Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Abstract

Chemotaxis oder Migration eine Steigung von einem Lockstoffgradient ist die am besten verstanden gerichtete Migration. Studien über soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum ergab, dass ein komplexes Signal Transduction Netzwerk von parallelen Bahnen die Reaktion auf Chemoattractants verstärkt und zu voreingenommen Aktin-Polymerisation und Vorwölbung des Pseudopod in führt der Richtung eines Verlaufs. Im Gegensatz dazu sind die molekulare Mechanismen fahren andere Arten von gerichtete Migration, z. B. durch Einwirkung von Strom oder elektrische Felder, Scheren nicht bekannt. Viele Regulatoren der Chemotaxis Lokalisierung am führenden oder rückständigen Rand einer wandernden Zelle aufweisen, sowie vorübergehende Änderungen in Lokalisierung oder Aktivierung nach globalen Stimulation mit einer Lockstoffgradient zu zeigen. Um zu verstehen, die molekularen Mechanismen der anderen Arten von gerichtete Migration entwickelten wir eine Methode, die Untersuchung der zellulären Reaktion auf akute mechanische Stimulation basierend auf kurze (2 bis 5 s) Exposition, Flow zu scheren ermöglichen. Diese Stimulation kann in einem Kanal geliefert werden, während der Bildgebung Zellen Eindringmittel beschriftet Biosensoren untersuchen einzelne Zelle Verhalten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus kann Zellpopulation angeregt werden, in einen Teller, lysiert, und Immunoblotted mit Antikörpern, die aktive Versionen der interessierenden Proteine erkennen. Durch die Kombination beider Assays, kann man eine Vielzahl von Molekülen, die durch Veränderungen der subzellulären Lokalisierung und/oder Phosphorylierung aktiviert untersuchen. Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass akute mechanische Stimulation Aktivierung der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netze auslöst. Die Möglichkeit zu prüfen, zelluläre Reaktionen auf akute mechanische Stimulation ist wichtig für das Verständnis der auslösenden Ereignisse notwendig für Scherung strömungsinduzierte Motilität. Dieser Ansatz bietet auch eine Tool für das Studium der chemotaktische Signal Transduction Netzwerk ohne verwirrende Einfluss des Lockstoffgradient-Rezeptors.

Introduction

Migration von eukaryotischen Zellen ist durch unterschiedliche chemische und physikalische Hinweise in der Umgebung, einschließlich Steigungen von löslichen oder Substrat gebunden Chemoattractants, variabler Steifigkeit der Substrate, elektrische Felder oder Schubfluss vorgespannt. Zwar gab es viele Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Mechanismen fahren Chemotaxis, weniger ist bekannt über andere Arten von gerichtete Migration und wie diese vielfältigen Signale auf zellulärer Ebene zu einer einheitlichen produzieren integriert sind wandernde Antwort.

Migration in Richtung einer zunehmenden Konzentration von einem Lockstoffgradient umfasst drei Verhaltens Komponenten gerichtet: Motilität, direktionale sensing und Polarität1. Motilität bezieht sich auf zufällige Bewegung der Zellen durch Pseudopod Vorsprung erreicht. Gerichtete Sensorik ist die Fähigkeit einer Zelle, die Ursache für eine Lockstoffgradient zu ermitteln, die auftreten können, auch in Zellen immobilisiert. Polarität bezieht sich auf die stabiler asymmetrische Verteilung der intrazellulären Komponenten zwischen den führenden und rückständigen Rand einer Zelle, führt zu erhöhten Persistenz in Bewegung.

Zelluläre Reaktion auf eine Lockstoffgradient hängt von der Aktivität von vier konzeptionell definierte Regulationsnetzwerke: Rezeptor / G Protein, Signaltransduktion, Aktin-Zytoskelett und Polarität1. Lockstoffgradient Bindung an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor überträgt das Signal über Heterotrimeric G Proteine α und βγ auf die nachgeschalteten Signaltransduktion Netzwerk, das die Richtungs-Signal verstärkt. Mehrere Wege innerhalb des Netzwerks Signal Transduction parallel agieren und fließen in das Aktin Zytoskelett Netzwerk Bias Aktin-Polymerisation und konsequente Pseudopod Vorsprung, in die Richtung des Farbverlaufs. Unter wichtige Regulatoren der Chemotaxis sind Ras GTPase, TorC2, Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K), Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) und Guanylyl Cyclase. Feedback-Mechanismen innerhalb des Signal-Transduktion-Netzwerks und zwischen der Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke weiter verstärken die Reaktion. Schließlich, das schlecht definierte Polarität Netzwerk erhält Eingaben aus dem Aktin-Zytoskelett und weitere Vorurteile Signal Transduction Netzwerk zur Förderung der anhaltenden Migration in die Richtung des Farbverlaufs.

Ein Großteil unserer mechanistisches Verständnis der Chemotaxis wurde aufgrund der Entwicklung von Eindringmittel getaggt Biosensoren für verschiedene Komponenten des regulatorischen Netzwerken ermöglicht. Viele Chemotaxis Regulatoren haben eine asymmetrische Verteilung der regulatorischen Molekül selbst oder seine Tätigkeit. Z. B. Biosensoren, die erkennen aktiviert Versionen von kleinen GTPases Ras und Rap1-Ras-bindende Domänen von Raf1 (bezeichnet als RBD hier) und RalGDS, bzw. – zu lokalisieren, an der Vorderkante der Chemotaxing Zelle2,3. In ähnlicher Weise PI3K und seine Produkt Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphate (PIP3), anerkannt durch eine Pleckstrin Homologie (PH) Domäne zeigen auch Lokalisierung an der Vorderseite der Zelle4,5. Im Gegensatz dazu eine 3-Phosphatase PTEN, wandelt die PIP3 zurück zu Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate, lokalisiert an den rückständigen Rand der Zelle6. Wichtig ist, ändern Sie diese Biosensoren ihrer Lokalisation in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient. Vorderkante Marker, die cytosolische oder relocalize an den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zelle zum Kortex, während Rand Marker, hinkt die kortikalen Lokalisierung und Fehlen von den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zellen werden nach der cytosolischen die Stimulation. Analyse der Biosensor Verteilung in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient minimiert den Beitrag der Motilität und Polarität, die oft die Beobachtungen zu verwirren. Global oder gleichmäßige Stimulation eine Zellsuspension mit einem Lockstoffgradient ist auch als Werkzeug zur bevölkerungsweite Veränderungen in Protein-Aktivierung, oft röntgenologisch Protein Phosphorylierung7,8,9 . Diese biochemischen Assay dient vor allem zeitliche Informationen zu während Mikroskopie verwendet wird, um zeitliche und räumliche Informationen über das Verhalten der verschiedenen Komponenten des regulatorischen Netzwerken zu sammeln.

Das Signal Transduction Netzwerk enthält Merkmale eines erregbar System10,11. Reaktionen auf supra-Schwelle chemotaktische Reize sind "verdeutlichen" und feuerfeste Perioden anzeigen. Antworten sind auch stochastisch ausgelöst und oszillierenden Verhalten zeigen können. Signal-Transduktion Ereignisse sind in Regionen des Cortex lokalisiert, die wie Wellen12,13,14,15zu propagieren. Vorne, zurück, Marker zu rekrutieren oder distanziert, die aktiven Zonen der propagierende Wellen. Aufgrund der feuerfesten Region hinter der aktiven Zone vernichten die entgegengesetzt gerichteten Wellen treffen. Die verbreitende Signal Transduction Wellen unterliegen die zelluläre Vorsprünge, die Zelle Migration10vermitteln.

Viele der genannten Informationen über Chemotaxis kam aus den Studien auf die soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum, obwohl ähnliche Regulationsmechanismen auch auf Neutrophilen und andere Säugetier-Zelle Arten16 anwendbar sind . Dictyostelium ist ein gut etabliertes Modellorganismus, der hat eine robuste chemotaktische Reaktion während der Hungersnot, wenn Tausende von einzelnen Zellen in einer Aggregation Mitte, schließlich bildet eine vielzellige Fruchtkörper mit Sporen migrieren. Chemotaxis ist auch während der einzelligen Wachstumsphase dieses Organismus zur Ortung von bakteriellen Nahrungsmittelquellen wichtig. Wichtig ist, ist die Migration von Einzelzellen Dictyostelium bemerkenswert ähnlich wie die Migration von Säugetieren Neutrophile oder metastatischen Krebszellen, die sehr schnelle amöboiden Typ Migration zu unterziehen. In der Tat sind sowohl die allgemeine Topologie der regulatorischen Netzwerke, sowie viele der einzelnen Transduktion Signalwege beteiligt Chemotaxis zwischen Dictyostelium und Säugetieren Leukozyten17konserviert. Darüber hinaus nutzen andere Zellen, wie Fibroblasten, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) anstelle von GPCRs; jedoch kann RTKs in ähnliche Netze einspeisen.

Im Gegensatz zur Chemotaxis fehlt gründliches Verständnis der Signalisierung Mechanismen, die verschiedenen Verkehrsträger gerichtete Migration zu fahren. In ähnlicher Weise auf Zellen in einem Lockstoffgradient Verlauf migrieren mehrere Studien haben berichtet Aktivierung und/oder Lokalisierung von typischen Vorderkante Markierungen, einschließlich Aktin-Polymerisation, PIP3 und/oder extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) 1/2, bei der Vorderseite der Zellen gerichtet Migration als Reaktion auf Flow oder Änderungen in elektrischen Feldern18,19,20,21zu scheren. Führte jedoch in diesen Studien Dauerbelastung auf den Stimulus auch Zellwanderung, lassen offen die Frage, ob beispielsweise die Vorderkante Marker speziell in Reaktion auf einen Reiz zu lokalisieren, oder wenn sie einfach an der Vorderkante zu lokalisieren aufgrund erhöhten Anzahl von Scheinfüßchen an der Vorderseite des eine wandernde Zelle.

Wir entwickelten Assays, die uns erlauben, die Reaktion der Zellen auf akute mechanische Störung geliefert als Schubfluss sowohl auf Bevölkerungsebene sowie Einzelzellen22zu beobachten. Ähnlich wie bei globalen Stimulation mit einem Lockstoffgradient, akute stimulaTion mit Schubfluss ermöglicht die Studie eine zelluläre Reaktion auf einen mechanischen Reiz ohne verwirrende Beitrag von Motilität oder Polarität. Kombinieren diese mikroskopische und biochemische Tests mit genetischen oder pharmakologische Störungen ermöglicht es uns, erfahren über wie mechanische Reize wahrgenommen werden und übermittelt werden. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz auch eine neuartige Methode zur Erschließung des Systems unterhalb des Lockstoffgradient-Rezeptors in Ermangelung eines Lockstoffgradient, damit das Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke aus dem Rezeptor/G zu isolieren Protein-Netzwerk.

Mit den Techniken, die wir kürzlich beschriebenen demonstrierte, dass akute Scherbeanspruchung führt zu Aktivierung mehrerer Komponenten der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke22. Durch die Anwendung des akute mechanischen Reizes in unterschiedlichen Abständen, haben wir bewiesen, dass in ähnlicher Weise zu Chemoattractants, Reaktion auf mechanische Reize auch bietet eine erregbare Systems, einschließlich das verdeutlichen Verhalten die Reaktion unter Ausstellungen Bedingungen und das Vorhandensein von einer Refraktärzeit zu sättigen. Durch die Kombination von mechanischen und chemischen Stimulation haben wir schließlich gezeigt, dass die beiden Reize teilen Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke, die wahrscheinlich für die Integration von mehreren reizen, Bias Zellwanderung ermöglichen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. bereiten HL-5 Medien mithilfe der folgenden: 10 g/L Traubenzucker, 10 g/L Proteose Pepton, 5 g/L Hefeextrakt, 0,965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 PO-4, und, sofern nicht anders angegeben, 0,03 g/L Streptomycin in entionisiertem Wasser. Autoklaven Medium und bei Raumtemperatur lagern.
    Hinweis: Aufgrund der Unterschiede zwischen Proteose Pepton und Hefe-Extrakt von verschiedenen Anbietern erworben sowie zwischen einzelnen Chargen, pH-Wert des Mediums müssen möglicherweise auf die typische Reichweite von 6,4 bis 6,7 eingestellt werden.
    2. Vorbereitung SM Platten unter Verwendung der folgenden
  2. : 10 g/L Traubenzucker, 10 g/L Pepton, 1 g/L Hefe-Extrakt, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 und 20 g/L Agar in entionisiertem Wasser. Autoklaven, abkühlen und gießen Sie 30 mL der Agar-Lösung pro 10 cm Petrischale. Sobald der Agar erstarrt, speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  3. Vorbereitung 10 x Phosphat-Puffer (PB) mit 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O und 6,8 g/L KH 2 PO 4 in entionisiertem Wasser. Speichern den 10-fach bestand bei 4 ° C. verdünnt, 1 X mit entionisiertem Wasser für den Gebrauch.
  4. Bereiten DB Puffer durch die Ergänzung 1 X PB mit 2 mM MgSO 4 und 0,2 mM CaCl 2.
  5. Vorbereiten 100 mM Koffein in entionisiertem Wasser. Lagerung bei − 20 ° c
  6. Vorbereiten 100 mM Lager Stammlösung durch cAMP Natrium-Salz-Monohydrat in entionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie eine 1 mM Lager in entionisiertem Wasser arbeiten. Speichern sowohl Stammlösungen bei − 20 ° C. Prepare endgültige cAMP Lösung auf die gewünschte Konzentration in DB am Tag des Experiments.
    Bemerkung: Stock Solutions kann einfrieren aufgetaut einigemal.
  7. Vorbereiten 25 mM Folsäure 1 x PB. Fügen Sie einige Tropfen von 1 N NaOH, bis das Pulver vollständig auflöst. Lagerung bei − 20 ° c
  8. 3 X Probenpuffer unter Verwendung der folgenden vorbereiten: 187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 30 % Glycerin, 126 mM Dithiothreitol und 0,03 % (w/V) Bromophenol blue. Aliquoten und Shop unter − 20 ° c
    1. Vor zu verwenden, in einem 37 ° C Wasserbad Auftauen und fahren mit Probenpuffer mit Protease und Phosphatase-Hemmer durch Verdünnen 3 x Probenpuffer auf 1 X, und Hinzufügen von 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM Natrium Pyrophosphat und 1 X vorbereiten komplette EDTA-freie Protease-Inhibitor cocktail in entionisiertem Wasser. Hinzufügen die Inhibitoren sofort vor dem Start der Prozedur beschriebenen Schritte 3.1.2-3.1.3.
  9. 5 mM Latrunculin A Lösung in DMSO vorzubereiten. Aliquoten und Shop unter − 20 ° c

2. Vorbereitung von D. Discoideum Zellen

Hinweis: Erhaltung D. Discoideum Zellen in HL-5 Medien entweder in Gewebekultur Teller oder in einer Suspension Kultur wie oben beschrieben 23. Im Bedarfsfall Zellen Transformation mit Gewebekulturen beschriftet Biosensoren entsprechend standard Elektroporation Protokolle 24. Verschiedene Stämme von D. Discoideum sowie Plasmide Codierung Biosensoren oder andere Gene von Interesse erhalten Sie von der Dicty Stock Center (dictybase.org).

  1. Wachstum und Auflistung der vegetativen D. Discoideum Zellen
    1. für die Analyse der vegetativen Zellen wachsen Zellen in Anwesenheit von Bakterien zu reduzieren Sie die Anzahl der Macropinosomes, die in der Regel in zu beobachten sind axenically gewachsen Zellen 25.
      1. Bereiten Sie eine Kultur der Klebsiella Aerogenes von einer kleinen Anzahl von Zellen aus einem Glycerin-bestand oder aus einer früheren Kultur in das gewünschte Volumen der HL-5 Medium ohne Antibiotika zu impfen. Inkubieren Bakterienkultur auf einem Orbitalschüttler bei 200 u/min (0,42 x g) bei Zimmertemperatur (20-22 ° C) für 16-18 h
        Hinweis: Die K. hier verwendete Aerogenes-Stamm ist nicht-pathogenen (siehe die Tabelle of Materials).
    2. D. Discoideum in der exponentiellen Wachstumsphase zu sammeln, Gewebekultur Platten oder aus einer Suspensionskultur, und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer laut Hersteller ' Anweisungen. 1 x 10 5 D. Discoideum Zellen mit 260 µL K. Aerogenes Federung auf einer SM-Platte zu verbreiten. Drehen Sie die Platte auf dem Kopf nach unten am nächsten Tag. Zellen bei Raumtemperatur zu wachsen, bis die D. Discoideum Zellen beginnen Löschen des bakteriellen Rasens aber bevor sie aggregieren anfangen (~ 36-48 h).
    3. Sammeln D. Discoideum Zellen in 5 mL DB Puffer durch Kratzen sie mit einem Glas-Spreader. Übertragen Sie Zellen auf einem 50 mL-Polypropylen-Rohr. Spülen Sie die Platte mit einem anderen 5 mL DB-Puffer und Pool mit der originalen Federung. Füllen Sie das Rohr bis 50 mL mit DB Puffer.
    4. Zentrifuge D. Discoideum Aussetzung bei 360 X g für ca. 3-4 min. Überstands Aspirieren und Aufschwemmen das Pellet in 50 mL DB-Puffer. Wiederholen Sie Waschschritten bis der Überstand ist klar (~ 3-4 Wäschen). Die letzte Zelle Pellet in DB-Puffer zu einer endgültigen Dichte von ~ 5 x 10 6 Zellen/mL Aufschwemmen.
  2. Vorbereitung der Aggregation-zuständigen D. Discoideum Zellen
    1. Entwicklung D. Discoideum Zellen durch 1 h verhungern, gefolgt von 4 h an Hunger und mit 50 nM cAMP pulsieren alle 6 min nach Norm Protokolle 23.
    2. Nach Entwicklung, Messen der letzte Band der Zellsuspension.
    3. Bezogen auf die ursprüngliche Anzahl der für die Entwicklung verwendeten Zellen berechnen Zelldichte der endgültigen Aufhebung.
      Hinweis: Wenn alle 6 min. cAMP in 100 µL Bänden geliefert wird, erhöht Zellvolumen von 1 mL für jede Stunde des Lagers pulsieren. Also für die Standardkonditionen mit 8 x 10 7 Zellen in 4 mL DB, nach 4 h der Entwicklung ist das Endvolumen 7 mL und die endgültige Zelldichte ~1.1 X 10 7 Zellen/mL.

3. Biochemische Analyse der Zelle als Reaktion auf mechanische oder chemische Stimulation

    1. Platte 2 x 10 6 Aggregation-kompetente Akute mechanische Stimulation der Zellen gefolgt von Zelle Lysis Zellen (aus Schritt 2.2) nach 4 h Entwicklung im 35-mm-Schalen mit 2 mL DB. Lassen Sie die Zellen, die für 10 min bei Raumtemperatur zu befestigen. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL DB. Zellen in DB mit 2,5 mM Koffein für 30 min ohne Störung der Platten inkubieren.
      Hinweis: Wenn Zellen mit einem pharmakologischen Inhibitor behandelt werden müssen, fügen gewünschte Konzentration des Inhibitors oder die gleiche Menge an geeigneten Fahrzeug während Basalation mit Koffein.
    2. Anzuwendende mechanische Stimulation, die Platte (einzeln nacheinander) auf einem Orbitalschüttler und schalten Sie ihn sofort mit 150 u/min (0,24 x g) für 5 s.
      Hinweis: Die Platte kann auch manuell stimuliert werden durch Bewegung in gewissem Sinne kreuzweise für ca. 5 s.
    3. Absaugen der Puffer zu den o.g. Zeiten nach dem Beginn der Stimulation. Sofort lösen die Zellen durch Zugabe von 100 µL Probenpuffer mit Phosphatase, Protease-Inhibitoren.
    4. Die Platte auf Eis, und sammeln Sie die lysate in eine 1,5-mL-Tube. Für ' Zeit 0 ', lösen die Zellen ohne schütteln. Übertragen Sie die Röhren auf einem Heizblock 95 ° C für 10 min unmittelbar nach Lyse. Fahren Sie mit Immunoblotting oder speichern Lysates bei-20 ° c
  2. Stimulation von Zellen mit einem Lockstoffgradient
    1. Basalate-Aggregation-kompetente Zellen nach 4 h der Entwicklung durch Schütteln sie schnell in Anwesenheit von 5 mM Koffein bei 200 u/min (0,42 x g) auf einem Orbitalschüttler für 30 Minuten.
      1. Zentrifuge die Zellsuspension bei 360 X g für ca. 3-4 min. Überstands Aspirieren und Aufschwemmen das Pellet in 10 mL eiskaltes DB-Puffer. Wiederholen Sie den Waschschritt.
    2. Aufschwemmen der letzten Zelle Pellet im eiskalten DB-Puffer zu einer endgültigen Dichte von 4 x 10 7 Zellen/mL bezogen auf die erste Zelle Anzahl verwendet, um die Zellen zu entwickeln (siehe Punkt 2.2). Halten Sie die Zellsuspension auf dem Eis vor stimulAtion.
      1. Pipette 50 µL 10 µM cAMP oder Fahrzeug in eine Polystyrol Tasse platziert auf einem Orbitalschüttler.
    3. Um die Zellen zu stimulieren, 450 µL der eiskalte Zellsuspension in die gleiche Tasse hinzufügen und sofort den Shaker schalten bei 200 u/min (0,42 x g). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Stimulation (z. B. 10, 30, 45, 60, 120 s), kurz den Shaker zu stoppen, nehmen Sie 50 µL-Aliquots der Zellsuspension, und lösen Sie die Zellen, indem sie 1,5 mL Röhrchen mit 25 µL 3 X Probenpuffer hinzugefügt.
      1. Für ' Zeit 0 ', verwenden Sie die Zellen aus der unstimulierte eiskalte Zellsuspension.
        Hinweis: Die Endtemperatur der Zellsuspension während der Stimulation ist ~ 9 ° C 26. Unter diesen Bedingungen tritt die Spitze Antwort etwas später als der Höhepunkt für die Stimulation durchgeführt bei Raumtemperatur (z. B. Lockstoffgradient Stimulation der adhärenten Zellen am Mikroskop oder mechanische Stimulation des adhärenten Zellen) beobachtet.
    4. Die Rohre auf einem Heizblock 95 ° C für 10 min sofort nach Lyse übertragen. Fahren Sie mit Immunoblotting oder speichern Lysates bei-20 ° c
  3. Analyse des Zell-Antwort durch Immunoblotting
    1. Lysaten (von Schritten 3.1.3 oder 3.2.4) auf ein 4-15 %-Tris-HCl-Polyacrylamid-Gel laufen, übertragen auf ein Polyvinylidene Fluorid Membran, Block und Immunoblot mit Phospho-PKC Ζ Thr410 (zur Erkennung von Phospho-PKBR1 und Phospho-PKBA). Erkennen das Signal durch Inkubation mit Meerrettich Peroxidase konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper, gefolgt von Chemolumineszenz mit verstärkte Chemilumineszenz Substrat.
    2. Für die Erkennung von mehreren Proteinen Streifen den Blot mit stripping Buffer und Sonde erneut mit einem primären Antikörper gegen Phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (, Phospho-ERK2 zu erkennen). Bestätigen Sie gleich Protein durch Färbung der Polyvinylidene Fluorid Membran mit Coomassie Brilliant Blue laden.

4. Akute mechanische Stimulation und Live-Imaging von Einzelzellen am Mikroskop

  1. Bewertung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit einem Flow-Gerät
    1. sammeln und verdünnen vegetativen oder Aggregation-kompetente Zellen bis ~ 1 x 10 6 Zellen/mL in DB wie in 2.1 und 2.2, bzw. beschrieben. ~ 600 µL in die Folie mit einem Kanal zu laden (siehe Tabelle Material für Details). Können Sie Zellen zu legen für 10 min. stellen sicher, dass alle Buchten auf der Folie vollständig gefüllt sind. Zusätzlichen Puffer bei Bedarf nachfüllen.
      Hinweis: Die Folie für die Analyse verwendet verfügt über drei Eingänge, die in engen, 1 mm Kanäle zu ernähren, aber dann verschmelzen zu einem breiten, 3 mm Kanal. Die Höhe des Kanals beträgt 0,4 mm. Obwohl die Zellen in den Kanal überzogen sind, wird nur der Breite Teil abgebildet.
    2. Pass eine der Linien, die eine 50-mL-Reservoir durch die vorderen rechten Ventil des Referats fluidische zugeordnet ist (siehe die Tabelle der Materialien für Details). Mit der Software für die Pumpe, achten Sie darauf, das Ventil ist geschlossen (d.h. auf der linken Seite). Füllen Sie den Tank mit der DB.
      1. Druck bei 50 Mbar einstellen und einschalten. Füllen Sie und spülen Sie die Zeile mit der DB durch Klicken auf das Ventil zu öffnen. Drehen Sie den Druck wieder auf 0, und schließen Sie das Ventil nach ~ 30 s.
    3. Schließen Sie die Leitung eines der drei Buchten auf der einen Seite der Folie ohne Luftblasen abfangen. Stecken Sie die zwei Buchten. Die Linie aus dem Abfluss zu verbinden, mit dem einzigen Einlass auf der zweiten Seite der Folie.
      Hinweis: Die Schläuche für die Eingabe und Abfluss Linien in diesem Setup verwendet hat einen Innendurchmesser von 1,6 mm.
    4. Legen Sie die Folie auf dem Mikroskop unter einem 20 X Luft Ziel. Um den Kanal zu spülen, wechseln Sie das Ventil, um die Linie zu öffnen, und klicken Sie auf " Druck ON ", beginnend bei höheren Druck (~ 50 Mbar oder ~ 40 dyn/cm 2), die Flüssigkeit zum Abfluss durchzusetzen.
      1. Sobald die Flüssigkeit aus dem Abfluss kommt, Druck von außen auf Null reduzieren (i.e. Schwerkraft fließen nur ~ 15 dyn/cm 2), und weiter Spülen für ~ 30 S. Switch das Ventil in die gegenüberliegende Position zu unterbrechen.
    5. Bilder mit RFP oder GFP-Beleuchtung auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop unter einen 40 X Öl Ziel 3 s Abständen zu erwerben. Mit dem Ventil in der geschlossenen Position, schalten Sie den Druck auf den gewünschten Druck, in der Regel zwischen 15 und 40 dyn/cm 2 (0 - 50 Mbar).
    6. Nach der Übernahme von 5 Bildern, liefern die Impulse durch Umschalten des Ventils der " öffnen " Position. Schalten Sie den Fluss aus nach 2-5 s durch Umschalten des Ventils in die entgegengesetzte Richtung.
      Hinweis: Für bestimmte schwächere Biosensoren (z.B. PTEN, CynA und RalGDS) es möglicherweise notwendig, mit einem konfokalen Mikroskop verfügt über einen 40 X Öl Ziel Bildzellen.
  2. Testing Effekte von pharmakologischen Inhibitoren auf Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit einem Flow-Gerät
    1. Zellen in der Folie mit einem Channel Plate, wie unter Punkt 4.1.1 beschrieben. Richten Sie zwei Linien: eine Linie durch die vordere richtige Ventil wie in Schritt 4.1.2, übergeben und die zweite durch die Hintertür verlassen Ventil. Klemmen Sie die linke Linie und das Ventil in den " geschlossenen " (links). Füllen Sie eine Zeile mit DB, enthält das passende Fahrzeug und die zweite mit der Lösung mit einer pharmakologischen Inhibitor von Interesse (z.B. 5 µM Latrunculin A).
      Hinweis: Es ist notwendig, physisch die linke Linie weil Klemmen der " geschlossenen " linke Position öffnet das Ventil für diese Zeile.
    2. Füllen und Spülen der rechten Linie durch Einschalten des Drucks bei 50 Mbar und das Ventil zu wechseln die " öffnen " (rechts). Wechseln Sie dem Ventil auf der linken Seite nach ~ 30 füllen s. und spülen Sie die linke Linie durch das Entfernen der Klammer für ~ 30 S. verbinden beide Linien auf zwei Buchten auf der einen Seite der Folie mit einem Kanal, stecken Sie den verbleibenden Einlass und verbinden Sie den Abfluss mit dem einzigen Einlass auf der zweiten Seite. < / l ich >
    3. waschen Sie die Folie mit dem Puffer in die richtige Linie und Stimulation in den gleichen Puffer führen, wie in den Schritten 4.1.3 und 4.1.4 oben beschrieben.
      Hinweis: Obwohl die richtige Linie wie die erste in diesem Setup gewählt wurde, die Reihenfolge kann umgekehrt werden.
    4. Nach Stimulation, wechseln Sie das Ventil um die richtige Linie bei Null Druck (d.h. Schwerkraft fließen nur, ~ 15 dyn/cm 2) zu öffnen. Die linke Linie entfernen Sie die Klemme und wechseln Sie das Ventil nach links, um diese Zeile zu öffnen. Klemmen Sie die erste Zeile.
    5. Nach 3-5 mL des Puffers mit Inhibitor durch laufen, wechseln Sie das Ventil nach rechts, um den Fluss zu stoppen und inkubieren Sie die Zellen mit dem Inhibitor für die erforderliche Länge der Zeit (z.B. 15 Minuten). Schalten Sie den Fluss durch Umschalten des Ventils jeden ~ 10 min für ca. 15 s, Sauerstoffmangel zu verhindern. Wiederholen Sie die Stimulation mit der zweiten Zeile.
  3. Alternative Methode zur Bewertung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit einer Mikropipette
    1. die Mikropipette gefüllt mit DB nach Standardprotokoll 23 eingerichtet. Halten Sie den Ausgleich Druck bei 1.500 Psi.
    2. Sammeln und vegetative Zellen zu verdünnen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben. Platz 25 µL Tropfen ~7.5 X 10 5 Zellen/mL in einer 1-Well-Kammer ermöglichen zu halten für mindestens 10 min, und bedecken Sie mit 3 mL DB.
    3. Legen die Kammer auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit einem 40 X Öl Objektiv ausgestattet. Suchen Sie die Zellen. Die Mikropipette vorsichtig in die Mitte des Sichtfeldes zu senken, bis es zuerst den Boden der Kammer berührt.
      Hinweis: Da der Entschädigung Druck bei 1.500 Psi eingestellt wurde, die Zellen kontinuierlich ausgesetzt werden, eine sehr langsame Strömung der DB aus der Mikropipette.
    4. Beginnen, Importieren von Bildern mit RFP oder GLP-Beleuchtung in 3 s Intervallen. Gelten die ' sauber ' Funktion um einen Bolus von Flüssigkeit aus der Mikropipette freizugeben. Weiter ich imagingdas Vorhandensein der Strömung wegen Entschädigung Druck allein n.
  4. Eine alternative Methode zur Bewertung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation mit loser Schüttung Puffer Zusatz
    1. sammeln und vegetative Zellen zu verdünnen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben. Platz 20 µL sinkt der Zellen bei ~ 1 x 10 6 Zellen/mL in DB in der Mitte ein Brunnen aus einer 8-Well-Kammer. Können Zellen für mindestens 10 min. halten
    2. Beginnen, Importieren von Bildern mit RFP oder GLP-spezifische Beleuchtung auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop Intervallen von 3 s mit einem 40 X Objektiv ausgestattet. Konzentrieren Sie sich auf einer Fläche nah an den Rand des Tropfens.
    3. Schnell hinzufügen 430 µL der DB auf der einen Seite des Brunnens. Bildgebung weiter.
    4. Zur Analyse der Interaktion zwischen mechanische und chemische Reize, 12 oder 45 s nach mechanische Stimulation, sanft hinzufügen 50 µL der Folsäure (Endkonzentration 20 nM) oder Fahrzeug (DB) ohne induzieren eine mechanische Antwort. Bildgebung weiter.
  5. Quantifizierung der Antwort
    1. Öffnen Sie die 32-Bit-TIFF-Bild in der Bildanalyse-Software (Details siehe Tabelle der Materialien) 27.
    2. Unter der ' Analyse ' Registerkarte, gehen Sie zu " Set Messungen ". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ' Mittelwert grau '. Stellen Sie sicher, dass die anderen Kontrollkästchen nicht aktiviert sind. Klicken Sie auf " OK ".
    3. Unter den ' Prozess ' Registerkarte, klicken Sie auf " subtrahieren Hintergrund ". Halten des rollenden Kugel Radius auf 50 Pixel, und tun nicht Prüfung aller Optionen im Menü aufgelistet. Vergrößern Sie eine Zelle mit dem ' Lupe ' Tool.
    4. Mit der ' Rechteck ' Werkzeug, zeichnen Sie ein Rechteck (~2.5 x 2,5 µm 2) in das Zytosol, sicherstellen, dass Sie nicht über den Kern oder die Plasmamembran zu zeichnen. Presse " Strg " + " M " Tasten oder gehen Sie auf die ' Analyze ' Registerkarte, und klicken Sie auf " Maßnahme " mittleren Grauwert des Feldes zu bestimmen. Voraus zu nachfolgenden Frames und Messen Sie erneut, sicherstellen, dass die Box bleibt in der Zellflüssigkeit.
      Hinweis: Da D. Discoideum Zellen sehr rasch Feld kann verschoben werden von einem Frame zum nächsten zu halten in der Zellflüssigkeit.
    5. Schließlich der Frames analysiert wurden, kopieren Sie die Werte in einer Tabelle. Um Zell-Zell-Variation in den Ausdruck der verschiedenen Biosensoren berücksichtigen, normalisieren Sie sich die Werte für die mittlere Grauwert beobachtet zum Zeitpunkt 0. Berechnen den Kehrwert der Werte auf die Anhäufung des Signals auf den Kortex widerspiegeln.

5. Kontinuierliche mechanische Stimulation und Live-Imaging von Einzelzellen am Mikroskop

  1. eingerichtet, die Zellen genau wie oben beschrieben für akute mechanische Stimulation Analyse in Schritten 4.1.1 - 4.1.3. Öffnen Sie den Stecker für das Reservoir mit dem Puffer, so das Volumen aufgestockt werden kann, wenn Antwort länger als ein paar Minuten zu einem Zeitpunkt analysiert wird.
    Hinweis: Da das Reservoir für die Dauer des Experiments geöffnet bleibt, dieser Assay wird ohne Druck von außen durchgeführt und stützt sich auf Schwerkraft fließen allein. Um die Rate von Strömung durch die Schwerkraft zu erhöhen, kann der Bach auf einem Tisch unter dem Mikroskop platziert werden.
  2. Beginnen imaging Zellen mit RFP oder GLP-spezifische Beleuchtung auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop in 3 s-Intervallen für die Analyse der Biosensor Antworten mit einem 40 X Objektiv ausgestattet. Alternativ mit Phasenkontrast mit einem 20 X Objektiv in Intervallen von 10 s für die Analyse von insgesamt Zellwanderung Bild.
  3. Schalten Sie den Fluss nach mehreren Frames bei der Null-Druck-Einstellung (d.h. Flow ist aufgrund der Schwerkraft allein oder ~ 15 dyn/cm 2) durch den Wechsel des Ventils in die offene Position. Fällt das Niveau der Flüssigkeit auf ca. 5-10 mL im Tank, mit mehr Puffer auffüllen. Achten Sie darauf, die Flüssigkeit vorsichtig hinzufügen, damit Luftblasen in den Zeilen nicht verfangen.
    Hinweis: Es ist wichtig, fügen Sie Flüssigkeit die gleiche Temperatur um einen Hitzeschock-Antwort in den Zellen zu vermeiden.
  4. Zelle Geschwindigkeit und Ausdauer mit Migrations-Analyse-Software zu quantifizieren (siehe die Tabelle der Materialien für Details) laut Hersteller ' Anweisungen s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zeitliche Reaktion der Chemotaxis Regulierungsbehörden auf akute mechanische stimulation

Um die Reaktion von D. Discoideum Zellen auf mechanische Stimulation zu beurteilen, wurden anhaftende Aggregation-kompetente Zellen einen kurzen Impuls von Schubfluss ausgesetzt. Zusammenfassung-kompetente D. Discoideum Zellen absondern, Lager, das von benachbarten Zellen zu spüren. Um den Beitrag der Zell-Zell-Signalisierung zu überwinden, wurden Zellen mit Koffein, behandelt die Adenylyl-Cyclase in D. Discoideum hemmt und verhindert so das cAMP Sekretion28. In der Tat Zellen vorbehandelt mit Koffein hatte sehr niedrigen basalen Aktivität der PKBR1 und ERK2 und zeigte einen robusten Anstieg der Phosphorylierung der wichtigsten Rückstände dieser Kinasen nach 5 s Stimulation mit Schubfluss (Abbildung 1A). Die Reaktion war vergänglich und Spitzen um 10-15 s für PKBR1 und rund 30 s für ERK2, ähnlich wie zuvor veröffentlichten Ergebnisse für die Aktivierung dieser Proteine mit einem Lockstoffgradient-7.

Obwohl es schwer ist zu beurteilen die Effizienz der Reaktion angesichts der niedrigen basalen, Vorstudien, die zur Entwicklung des Assays, führte im Vergleich Stimulation mit Schubfluss allein (oder mit einem Fahrzeug) zu scheren fließen in Anwesenheit von einem Lockstoffgradient Lager (Abb. 1 b). Diese Analyse zeigen keinen Anstieg in der Antwort am Lager, was darauf hindeutet, dass die Antwort von Signal Transduction Netzwerk Fluss Scherung gesättigt ist. Obwohl in diesem Assay cAMP nicht Phosphorylierung des PKBR1 zu erhöhen, kann der Zellen als Reaktion auf Lockstoffgradient beobachtet werden, mit einem standard Stimulation Protokoll wo sind Aggregation-kompetente Zellen in Suspension gehalten mit cAMP stimuliert und lysiert an verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation. Wie in Abbildung 1gezeigt, ist unter diesen Bedingungen ein vorübergehender Anstieg der PKBR1 Phosphorylierung Reaktion auf Lockstoffgradient, aber nicht Fahrzeug. Die Peak-Reaktion wird beobachtet, um 30 s in diesem Assay weil die Temperatur während des Tests die Zellsuspension ~ 9 ° C, im Vergleich zu mechanischen Stimulation Assay beschriebenen26~ 22 ° C.

Räumlich-zeitliche Reaktion des leading und lagging Rand Markierungen auf akute mechanische stimulation

Da die Bevölkerung Assay oben nur zeitliche Informationen über das Verhalten der Chemotaxis Regulierungsbehörden vorsieht, wurden Zellen auch auf einen kurzen mechanischen Reiz ausgesetzt, während mit einem Mikroskop beobachtet werden. Dieser Test kann durchgeführt werden, entweder mit Aggregation-kompetente oder vegetativen D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck verschiedener Eindringmittel beschriftet Biosensoren deren Lokalisierung in Zellen stimuliert mit einer Lockstoffgradient definiert wurde. Zwei führende Marker, PH-Domäne von Crac und KalkΔcoil, die von PIP3 oder neu polymerisiert Aktin rekrutiert werden, zeigte beide meist cytosolischen Lokalisierung in ruhende Zellen als bereits berichtet (Abbildung 2A, ergänzende Movie 1 )4,29. In Zellen, die basal aktiv waren, konnten diese Biosensoren auch an den Spitzen der die Scheinfüßchen gesehen werden. Anschluss an Stimulation mit Schubfluss für 2 s, der Biosensoren schnell deren zum Kortex mit einem Maximum bei ca. 6 bis 10 s, und kehrte nach dem Zytosol von ~ 30 s. Im Gegensatz dazu lokalisiert rückständigen Rand Marker PTEN an der Rinde vor Stimulation (Abbildung 2A). Nach einem kurzen Impuls mit Schubfluss cytosolischen PTEN Intensität erhöht, wenn auch mit langsameren Dynamik als für die Vorderkante Biosensoren. Eine Änderung der Biosensor Lokalisierung aus dem Zytosol der Kortex und umgekehrt, eine Änderung in der cytosolischen Intensität ermöglicht einfachen Quantifizierung der Antwort gilt als.

Das beobachtete Verhalten von Biosensoren in Reaktion auf akute mechanische Stimulation steht im Einklang mit leading und lagging Kante Lokalisierung Dynamik in Reaktion auf die Stimulation mit einheitlichen Lockstoffgradient. Dieses Verhalten war nicht nur für die drei Biosensoren gezeigt. Wie zuvor veröffentlichte, ähnliche Veränderungen bei der Lokalisierung auch für Vorderkante Marker RBD und RalGDS beobachtet wurden, aktiviert erkennen Ras und Rap1, beziehungsweise, sowie für einen weiteren rückständigen Rand Marker CynA22,30.

Ein ähnlicher Assay kann zur Beurteilung der Auswirkungen von verschiedenen Inhibitoren durch eine einfache Änderung des experimentellen Aufbaus aus einem einzigen Eingabezeile doppelt. Mit dieser Methode, können die Zellen zunächst Kontrolle Bedingungen ausgesetzt, und wechselte dann in den Puffer, der den gewünschten Test-Agents enthält. Z. B. Zugabe von Aktin-depolymerizing Droge LatA blockiert die Reaktion der RBD, sowie KalkΔcoil, akute mechanische Stimulation (Abb. 2 b).

Globale Antwort vorausgeht Zellwanderung unter längerer Stimulation mit Schubfluss

Der hier beschriebene Ansatz könnte auch Auswirkungen der Scherströmung auf D. Discoideum Migration studieren angepasst. In der Tat, wenn die Strömung nicht nach 2 abgeschaltet war s aber blieb für die Dauer des Experiments, vegetative Zellen zeigte Migration gegen die Strömung (Abbildung 3zusätzliche Movie 2) gerichtet. Anzumerken ist, dass der Schubfluss notwendig, eine wandernde Reaktion auslösen niedriger als der Druck, die in der Regel verwendet wurde war, um eine globale Antwort mit akuten Stimulation in den vegetativen Zellen zu erreichen (z. B. wie in Abbildung 2 b). Jedoch auch bei den niedrigeren Druck angezeigt Zellen eine starke einheitliche Reaktion an einer Veränderung in KalkΔcoil Lokalisierung, die vor eine Änderung in der Position der Zelle selbst. Diese Experimente zeigten somit deutlich, dass (1) die globale Reaktion nicht von der Bewegung der Zelle hängt, und (2) die globale Antwort gerichtete Migration vorausgeht.

Alternative Ansätze des Testens Reaktion auf akute mechanische stimulation

Obwohl die Verwendung von einem Durchströmungsraum deutliche Vorteile für die Untersuchung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation hat, validiert wir auch zwei zusätzliche Tests zum Testen der Reaktion einzelner Zellen auf akute mechanische Stimulation. Wie in Abbildung 4dargestellt, KalkΔcoil schnell und vorübergehend wieder lokalisiert von der Zellflüssigkeit zum Kortex wenn Zellen durch Bolus Zugabe des Puffers geliefert entweder mit einer Mikropipette (Abbildung 4A) oder manuell mit Masse angeregt wurden Puffer zusätzlich mit einer Pipette (Abbildung 4 b). Es sei darauf hingewiesen, dass ein klarer Nachteil beider dieser Tests ist, dass der genaue Betrag der Querkraft an der Zelle geliefert unbekannt ist und kann nicht leicht variiert werden. Allerdings bietet Masse Puffer Ergänzung für Situationen wo Umschalten zwischen mechanische und chemische Reize gewünscht wird, eine solide Alternative auf die Stimulation in den Flow-Gerät.

Figure 1

Abbildung 1: Vertreter ergibt sich auf akute mechanische oder chemische Stimulation für biochemische Bewertung der Antwort von D. Discoideum Zellen. Aggregation-kompetente Zellen wurden auf mechanische oder chemische Reize ausgesetzt., zu den angegebenen Zeitpunkten lysiert und Immunoblotted mit Antikörpern, die erkennen phosphoryliert, PKBR1 oder ERK2. (A) anhaftende Zellen wurden angeregt, auf einem Orbitalschüttler für 5 s. Die Membran war voller Flecken mit Coomassie Brilliant Blue (CBB), gleiche Protein laden zu zeigen. (B) anhaftende Zellen wurden angeregt durch manuelle Bewegung der Platte in gewissem Sinne kreuzweise für ca. 5 s folgenden chemischen Stimulation durch Zugabe von 1 µM cAMP oder Puffer (Fahrzeug) oder ohne chemische Stimulation (-). Die zwei Immunoblots zeigen das Ausmaß der Variation in der basalen Aktivierung der PKBR1 zum Zeitpunkt 0 gesehen. PKBA Aktivierung konnte gelegentlich auch durch diese Technik nachgewiesen werden, wie im unteren Fensterbereich dargestellt. (C) Suspendierung Zellen wurden mit 1 µM cAMP oder Puffer (Fahrzeug) angeregt. Teil (A) Diese Abbildung wurde von Artemenko Et al.modifiziert. (2016) 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vertreter ergibt sich für akute mechanische Stimulation und live Imaging einzelner Zellen am Mikroskop. (A) Aggregation-zuständigen D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck ihrer RFP-Tags KalkΔcoil, oder PH-Crac GFP-Tags oder PTEN wurden angeregt mit unidirektionalen Laminar-Flow bei 15 dyn/cm2 für 2 bis 5 S. Bilder waren alle 3 gesammelt s . Repräsentative Zellen zeigen Translokation der Biosensoren in Reaktion auf mechanische Stimulation werden angezeigt. Ansammlung von jeder Biosensor an der Rinde wurde als die Umkehrung der mittlere zytoplasmatischen Intensität mal 0 normalisiert quantifiziert. Die durchschnittliche Antwort von 18 (Kalk-Δcoil), 20 (PH-Crac) oder 6 (PTEN) Zellen wird angezeigt. Werte sind ± se. (B) vegetativen Zellen mit dem Ausdruck RFP-Tags KalkΔcoilbedeuten - RFP und GFP-Tags RBD wurden behandelt mit Fahrzeug oder 5 µM LatA mindestens 15 min lang und dann stimuliert mit unidirektionalen Laminar-Flow bei 41 dyn/cm2 für 2 s. Bilder gesammelt wurden alle 3 s. RBD-GFP und KalkΔcoil- RFP Ansammlung an der Rinde wurde wie in (A) quantifiziert. Werte sind Mittelwert ± SE. Die Anzahl der Zellen analysiert ist neben jede Bedingung angegeben. Maßstabsleiste = 10 µm. Diese Zahl wurde von Artemenko Et Al. modifiziert (2016) 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Vertreter ergibt sich für die Antwort von D. Discoideum Zellen auf längere Stimulation mit Strom. (A) vegetativen Zellen mit dem Ausdruck RFP-Tags KalkΔcoil wurden kontinuierliche unidirektional Laminar-Flow bei 15 dyn/cm2 ausgesetzt und alle 3 S. Titel 11 Zellen abgebildet werden (B) gezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. Diese Zahl wurde von Artemenko Et Al. modifiziert (2016) 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vertreter ergibt sich für alternative Ansätze zur Reaktion auf akute mechanische Stimulation testen. (A) Vegetative D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck ihrer RFP-Tags KalkΔcoil einer Mikropipette (*) basaler Freigabe Testpuffer mit einer langsamen Rate ausgesetzt waren. Ein kurzer Anstieg der Durchfluss wurde durch schnelle Lieferung eines Bolus Testpuffer zum Zeitpunkt 0 erreicht. Bilder wurden gesammelt, jeder 3 s. (B) Vegetative D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck RFP-Tags KalkΔcoil vernickelt als einen kleinen Tropfen in einer Mikroskopie-Kammer wurden mechanisch stimuliert durch Zugabe von eine große Menge an Puffer, um die Kammer. Bilder gesammelt wurden alle 3 s. Skala bar = 10 µm. Teil (A) Diese Abbildung wurde geändert von Artemenko Et Al. (2016) 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Film 1: Akute mechanische Stimulation löst schnelle und flüchtige Translokation von Kalk-Δcoil- RFP oder PH-Crac-GFP aus dem Zytosol der Kortex in Aggregation-kompetente D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck dieser Biosensors. Unidirektionale Laminar-Flow war eingeschaltet für 5 s zum Zeitpunkt 0 und Zellen 3 s Abständen abgebildet waren. Wiedergabegeschwindigkeit ist 5 Bilder/s. Sehen Sie zwei Beispiele für jede Zelllinie. Maßstabsleiste = 10 µm. Dieser Film Figur 2A entspricht und von Artemenko Et Al. geändert wurde (2016) 22. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Movie 2: Kontinuierliche mechanische Stimulation löst schnelle und flüchtige Translokation von Kalk-Δcoil- Ausschreibung aus dem Zytosol der Kortex vor der Migration der Zellen gegen die Fließrichtung. Vegetative Zellen, die mit dem Ausdruck KalkΔcoilwurden - RFP ausgesetzt kontinuierliche Schubspannung bei 15 dyn/cm2 ab zum Zeitpunkt 0 und 3 s Abständen abgebildet. Wiedergabegeschwindigkeit ist 10 Frames/s. Skala bar = 10 µm. Dieser Film entspricht Abbildung 3 und wurde zuvor in Artemenko Et Al. veröffentlicht (2016) 22. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, Bevölkerung und einzelne Zelle Verhalten um Strömung Scheren zu beurteilen. Wichtig ist, während frühere Studien Lokalisierung von leading und lagging Rand Markierungen während der Migration analysiert, ermöglicht das derzeitige Konzept Untersuchung der unmittelbaren Auswirkungen durch die Anwendung der Schubfluss akut. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass in der Tat, die erste Reaktion der Zellen fließen Scherung Zellwanderung nicht erforderlich ist. Rasche und vorübergehende Reaktion auf den ersten scher Fluss Reiz vorausgeht stattdessen die gerichtete Migration gesehen mit längerer Exposition, fließen, ähnlich wie die erste globale Reaktion gesehen mit einem Lockstoffgradient Verlauf zu scheren.

Die biochemischen und mikroskopische Ansätze Ertragsdaten ergänzen, obwohl jede Methode vor- und Nachteile hat. Stimulation gefolgt von Zelle Lysis und Immunoblotting PKBs, KrsB und ERK, z. B. eine Grundgesamtheit von Zellen analysiert und somit im Durchschnitt Zell-Zell-Variante, im Gegensatz zu einem Assay, der einzelne Zelle Verhalten untersucht. Jedoch tendenziell bevölkerungsbezogene Assays Maske subtile Veränderungen in Zelle Verhalten, das durch die Analyse von einzelner Zellen leicht beobachtet werden kann. Darüber hinaus wird der biochemische Test hier beschrieben nur mit Aggregation-kompetente Zellen, aus Gründen, die später diskutiert werden. Im Gegensatz dazu der Mikroskopie-basierten Test der Relokalisierung der RBD, RalGDS, PH-Crac, KalkΔcoilund PTEN, z. B. zwischen Hirnrinde und Zellflüssigkeit ist effektiv für vegetative und Aggregation-kompetente Zellen und somit für Beobachtungen Zellen mit unterschiedlichem Grad der Polarisierung breit anwendbar sind. Was macht die beiden Ansätze ergänzen, ist die Tatsache, dass sie verschiedene Sätze von verfügbaren führenden/rückständigen Rand Marker, erweitert damit die Berichterstattung über die Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netze getestet mit der Schere Flow Test prüfen.

Es ist unklar, warum vegetative Zellen, die sehr robust in Mikroskopie-basierte Tests reagieren, nicht auf die Stimulation, gefolgt von Zelle Lysis und Immunoblotting reagieren. Eine Möglichkeit ist, dass die Höhe der Querkraft auf Zellen angewendet, wenn die Platte gedreht wird die Kraft durch die Zellen in einem Strömungsraum erlebt nicht übereinstimmt. Entwickelten Zellen, im Gegensatz dazu könnte haben eine niedrigere Schwelle für Aktivierung und somit unter beiden Bedingungen reagieren. Es ist unwahrscheinlich, dass Biosensoren, die deren Tätigkeit wird durch die biochemischen Assays gemessen nicht angegeben werden oder nicht in den vegetativen Zellen aktiviert sind, da Stimulation des vegetativen Zellen mit Folsäure zu robusten Aktivierung von PKBR1/PKBA und ERK2 führt (Daten nicht angezeigt). Darüber hinaus zeigen die vegetative Zellen klare Einstellung des PH-Crac, die PIP3 Ansammlung widerspiegelt, in der Mikroskopie-basierte Test. Da PKBA Einstellung auch von PIP3 hängt, scheint es unwahrscheinlich, dass PKBA nicht auf akute mechanische Stimulation reagieren würde, es sei denn, die Bedingungen in der biochemischen Test nicht optimal, wie oben erwähnt sind. Dies bleibt eine Fläche von aktiven Untersuchung.

Die biochemische Analyse der Chemotaxis Regulierungsbehörden verpflichtet das Vorhandensein von Koffein während des Experiments. Ursprünglich wurde Koffein hinzugefügt, um zu verhindern, dass Zelle zu Zelle Signalisierung durch Sekretion von cAMP. Es scheint jedoch, dass Koffein eine andere Rolle neben Hemmung der Adenylyl Cyclase (ACA hat) da ACA-Null Zellen noch Koffein für Phosphorylierung des PKBR1 als Reaktion erforderlichen auf akute mechanische Stimulation. Koffein hat zuvor gezeigt, TorC2 Aktivität26zu blockieren. Es ist möglich, dass die Hemmung der TorC2 einige basale Motilität der Zellen blockiert und dadurch gesenkt, die basale Aktivierung von PKBR1 und anderen Komponenten der Signal Transduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke. Niedrige basaler Aktivität galt für die Beobachtung der Reaktion auf die Strömung zu scheren. In der Tat, wenn Zellen während der Entwicklung zu früheren Zeitpunkten erhoben wurden, angezeigt sie erhöhte basale Aktivität und eine reduzierte Schubfluss induzierte Reaktion. Interessanterweise ist es bekannt, dass vegetative Zellen proportional mehr PKBA Aktivität und weniger PKBR1 im Vergleich zu Zellen31 entwickelten. Es ist möglich, dass der basalen Zustand in den vegetativen und Aggregation-kompetente Zellen etwas anders geregelt ist, zum das Ausbleiben einer Reaktion des vegetativen Zellen in der biochemischen Test. Seltsamerweise, wenn Zellen zu späteren Zeitpunkten der Entwicklung gesammelt wurden, hatten sie auch eine reduzierte Antwort, wahrscheinlich wegen des starken Einflusses der Polarität auf die Lokalisierung und Aktivierung der verschiedenen Chemotaxis Regulierungsbehörden in diesem Assay untersucht.

Stimulation der Zellen in einer Mikroskopie-Kammer ergab, dass die Stärke und die Dauer der Anregung zur maximalen Antwort22beitragen. Das heißt, eine maximale Reaktion erreicht werden sogar mit einer niedrigen Querkraft wenn es für einen längeren Zeitraum angewendet wird (10 s oder 2 s). Diese Beobachtung erklärt, warum Zellen eine erste globale Antwort haben, wenn sie zuerst auf einen kontinuierlichen, aber schwach, Stimulus, die ausgesetzt sind Scherung strömungsinduzierte Migration führt. Mit dem aktuellen Gerät konnten wir nicht niedrig genug Schubfluss untersuchen das untere Ende des Bereichs zu generieren.

Vielleicht ist die wichtigste Implikation der Studienergebnisse mit akuten mechanische Stimulation, dass mechanische und chemische Reize erscheinen, in gemeinsamen Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netze einzuspeisen. Obwohl wir zeigten, dass die beiden Reize integrieren mit Bulk-Puffer-Zusatz für die mechanische Stimulation, soll zukünftige Studien ein System zu entwickeln, wo Lockstoffgradient schnell in den durchströmten Kanal lieferbar wäre wesentlich vielseitiger und leistungsfähige Methode zur Integration von mechanischen und chemischen Reizen zu beurteilen. Leider ist Lockstoffgradient Zusatz mit dem aktuellen zweizeilige Setup verbunden mit einem zweiten Schub Fluss Stimulus, denn der Lockstoffgradient hat in Anwesenheit von Strom geliefert werden. Eine brauchbare Alternative möglicherweise Laser stimuliert Freisetzung von einer Lockstoffgradient aus einem Käfig Vorläufer, wie erfolgreich für Lager von Westendorf Et al.gezeigt wurde. 32. in die Zukunft, es wäre auch interessant, Integration von anderen Stimuli zu untersuchen, z. B. Scheren fließen und Variable elektrische Felder oder Scherkräfte Strömung und Variable Substrat Steifigkeit. Das letzte Beispiel ist interessant, weil es zwei Arten von mechanischen Stimulation beinhaltet zwar die ersten Signalempfang unterscheiden könnte. Bestätigt, dass alle Reize, die gerichtete Migration führen das gleiche Signal Transduction Netzwerk zu teilen und unterscheiden sich nur in wie der Reiz wahrgenommen wird erläutert, wie Zellen in komplexen Umgebungen navigieren können. Zu guter Letzt haben wir bereits gezeigt, dass akute Stimulation mit Schubfluss zur Ausbreitung der menschlichen Neutrophilen-ähnliche Zellen22 führt. Zukünftige Arbeit prüft weitere Lokalisierung und Aktivierung der verschiedenen Komponenten der Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke mit mechanischer Reize in Säugetierzellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant R35 GM118177 PND unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

Zellbiologie Ausgabe 129 Signaltransduktion Mechanotransduktion Schubspannung Chemotaxis Rheotaxis Scherung strömungsinduzierte Migration gerichtete Migration Biosensor Lokalisierung akute stimulation
Bewertung von <em>Dictyostelium Discoideum</em> Reaktion auf akute mechanische Stimulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter