Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56275
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 4, 5, 5, 1
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Ett enkelt och effektivt Mikroskop protokoll för genen redigering i kanal havskatt embryon med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet presenteras. I detta protokoll, vägleda RNAs och Cas9 protein var microinjected in äggulan i en cell embryon. Detta protokoll har validerats genom att slå ut två kanal havskatt immunrelaterade gener.

Abstract

Hela genomet hos kanal Havskatten, Ictalurus punctatus, har varit sekvenserade, leder till större möjligheter för att studera kanal havskatt geners funktion. Gen knockout har använts för att studera dessa gen funktioner i vivo. Den klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner/CRISPR associerade protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet är ett kraftfullt verktyg som används för att redigera genomisk DNA-sekvenser för att förändra geners funktion. Den traditionella metoden har varit att införa CRISPR/Cas9 mRNA i enskild cell embryon genom Mikroskop, kan detta vara en långsam och ineffektiv process i havskatt. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för Mikroskop kanal havskatt embryon med CRISPR/Cas9 protein. Kort, ägg och spermier var insamlade och sedan konstgjord befruktning utförs. Befruktade ägg överfördes till en petriskål innehållande Holtfreters lösning. Injektionsvolym kalibrerades och sedan leda RNAs/Cas9 inriktningen i toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM 1) och genen rhamnos bindande lektin (RBL) var microinjected in äggulan i en cell embryon. Den gen knockout var framgångsrik som indels bekräftades av DNA-sekvensering. De förutspådda protein sequence förändringarna på grund av dessa mutationer ingår frameshift och trunkeras protein på grund av för tidig stop kodon.

Introduction

Mikroskop är en vanlig laboratorium teknik används för att leverera en liten mängd av ett ämne som DNA, RNA, proteiner och andra makromolekyler i celler eller embryon genom ett glas kapillär1. Mikroskop utförs med specialutrustning setup inklusive en microinjector, micromanipulator och en Mikroskop2. Tekniken har använts av forskare att genetiskt modifiera många organismer genom generationen av transgenics, gen knockouts och genterapi, med syftet att förstå dynamiken i intracellulära komponenter3,4 , 5.

Kanal havskatt (Ictalurus punctatus) är den mest populära havskatt arten i vattenbruket och fritidsfiske verksamhet i USA. Det finns ett ökat behov att studera funktionsgenomik i kanal havskatt och sekvensering av hela genomet hos kanal havskatt ökar nyttan av senaste framstegen i genomet redigering verktyg6,7. Förstå geners funktion skulle inte bara berika den forskning som bedrivs på havskatt, men kan också leda till effektivare genetisk förbättringsprogram att förbättra branschens havskatt. När kritiska gener för en given egenskap av intresse har identifierats, kan de användas till att genetiskt förbättra havskatt produktion genom gen editering för att skapa fördelaktiga alleler, urval för dessa alleler, undertrycka de skadliga alleler, överföra de fördelaktiga allelerna genom genmodifiering, eller någon kombination av dessa alternativ. Att kombinera de bästa generna för olika kommersiellt fördelaktigt drag från olika arter i en fisk skulle avsevärt förbättra produktivitet och lönsamhet av fisk produktion verksamhet8.

Gen knockout är en direkt metod att studera gen funktioner i vivo. Mutationer på DNA-nivå kommer att ärvas av kommande generationer som kommer att underlätta studiet av deras effekter i olika generationer. Olika genomet redigeringsverktyg har utvecklade inklusive zink finger nukleotider (motvilligt), transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs), och klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner/CRISPR-associerade protein 9 (CRISPR/Cas9 ) system9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 systemet är ett kraftfullt och effektivt verktyg som har använts för att redigera genomisk DNA-sekvenser som bland annat gene knockout i fisk genom RNA-guidad platsspecifika DNA klyvning5,13. Systemet består av en guide-RNA (gärna), som bestämmer den rikta sekvensen i arvsmassan och en DNA endonukleasenzymet, Cas9. CRISPR/Cas9 systemet kan vara utformade för att rikta någon sekvens i genomet med flera fördelar över motvilligt och TALENs: (1) lägre kostnad (2) enklare teknik (3) mer specifik bindning av guide RNA till målet sekvensen, och minskad off-target mutationer (4) flera sekvenser kan riktas med olika gärna i samma tid (5) hög mutagenes takt i gener som inte kunde vara muterad av TALENs och (6) förbättrad könsceller dataöverföringen klassar av mutationer för upp till 6 gånger jämfört med motvilligt och TALENs14, 15,16,17,18.

Den huvudsakliga alternativa metoden för Mikroskop är elektroporation, där elektriska impulser tillämpas på embryon eller celler att öka membran permeabilitet och upptaget av biologiska molekyler19,20. Flera transgen fisk genererades med elektroporation såsom medaka (Oryzias latipes), zebrafisk (Danio rerio), chinook lax (Oncorhynchus tshawytscha), kanal havskatt, havsruda (Sparus sarba), och vanlig karp (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporation har använts för att leverera plasmid DNA, RNA och Cas9 protein för genen knockout. I däggdjursceller Cas9/gärna plasmid DNA, Cas9 mRNA/gärna och Cas9 protein/gärna komplex levererades med elektroporation och mutagenes var högsta använda Cas9 protein/gärna komplex för de flesta elektroporation villkor testade27. I den ascidian Ryggsträngsdjur (Ciona intestinalis) var TALENs uttrycker konstruktioner electroporated i befruktade ägg att inducera knockout av flera gener28. Motvilligt att uttrycka plasmid konstruktioner var electroporated att slå ut luteiniserande hormon i kanal havskatt29. Men när förs in i cellen, plasmid konstruktioner måste transkriberas till RNA och översättas till funktionella proteiner innan de kan rikta den önskade DNA-sekvens, vilket sannolikt skulle fördröja tiden för mutagenes jämfört med Mikroskop av RNA / protein. Som ett embryo utvecklas, ökar fördröjd mutagenes mosaicism av injicerade grundare. Transgena uttrycket är dessutom osannolikt att uppnå uttryck möjligt med Mikroskop, sänka mutagenes effektivitet.

Som ett medel för att införa genomet redigeringsverktyg i celler, har Mikroskop flera fördelar jämfört med elektroporation. Genomet redigering molekyler kan föras på ett tillförlitligt sätt in celler eller embryon genom Mikroskop30. Mindre injektion material behövs. Det är lätt att fastställa beloppen av materiellt injiceras. Högre mutation priser med låg mosaicism i grundare fisken kan vara uppnått som skulle förbättra könsceller överföring av mutationer i F1. Färre grundare fisk behöver analyseras för att producera den första generationen, på grund av den högsta mutationshastighet. I elektroporation behöver mer grundare fisk analyseras som kommer att öka kostnaderna. Överlevnaden av kanal havskatt microinjected embryon är dock lägre än electroporated sådana, men detta kan lösas genom att injicera fler embryon31,32. I kanal havskatt, överlevnad av äggula-microinjected embryon varierade mellan 16 och 55%, beroende på de gener som riktas och doseringen av gärna/Cas9 protein32.

Regelbundna Mikroskop av havskatt embryon är tekniskt krävande och tidsödande, men en snabb och effektiv CRISPR/Cas9 protein Mikroskop protokoll presenteras för kanal havskatt embryon. Detta protokoll kräver mindre tid och expertis eftersom CRISPR/Cas9 protein lösningen injiceras i äggulan i en cell embryon. Hundratals befruktade ägg kan injiceras i 1 h (ungefär den tid som behövs för den första celldelningen förekommer). För att validera protokollet, slogs två känslighet-relaterade sjukdomsgener ut i kanal havskatt, toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) genen och rhamnos bindning lectin (RBL) genen. TICAM 1 är involverad i den signalväg som initierats av toll-liknande receptorer (TLR) 3. I kanal havskatt var TICAM 1 dramatiskt uppreglerad efter Bakterieutmaningen med Edwardsiella ictaluri, medan det var nedreglerade i blå havskatt, en art som är resistent till E. ictaluri33. RBL spelar en viktig roll i tidiga infektion med Flavobacterium columnare, vilka smittämnen av columnaris sjukdom, där akut och robust uppreglering spelades in i en columnaris-mottagliga kanal havskatt stam jämfört med en columnaris-resistent stam34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta experiment utfördes vid forskningsenheten fisk genetik, E. W. Shell fiske Research Center, Auburn University, AL. Alla experimentella protokoll som används i detta experiment godkändes av Auburn University institutionella djur vård och användning kommittén (AU-IACUC) innan experimentet initierades. En lista över den utrustning och förnödenheter som används i detta experiment kan hittas i tabellen material. Följande är de steg och procedurer för beredning och Mikroskop kanal havskatt en-cell embryon som illustreras i figur 1.

1. grubbla lager urval och lek

  1. Välj friska kanal havskatt barnaskara lager stam eller genetiska linje av intresse. Kanal havskatt hanar och honor bör uppvisa bra sekundära kön egenskaper.
  2. Välj hanar som har ett brett muskulös huvud som är bredare än resten av sina kroppar med väl utvecklade könsorgan papilla. Mörk färg, ärrbildning och sår från territoriella striderna är också tecken på sexuell beredskap. Välj honor som har huvuden som är smalare än resten av sina kroppar, och har mjuka, påtaglig, väl avrundad buken. För noggrannhet och för att undvika att stressa fisken under inledande hantering, sluta mata honorna 2-3 dagar innan man undersöker deras beredskap för lek.
  3. Utföra fisk hantering snabbt, men försiktigt. För att minska hantering stress, utför alla procedurer som kräver hantering honor samtidigt håller fisk i leken väskor (32 mm storlek mesh).
  4. Precis före hormon injektion att framkalla ägglossning, mäta kroppsvikt av kvinnlina.
  5. Hänga de lekande väskorna med honor inne i ett flöde genom tank med kontinuerlig vattenflödet och tillräcklig luftning.
  6. Aseptiskt, ladda den implantatinjektorn som har en 14 G nål med 85 µg/kg luteiniserande hormon hormon analoga (LHRHa) implantat. Skölj injektionsstället (ryggens muskulatur) med 0,9% steril koksaltlösning före injektion. Infoga implantatinjektorn i 45° vinkel och frisläppa implantatet. Ta ut nålen och svep injektionsstället med en bomullstuss som tidigare indränkt i 70% etanol.
  7. Plats lekbeståndets påsen i uppsamlingstank så att fisken är helt nedsänkt i vatten 15-20 cm under vattenytan. Tillräcklig luftning (över 5 ppm upplöst syre) och god vattenkvalitet är viktiga för ägglossning av högkvalitativa ägg.
  8. Förutsäga ägglossning tiden baserat på vattentemperaturen med grad-timme (h) förhållandet35. Grad-h svarstid = tiden mellan hormon injektion och ägglossning (h) * vattentemperatur (° C). Till exempel för en grad-h svarstid på 900-1000, förväntas en kvinna leka vid 36-40 h från hormon injektion tid vid 25 ° C. Vanligtvis görs den första kontrollen för ägg vid ca 36 h efter hormon injektion och därefter vid 4 h intervall.
  9. För att kontrollera ägglossning, lyft försiktigt lekbeståndets påsen ovanför vattenytan medan du letar efter äggen som är kopplade i lekbeståndets påsen. Att se minst 10 ägg anger denna kvinna är ägglossning och redo för hand strippar.

2. spermier förberedelse

Obs: Spermier kan förberedas några h före den beräknade ägglossningen.

  1. Euthanize hanar av ett dunkande slag mot huvudet utan bedövning, eftersom anestesi kan ha en negativ effekt på spermiernas rörlighet.
  2. Samla testiklarna i en liten väger kastrull, ta bort någon vävnad och tvätta dem med 50 mL 0,9% saltlösning ta bort blod, om det behövs. Väl utvecklade testiklar är vita med många underbett prognoser ( figur 2).
  3. Bestäm vikten av testiklarna.
  4. För att förbereda spermier lösningen för ägg befruktning, överföra testiklarna till mitten av en 100 cm2 100 µm mesh med pincett. Vik mesh med testiklarna inne, krossa testiklarna och filtrera spermier till en 50 mL samling tub. Detta kan göras genom att tillämpa tryck att testiklarna inuti mesh mot kanten av samling röret via tummen. Använda 0,9% koksaltlösning för att tvätta spermier från mesh i samling röret. Koksaltlösning kan läggas upp till 10 mL/g av testiklarna.
  5. Bestämma koncentrationen av spermier, kontrollera den motilitet och.
    Obs: Koncentration kan bestämmas genom att räkna spermacellerna i en känd utspädda volym milt med en hemocytometer. Alternativt kan spermier densiteten beräknas genom att utvärdera den optiska densiteten för milt med en spektrofotometer. I denna metod, är absorptionen vid 505 nm våglängd jämfört med ett styrdiagram som tidigare har förberetts för absorption av olika koncentrationer av spermier36. Spermiernas rörlighet kan kontrolleras under mikroskopet som tiden från aktivering av spermier tills upphörandet av spermier rörlighet (kallas motilitet varaktighet)37. Livskraften hos spermier kan bestämmas genom färgning spermier med selektiv färgämnen såsom trypan blå, som kommer att färga bara icke livsdugliga sädesceller, medan livskraftig sperma kommer att förbli ofärgade. Dock för dessa Mikroskop är detta inte nödvändigt om testiklarna är väl utvecklade.
  6. Lagra spermier i 0,9% saltlösning från steg 2.5 vid 4 ° C och Använd inom 24 h efter beredning.

3. ägg insamling och gödsling

  1. Applicera ett tunt lager av vegetabiliska förkortning till en ren och torr lekande pan 20 cm i diameter.
  2. Placera honan i narkos lösningen innehållande 100 ppm av buffrad tricaine metan sulfonat med natriumbikarbonat (slutliga lösningens pH bör 7.0) tills fisken är helt sövda38.
    Varning: Tricaine metan sulfonat kan verka irriterande vid inandning, förtäring eller absorberas genom huden.
  3. Noga, ta bort fisken från lekbeståndets påsen och doppa den i 0,9% koksaltlösning att tvätta bort bedövningsmedel lösningen. Torka fisken helt med en ren handduk, undvika borttagning av slem lagret på fisk förkroppsliga ytbehandlar.
  4. Gälla området runt ventilen, inklusive bukfena, för att förhindra utmätning av äggen under hand strippar vegetabiliska förkortning.
  5. Hand band äggen i smord lekbeståndets pannan genom att tillämpa milda tryckningar på äggstockarna. Bra ägg bör flöda fritt, gyllene gul färg och har minimal eller ingen klumpar eller blodproppar (figur 2). Undvik kontakt mellan ägg och vatten innan befruktning, eftersom vatten kan stimulera micropyle stängning.
  6. För att befrukta äggen för Mikroskop, överföra 200 – 300 ägg till en smord lekbeståndets pan. Smord plast växt etiketter kan användas som en sked för att överföra ägg i smord lekbeståndets stekpannan. Tillsätt 1-2 mL av spermier lösningen (från steg 2.5) till äggen och blanda försiktigt. Förhållandet av spermier att ägget bör vara cirka 11.000 spermier/ägg.
  7. Lägg till sötvatten till äggen att aktivera spermier och ägg. Tillsätt tillräckligt med vatten för att täcka något ägg. Snurra försiktigt äggen för 30 s. befruktning ska ske 1 – 2 min. Det är viktigt att befrukta ägg som är ordnade i ett enda lager. Havskatt ägg fäster vid varandra gör det svårt att microinject flera lager av embryon.
  8. Tillsätt mer sötvatten att de befruktade äggen och låt äggen att härda för 10 – 15 min.
  9. Täcka lekbeståndets pannan innehållande de återstående Obefruktade ägg en våt handduk för att förhindra uttorkning och gödsla under några timmar. Befruktning kan ske i ett förskjutet sätt, till exempel, en batch 200 – 300 ägg kan vara befruktade varje 30 – 60 min för att säkerställa en kontinuerlig tillförsel av embryon i en cellstadie för Mikroskop och kontroll icke-injiceras embryon. Undvik kontakt mellan våta handduken och äggen som äggen kan följa den blöt handduk som gör det svårt att ta bort dem. I detta protokoll, ägg befruktas inom 2 – 3 h efter avisolering var effektivt microinjected och hade liknande framgång som ägg befruktas omedelbart efter strippning.

4. nålen dra och lastning

  1. Dra en 1,0 mm OD borosilikatglas kapillär i 2 nålar (figur 3). Lagra nålar i en pappask med en bit svamp där flera snitt har gjorts. För att undvika att bryta nålen, bör diametern av svampen vara mindre än längden på nålen stammen.
  2. Öppna nålspetsen genom att bryta en liten bit av nålens tunnaste regionen med hjälp av ett vasst föremål. Alternativt, öppna nålen genom att nypa av tunnaste regionen av spetsen med pincett under mikroskopet.
  3. Förbered injektionslösningen genom att blanda gRNA(s) med Cas9 protein. Andra typer av RNA och protein kan även injiceras med samma förfarande. I detta protokoll, gRNAs designades till mål två av kanal havskatt immun relaterade gener, toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) och genen rhamnos bindning lectin (RBL) och upprättad enligt Shah et al. med användning av en naturtrogen Taq polymeras32,39. De genomiska mål för gRNAs var 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' för TICAM 1-genen (figur 4) och 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' för exon 1 RBL gen med protospacer intill motiv (PAM) sekvens understrukna (figur 6).
    1. BLAST guide RNA mål mot kanal havskatt arvsmassan sekvens och välj de med inga potentiella off-target-platser.
    2. Lägga till fenolrött färg gärna/Cas9 proteinet blanda till en tredjedel av den totala volymen.
    3. Justera gärna/Cas9 protein mix med nuclease gratis vatten slutliga koncentration så att varje embryo injiceras med 50 nL innehållande cirka 2,5 ng gärna och 7,5 ng Cas9 protein. Inkubera blandningen i 10 min på is före användning.
  4. Med en microloader, Fyll på 5 – 10 µL av gärna/Cas9 blandningen i injektionsnålen genom att infoga microloader in nålen stammen och utvisa blandningen långsamt medan Upprullningskraften microloader spets (figur 3). Undvika svällning luftbubblor inuti.
  5. Fäst nålen till innehavaren mikropipett och säkerställa en tät anslutning, och sedan bifoga innehavaren till micromanipulator. Säkerställa fri stabil rörlighet. Applicera tryck för Mikroskop genom att öppna kväve cylindern och justera tryckregulatorn.
    Obs: Volymen av injektion kan påverkas av trycket, diameter av nålen bländaren, och varaktigheten av injektion. Att bestämma volymen för att injicera, injicera en droppe av mineralolja som placeras på en hemocytometer. Om det behövs, kan det trycket, injektion, och nål diameter justeras för att öka eller minska ljudstyrkan för injektionen. Injicera flera gånger i mineralolja att säkerställa konsekvent volym.

5. Mikroskop av havskatt embryon

  1. Applicera ett tunt lager av vegetabiliska förkortning till en 100 mm ren petriskål.
  2. Använder en smord plast växt etikett, överföra 50 – 100 ägg från befruktning pannan till petriskål och täck dem med Holtfreters lösning (material tabell). Rikta in äggen mot varandra i ett enda lager. Denna anpassning bör hålla äggen på plats under mikroskop.
  3. Placera petriskål med äggen på scenen av Mikroskop och håll den med ena handen. Sänka nålen med den andra handen (figur 3) tills den genomtränger chorion och äggulan i en enda smidig rörelse. Spetsen på nålen bör vara så nära som möjligt till blastodisc före leverans injektion materialet.
    1. Tryck på pedalen för att leverera materialet som injektion in i äggulan. Om blastodisc inte är tydligt, kan då injektion materialet spridas till olika platser i äggulan. För att göra det, nålen sätts till bortre änden av äggulan, sedan trycka in pedalen och dra nålen görs samtidigt för att sprida injektion materialet genom olika områden av äggulan. Upp till 50 Polykarbonatet kan injiceras i äggulan i kanal havskatt embryon, emellertid, mängden gärna/Cas9 protein behöver optimeras för varje gen att uppnå bästa resultat för mutationen klassar och embryo överlevnad32.
  4. Dra tillbaka nålen smidigt så att inte skada ägget. Flytta petriskål att injicera en annan ägg med samma förfarande. Undvika rörelse av petriskål under injektionsprocessen eftersom detta kan skada ägget eller bryta nålen. Ta bort ägg som är spruckna eller skadas på grund av Mikroskop. Injektion kan startas vid 15 – 20 min efter befruktningen och fortsätter så länge embryon är fortfarande i en cell skede (fram till ca 60-90 min efter befruktning).
  5. Placera injicerade embryon tillbaka i Holtfreters lösning med 10 ppm av doxycyklin och kontinuerlig skonsam luftning för 6 – 7 dagar fram till kläckning40. Lösningen dagligen och ta bort döda embryon.

6. mutation upptäckt

  1. Slumpmässigt, samla flera injicerade embryon på 72 h efter befruktning, ta bort äggulan och extrahera genomiskt DNA. Inkludera 3 – 5 icke-injiceras embryon som kontroll.
    Obs: Genomiskt DNA kan extraheras från embryon efter borttagning av äggskal och äggula material med hjälp av proteinas K matsmältningen och etanol nederbörd32.
  2. Förstärka ett DNA-segment som flankerar genomisk målen för gärna av varje gen, där mutationer förväntas uppstå, använder en naturtrogen Taq polymeras32. För TICAM 1, primers 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (framåt) och 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (omvänd) användes för att förstärka en 750 bp medan för RBL, primers 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (framåt) och 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (omvänd) var vana vid att förstärka ett 375 bp segment från RBL-genen.
    1. Använd följande PCR-reaktion: upp till 20 µL PCR-grade vatten; 1 x HiFi Taq enzym reaktion buffert med MgCl2, 0,2 mM dNTP blanda, 0,4 µM för varje framåt och bakåt primer av samma uppsättning, 100-300 ng genomiskt DNA och 1,25 enheter av HiFi Taq enzym blandning. Utföra PCR cykling villkor: inledande denaturering vid 94 ° C i 3 min. 35 cykler av denaturering vid 94 ° C för 30 s, glödgning vid 60 ° C för 55 s för TICAM och 40 s för RBL, förlängning vid 72 ° C i 1 min/kb; och sista förlängning vid 72 ° C i 10 min.
  3. Upptäcka de muterade embryon med en mutation detektionsmetod såsom sekvensering av renat PCR-produkter, besiktningsman upptäckt mutationsanalys, heteroduplex rörlighet assay, förlust av restriktionsenzym erkännande webbplats eller någon annan mutation detektionsmetod som är lämplig för målet. I detta protokoll, upptäcka mutant embryon med surveyor mutationsanalys identifiering för TICAM 1 och förlust av restriktionsenzym SapI skär webbplats samt sekvensering av renat PCR-produkter för RBL-genen.
  4. För att identifiera muterade alleler, klona PCR-produkter och sekvens vektorer från enskilda kolonier. De muterade alleler som presenteras i figur 4 och figur 6 kom från injicerade embryon. PCR-produkter från sex microinjected och 3 kontroll embryon för varje gen var poolade i två separata rör, en för microinjected embryon och den andra för kontroll embryon, snabbt klonades och 86 vektorer för TICAM 1 och 48 vektorer för RBL gen sekvenserade, inklusive 8 ordningsföljd för reaktioner från 3 kontroll icke-injiceras embryon för varje gen.
  5. För att identifiera olika muterade alleler, jämföra sekvenser från mutant embryon till vildtyp sekvensen med alla DNA sekvens justering verktyg såsom BLAST eller T-COFFEE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att demonstrera effektiviteten av protokollet Mikroskop, var gRNAs utformade för att rikta den kanal havskatt toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) och genen rhamnos bindande lektin (RBL) microinjected.

TICAM 1
DNA-sekvensering av vektorer från enskilda kolonier från poolade, klonade PCR-produkter avslöjade de ditsatta mutationer framkallas i TICAM 1-genen. Mutationen var 79% i de 24 personer som analyseras. Exempel på mutationer illustreras i figur 4 och figur 5. Effekterna av ditsatta mutationer i TICAM1 gen kodande sekvens av kanal havskatt på förutspådda protein längd och sekvens jämfört med vildtyp sekvensen illustreras i tabell 1. Strykningen mutationer resulterade i borttagning av ett fåtal till flera aminosyror från proteinet förutspådda, leder till ändra ramen nedströms läsning och tidigt avslutande översättning (tabell 1).

I de flesta fall trunkerades mer än 80% av den förväntade proteinsekvens på grund av en för tidig stop kodon. I dessa fall varierade den förutspådda polypeptid längden 91 106 aminosyra rester (vilda typ TICAM 1 har 520 aminosyra rester). Mutationer med extremt trunkerat protein förväntas producera ett icke-funktionellt protein. När det gäller 87 bp radering mutationen (tabell 2, figur 4) avlägsnades 29 aminosyror från protein utan att ändra ramen läsning. De funktionella konsekvenserna av sådana mutationer behöver utvärderas experimentellt.

RBL
DNA-sekvensering av vektorer från enskilda kolonier från poolade, klonade PCR-produkter bekräftat förekomsten av ditsatta mutationer (figur 6). Mutationen var 88% i de 40 personer som analyseras. Borttagningar varierade från 5 bp till 183 bp, medan upp till 20 bp sattes in. Intressant, bort 183 bp borttagningarna helt intron 1, exon 2 och 19 bp från intron 2. Teoretiskt bör detta påverka den skarvning av RBL genen eftersom splice webbplatser har blivit muterad.

Ditsatta mutationer hade varierande effekter på den förutspådda proteinsekvens jämfört med vildtyp protein sekvensen (308 aminosyra rester) (tabell 2). Mer än 70% av indels resulterade i en förutspådd trunkerat protein som är 10% eller mindre än längden på proteinet vildtyp. I vissa indels (mutation nummer 4, 5 och 6) var den förutspådda polypeptiden mindre än 10 aminosyror. Endast 2 fall (nummer 2 och 3) ledde till borttagning av 2 och 4 aminosyror i proteinet förutspådda utan att ändra ramen läsning som kan eller kan inte påverka funktionen protein.

BI-alleliska mutationer förmåddes med två andra gRNAs (Elaswad et al., opublicerad) där båda kromosomerna var muterad i några embryon och ingen vildtyp alleler upptäcktes. Med gelelektrofores av PCR-produkter hade dessa embryon bara ett band som var kortare än vildtyp bandet (mer än 200 bp radering). DNA-sekvensering av PCR-produkter som klonade bekräftat förekomsten av endast en mutant allel i alla vektorer sekvenserade från ett embryo (homozygot biallelic mutation) medan två muterade alleler inträffade i andra embryon (heterozygot biallelic mutation). I vissa andra embryon som var mosaik för mutationen, upptäcktes både mutant (upp till 4 alleler) och vildtyp alleler av DNA-sekvensering av klonade PCR-produkter.

Figure 1
Figur 1 : En sammanfattning av Mikroskop förfarandena för en cell kanal havskatt (Ictalurus punctatus) embryon med gärna/Cas9 protein att slå ut toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) genen och rhamnos bindning lectin (RBL) genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Testiklar och ägg av kanal havskatt, Ictalurus punctatus . (A) väl utvecklade testiklar kanal havskatt hanar är vita med många underbett prognoser. (B) bra ägg från kanal havskatt honor är Gyllengul färg med minimal eller ingen blodproppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Microneedle dra, lastning och Mikroskop av en cell kanal havskatt, Ictalurus punctatus , embryon. (A) nål dra med en vertikal nål avdragare. Nålen struktur och diameter påverkas av värmen i värmaren glödtråden och magnetventil kraft. (B) Microneedle lastning med CRISPR/Cas9 mix med en microloader spets. (C) arrangemang av kanal havskatt embryon i en 100 mm petriskål innehållande Holtfreters lösning. Microneedle sänks tills det berör och genomborrar ägget. (D) förstorad avsnittet på panelen C visar processen för piercing ägget. Observera att nålspetsen driver koriongonadotropin membranet inåt men har inte trängt in det ännu. Injicerade embryon har röda injektion material inuti. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : CRISPR/Cas9 inducerade mutationer i toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) gen kodande sekvens av kanal havskatt, Ictalurus punctatus . Blå sekvens representerar protospacer angränsande motivet (PAM) medan den gröna sekvensen representerar målet för gärna. Dubbel strand avbrott som induceras av Cas9 protein förväntas uppstå på platsen för de 2 röda trianglarna. Mutationer är tilldelade nummer 1 till 8. Strykningen mutationer representeras av en streckad linje där varje streck motsvarar en nukleotid som har tagits bort. Röd sekvenser är infogningar medan lila representerar substitution mutation. Fraktioner av 78 representerar antalet muterade alleler i 78 sekvensering reaktioner (t.ex., 3/78 innebär att en allel identifierades i 3 sekvensering reaktioner från totalt 78 reaktioner). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Ditsatta mutationer i kanal Havskatten, Ictalurus punctatus , toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) gen kodande sekvens induceras av Mikroskop gärna/Cas9 protein till kanal havskatt en-cell embryon som framkommit vid DNA sekvensering kromatogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : CRISPR/Cas9 inducerade mutationer i rhamnos bindning lectin (RBL) genen av kanal havskatt, Ictalurus punctatus . Exonic sekvenser är versaler medan intronic sekvenser är gemener. Blå sekvens representerar protospacer angränsande motivet (PAM) medan den gröna sekvensen representerar målet för gärna. En dubbel strand avbrott som induceras av Cas9 protein förväntas uppstå på platsen för de 2 röda trianglarna. Mutationer tilldelas siffrorna 1 till 9. Strykningen mutationer representeras av en streckad linje där varje streck motsvarar en nukleotid som har tagits bort. Röd sekvenser är infogningar. Fraktioner av 40 representerar antalet muterade alleler i 40 sekvensering reaktioner t.ex. 2/40 betyder att en allel identifierades i 2 sekvensering reaktioner från totalt 40 reaktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mutation Införande Borttagning Förändring (Δ) Protein längd (aminosyra) Frameshift förändrats För tidig stop kodon Förutspådda proteinsekvens
WT 0 0 0 520 Nej Nej MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTSCSSYSLEISVST
ATTNNSNKESRPLPLKTPPESRDGQNHEAKPSS
PLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQLEKFKF
RQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFLSIPSGG
GKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSFSTEKQ
ASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKSRLESIS
STIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSAYVMLL
LTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHNTVIPL
LPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDTFEKM
AKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREKQQW
LQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQQQ
HLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSPS
PMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNSTM
TVGGGVDSGDEDNF
(GenBank: NP_001187154.1
1 0 5 -5 104 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTFVQLLQPRNQRIHS
HNQ
2 5 40 -35 94 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSIS
GSRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAF
KVQKEPPKRDDSYPSSLRSTSNKSHNQ
3 0 87 -87 491 Nej Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSKTPPESRDGQNHE
AKPSSPLVDHKPFYSVTKSYKSSDPTPLQERAQ
LEKFKFRQYPDKHDTSEIVTPKSPNIESGLEKTFL
SIPSGGGKVGAQPVSTSKPPEASSTQEVGKHDSF
STEKQASQEEEDMFYAFVILHAEEDSEEAVRLKS
RLESISSTIGATFSEDFAVPGQSTFRSVEDAIENSA
YVMLLLTPNFNTHLNETNADSALMNSIEKPHKHN
TVIPLLPRANGLTRNQMPFILRTKNPLVETRDRDT
FEKMAKKVLDLRNIQRQKSMWTEAQLVKKQREK
QQWLQEKKRYCKDFIQESPRVRELEEQIQQLKMQ
QQHLQPPYAQQTNSHQGFPGRPQSSGPMPFRSP
SPMPSYYSGNMWPQLPSNIHIQNAKCIMIGNNST
MTVGGGVDSGDEDNF
4 3 131 -128 95 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRAFKSPG
5 1 0 1 106 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSIFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
6 1 0 1 106 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTFVQLLQPRNQRIH
SHNQ
7 14 0 14 100 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSRSTPPPRAAPTA
8 35 9 26 91 Ja Ja MAEETELVDEKKPTELCVNRNTVVNSPLERSISG
SRSTENISGEHTAAECLIMGASLQPRRESTEAFK
VQKEPPKRDDSYPSSLRSTSTQV

Tabell 1: Effekter av ditsatta mutationer i toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) gen kodande sekvens av kanal havskatt, Ictalurus punctatus, på förutspådde protein längd (aminosyror) och sekvens jämfört med vilda Skriv sekvens (WT).

Mutation Införande Borttagning Förändring (Δ) Protein längd (aminosyra) Frameshift förändrats För tidig stop kodon Förutspådda proteinsekvens
WT 0 0 0 308 Nej Nej MMLFLKLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQR
LTCETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFT
NCALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIE
IINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTL
SIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLT
VSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRT
DSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCE
EQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
(GenBank: AHJ14694.1) 53
1 0 5 -5 29 Ja Ja MMLFLKPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
2 0 6 -6 306 Nej Nej MMLFLSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLT
CETGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTN
CALRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFG
TYKYYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSI
EIINANYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNT
LSIVAAMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYL
TVSYICTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGR
TDSTTCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARC
EEQSSCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
3 0 12 -12 304 Nej Nej MILSLFTLIISAPGLMVSGENMITCYSDVQRLTCE
TGLIKVKSTVYGRTNSITCNTNRPFSEVTFTNCA
LRITTIADRCNGLKECELKTDLLGNPDPCFGTYK
YYNTTYDCINGHRVVICEQGYSTLDCGSDSIEIINA
NYGRGNSRTCSNGILSSQTQNTNCYAPNTLSIVA
AMCKGKKTCTVEASNTIFNDPCVGTVKYLTVSYI
CTREIVTCESSTATLNCGAHRIKIISANYGRTDST
TCSSGRPASQTSNKNCYTPDALNKIAARCEEQS
SCEVPATNVVFSDPCFGTYKYLTIVYSCV
4 0 16 -16 6 Ja Ja MMLFLN
5 0 183 -183 8 Nej Ja MMLFLKRI (förutsatt att skarvning inte ändras)
6 1 183 -182 5 Ja Ja MMLFL (förutsatt att skarvning inte ändras)
7 1 0 1 31 Ja Ja MMLFLKTQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
8 1 0 1 31 Ja Ja MMLFLKSQPLHLNYFSSWLNGFWREYDYLLQ
9 20 0 20 18 Ja Ja MMLFLKASSHISSSASSP

Tabell 2: Effekter av ditsatta mutationer i den rhamnos bindande lektin (RBL) genen av kanal havskatt, Ictalurus punctatus, förutspådde protein längd (aminosyror) och sekvens jämfört med vildtyp sekvensen (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett detaljerat protokoll för Mikroskop kanal havskatt embryon att uppnå gen knockout presenterades. Injektion av CRISPR/Cas9 protein i äggulan är mycket enklare, sparar tid och kräver inte omfattande utbildning jämfört med microinjecting blastodisc av en-cell embryot, som är den gemensamma tekniken för de flesta genöverföring och gen redigering med fisk 30 , 42. det nuvarande protokollet visat sig vara framgångsrika i att förmå indels i kanal havskatt TICAM 1 och RBL gener. Dessa tillförlitliga och effektiva förfaranden lägga grunden för att generera framtida gene knockouts i kanal havskatt. Protokollet kan modifieras för att rikta andra gener i kanal havskatt genomet med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet, eller för att anpassa andra gen teknik havskatt, såsom tol2 medierad genmodifiering. Det är också värt utvärdering i andra havskatt arter såsom den blå Havskatten (I. furcatus), som är kommersiellt viktiga och deras ägg verkar vara mer känsliga för hantering än kanal havskatt ägg. Dock om andra gRNAs eller biologiskt aktiva ämnen såsom DNA eller mRNA skall injiceras, kan protokollet behöva optimeras för att avgöra de bästa förutsättningarna.

Protokoll för Mikroskop fisk embryon, Mikroskop förfaranden kunde delas in i två huvudkategorier: injektion in i embryonala celler och injektion i äggulan. I medaka, skulle morpholinos injiceras i cytoplasman i en cell embryon att studera olika utvecklingsprocesser i vivo41. I kanal havskatt, CRISPR/Cas9 mRNA inriktning GnRH genen var microinjected in blastodisc en-cell embryon30. I tre – däremot Småspigg (Gasterosteus aculeatus), var blastomerer microinjected för att generera transgenics och gen knockouts42. Däremot, var en-cell zebrafiskar embryon äggula-injiceras med morpholinos att manipulera proteinet Heart of Glass (Heg), som visat sig vara effektiva43. Dessa 2 typer av tillvägagångssätt har sina fördelar och nackdelar, men om båda har samma effektivitet för samma art, äggula Mikroskop av en cell embryon skulle vara att föredra av flera skäl.

Äggula Mikroskop är mindre invasiva att embryon, eftersom Mikroskop nålar inte punkteras de embryonala cellerna. Dessutom kan många embryon injiceras i en kort period medan embryona är fortfarande på första cellen scenen. Det finns inget behov av att anpassa embryona i en viss position. Detta skulle också spara tid och minska stress hantering av embryon. I säsongsmässigt lekande fisk, finns det en begränsad lekbeståndets tid där alla förfaranden måste göras för att uppnå framgångsrika knockout. I kanal havskatt, lekperioden varar i ca 2 månader44. Därför kommer att utveckla en snabb och effektiv Mikroskop protokoll tillåta Mikroskop av många embryon att rikta många gener under denna korta tid. Lyckligtvis kan kanal havskatt att artificiellt lekt för att tillhandahålla ett tillräckligt stort antal embryon för Mikroskop att övervinna den höga dödligheten på grund av Mikroskop förfaranden45. Tiden för befruktning kan dessutom kontrolleras för att säkerställa att embryon är i one-cellstadie när det behövs.

Mikroskop för CRISPR/Cas9 inducerad indels i olika fiskarter, inklusive zebrafiskar, atlantlax (Salmo salar L.), Nile tilapia (Oreochromis niloticus), kanal havskatt, Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus) 46och gemensamma karp5,30,46,47,48,49,50. Dessutom användes det CRISPR/Cas9-systemet att störa gener i Labeo rohita karp via homolog rekombination-medierad införandet av främmande DNA i riktade gener51. I detta protokoll förmåddes framgångsrika indels i kodande sekvenser med dramatiska effekter på den förutspådda proteinsekvens, inklusive frameshift mutationer som leder till för tidig stop kodon. Fenotypiska effekterna av dessa mutationer fortfarande behöver utredas. Trunkerade mRNA är mest sannolikt trasiga via nonsens-medierad mRNA decay (NMD) vägen, vilket resulterar i att minska eller hämning av uttryck, och om uttryckt, trunkerade proteiner kommer sannolikt fungerar inte52,53 .

I vårt experiment med genen RBL, två typer av mutationer (nummer 5 och 6) resulterade i radering av 183 bp tar bort hälften av exon 1, intron 1, exon 2 och del av intron 2 helt. Denna typ av mutation kan teoretiskt, förändra den skarvning av RBL pre-mRNA. Mutationer på skarv platser hämma spliceosome förmåga att känna igen den exon54.

Sammanfattningsvis, är utvecklingen av en pålitligt effektiv protokoll för riktade gen redigering i kanal havskatt avgörande för att studera funktionsgenomik, särskilt efter de genomiska resurserna har berikats med den senaste sekvenseringen av kanal havskatt genomet. De förfaranden som beskrivs här är enkla, snabba men effektivt och har visat sig framgångsrikt uppnå gen knockout. Två gener, TICAM 1 och RBL, blev måltavla för att demonstrera effektiviteten av CRISPR/Cas9 knockout med hjälp av Mikroskop. Beroende på vad är som injiceras, kan protokollet ändras för att inkludera andra biologiskt aktiva ämnen. Det kan också ändras så för att microinject andra havskatt arter eller andra fiskarter som har liknande ägg struktur och sammansättning. Detta protokoll lägger grunden för genen knockout i kanal havskatt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Denna forskning har finansierats av USDA-NIFA award 2015-67015-23488 till Roger Cone. Författarna vill tacka Dr Ronald Phelps för beskrivningen av barnaskara lager urvalskriterier i videon. Ahmed Elaswad och Karim Khalil vill tacka den egyptiska kulturella och pedagogiska presidiet i Washington DC för att finansiera sin Ph.D. forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Genetik fråga 131 CRISPR/Cas9 gen redigering gen knockout Mikroskop kanal havskatt embryon mutation trunkerat protein indels
Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, <em>Ictalurus punctatus</em>, embryon för Gene Editing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D.,… More

Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter