...

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讨论

不锈钢片表面API残留回收率低且结果不稳定的主要原因是缺乏明确的片材表面清洁操作规程。对片材表面进行清洁后，加标回收率结果一致且准确，重现性良好。通过在不锈钢片上实现高回收率的验证，采用经验证方法从生产设备获得的实际清洁验证结果应准确、精密，真实反映设备上的残留水平，最大限度降低因产品间交叉污染导致假阴性结果的风险，从而保障患者安全。

分析人员最初通过调整实验条件（如稀释剂中的有机相比例、加标过程、加标溶液中所用酸的种类和浓度等）来排查回收率低且不一致的问题。然而，该方法未能解决回收率低且不稳定的问题。当使用原位清洗溶液对不锈钢表面进行充分清洁后，上述问题得以彻底解决。这一改进显著提高了生产设备清洁验证成功通过的可能性。需要指出的是，本文所使用的原位清洗溶液仅限于制药行业，因此其他行业（如加工食品、乳制品、化妆品等）应选择合适的原位清洗溶液。 等等。）。CIP 溶液的选择及清洗过程是该工艺成功的关键步骤。本文所述方案将有助于制药行业及其他行业的分析人员更有效地设计和实施成功的清洁验证。该工作还将有助于最大限度地减少批间和/或产品间的交叉污染，从而避免对人类健康产生...

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披露

不存在经济利益或利益冲突。

致谢

本研究未获得任何资助机构的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不锈钢试片 GlobePharma (New Brunswick, NJ ). SS316-20RA-50cm2
原位清洗液（CIP100 和 CIP200） 购自 Steris Corporation (Mentor, OH)1D10BG分别为碱性清洗剂和酸性清洗剂
正排量移液器Gilson (Middleton, WI). 
高效液相色谱级水Millipore Milli-Q Advantage 水纯化系统 (Darmstadt, Germany)  或 Honeywell Burdick & Jackson (Muskegon, Michigan)7732-18-5
高效液相色谱级甲醇EMDMX0475-1
冰醋酸 EMDMAX0073P5
高效液相色谱级乙腈 J.T. Baker (Avantor Performance Materials, Center Valley, PA)75-05-8
三氟乙酸J.T. Baker (Avantor Performance Materials, Center Valley, PA)75-05-8
色谱柱 Zorbax Eclipse XDB-C18, 4.6 x 100 mm, 3.5 µm HPLC 柱UNSPSC – 41115709
Vanquish 超高效液相色谱系统 Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany
Branson B8510 超声波清洗器 Branson Ultrasonics (Danbury, CT, USA)型号 (8510-D7H)

参考文献

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