Summary
Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .
Abstract
As mitocôndrias são potências celulares que produzem ATP, lipídios e metabólitos, bem como regulam a morte de homeostase e celular de cálcio. A ultraestrutura exclusivos ricos em cristas de membrana dupla desta organela é elegantemente disposta a desempenhar as múltiplas funções de particionamento de biomoléculas. Ultraestrutura mitocondrial está intimamente ligada com várias funções; no entanto, os detalhes dessas relações estrutura-função estão apenas começando a ser descrito. Aqui, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila . Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser adaptada para estudar qualquer estrutura celular em três dimensões.
Introduction
Microscopia eletrônica é uma ferramenta valiosa para estudar o contexto estrutural de organelas que executam processos celulares e subcelulares assemblies. Métodos têm sido desenvolvidos para preservar a ultraestrutura dos tecidos ou células ou por fixação química com aldeídos ou pela alta pressão frio (HPF) seguido por congelar a substituição (FS)1,2. Os blocos da amostra incorporado podem então ser seccionados, manchados e observados com um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O espécime de HPF também poderia ser processado sob cryo-condição, tais como secionando cryo ou pelo feixe de íon focalizado (FIB) moagem e observado pela cryo-EM3,4.
Embora EM fino-seção fornece introspecções morfológicas informativas, as imagens 2D resultantes só podem revelar a ultraestrutura de uma secção específica. Como a ultraestrutura é organizada em um volume 3D permanece obscurecida. Para visualizar a ultraestrutura celular em três dimensões, um método de tomografia computadorizada do elétron foi desenvolvido onde série de imagens de inclinação foram adquirido e volta projetada para gerar uma reconstrução tomográfica5 (Figura 1). Uma série de dupla inclinação pode ser coletada pela amostra de 90° de giro e aquisição de uma segunda série de inclinação. Isto minimizará faltando-Cunha artefatos que resultam de ângulos de amostragem limitada e melhorar a resolução da tomografia.
Aqui, descrevemos a aplicação da tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar a ultraestrutura mitocondrial de Drosophila voo indirecto muscular (IFM)6,7,8,9 . A fim de obter reconstruções 3D cobrindo toda mitocôndria (aproximadamente 2,5 µm de espessura), seriais seções foram obtidas de blocos de tecido IFM de Drosophila . Tomograms de cada seção foram coletados individualmente usando software de coleta de dados automática. Reconstruções tomográficas foram geradas e seriais tomograms juntaram-se com o pacote IMOD para obter um volume reconstruído de uma mitocôndria inteira. Os tomograms apensos foram analisados pelo software 3D. As densidades de cristas mitocondriais foram segmentadas para gerar um modelo de segmentação que revelou a organização em três dimensões.
Protocol
1. seção Drosophila tecidos usando um micrótomo lâmina vibratória
- Anestesiar a drosófila no gelo e mergulhe cada única mosca em 1 mL de agarose fusão baixa de 4% em tampão fosfato. Permitir que a agarose solidificar no gelo. Normalmente, 4-6 moscas foram processadas.
- Use um micrótomo lâmina vibratória para seção incorporado drosófila em fatias com 100 µm de espessura de gel de agarose e mergulhe no fixador solução contendo glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato 0,1 M.
Nota: Vibratome de seccionamento é preferido porque a arquitetura do tecido intacto mais em comparação com outros métodos. Alternativamente, dissecando a pinça pode ser usado para dissecar IFM na fixador solução contendo glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato 0,1 M.
2. preparar espécimes EM pelo congelamento de alta pressão e Freeze método de substituição (HPF/FS)
- Lave os cortes histologicos em 3 gotas (~ 150 µ l) de tampão de fosfato, seguido por 2 gotas (~ 100 µ l) de tampão fosfato com 20% de BSA. Em seguida coloca seções em portadores de ouro para HPF repleto de buffer e 20% de BSA.
- Carrega a amostra contendo as transportadoras em um freezer de alta pressão, de acordo com o manual do usuário.
- Após a congelação, liberar as transportadoras do titular sob nitrogênio líquido e transferir para um dispositivo de congelamento-substituição de refrigeração de-140 º C.
- Execute o protocolo de congelamento-substituição conforme mostrado na tabela 1, com o FS cocktail contendo 2% de glutaraldeído, tetróxido de ósmio de 2% e 0,1% de acetato de uranilo em acetona.
- Retire os espécimes das transportadoras com uma agulha cuidadosamente e incorporar amostras em resina à temperatura ambiente. Polimerizar a resina a 65 ° C durante 16 h.
Nota: Os protocolos FS devem ser modificados para preparar outros tipos de amostras. HPF/FS é preferido para preservar a ultraestrutura e minimizar a perda do conteúdo celular.- Como alternativa, aplica um protocolo de fixação química. Fixar espécimes com glutaraldeído 2,5% durante a noite, lavar com buffers e depois corrigir com tetróxido de ósmio 1% para 2 h. lavagem e desidratam com crescente concentração de etanol e então se infiltrar e incorporar amostras em resina do Spurr antes de polimerização a 65 ° C para 16 h.
3. prepare Serial-seções dos espécimes para tomografia computadorizada de elétron
- Apare os blocos da amostra para expor a face do bloco desejado que contém o tecido.
- Pré-tratamento com partículas de ouro (10 nm de diâmetro) com 1% de BSA de 30 min. lavagem e suspender as partículas de ouro em tampão PBS. Sobreposição de partículas de ouro em grades de slot cobre revestidos com película de carbono para criar marcadores fiduciais.
- Verifique sob temperatura ter marcadores fiduciais suficientes (pelo menos 5-10 marcadores) no campo de visão de aquisição de tomografia computadorizada.
- Seções de seriais, 200-250 nm de espessura, usando um ultramicrotome de corte.
- Recolha seções seriais em grades de slot usando um loop perfeito para seções finas.
- Manche as seções com citrato de chumbo de Reynold por 10 min.
- Sobreposição de uma segunda camada de partículas de ouro fiduciais no topo as seções.
4. colete dupla inclinação elétron Tomography
- Carregar a grade de um suporte de tomografia computadorizada de eixo duplo e inserir o microscópio eletrônico de transmissão operando a 200 kV.
- Alinhe o microscópio no foco eucentric.
- Configure o software de coleta de dados automática. Ajustar e alinhar o feixe de elétrons no ajuste de imagem multi-escala. Consulte o manual do usuário para operação detalhe10 (Figura 2).
- Adquira a câmera escura e brilhante referências em um espaço vazio sem película de carbono sob a configuração de coleção de tomografia computadorizada.
- Colete um atlas e grade baixa ampliação. Selecione as mitocôndrias em seções seriais como alvos para coleção de tomografia computadorizada.
- Adquirir uma série de inclinação de-60 ° a + 60 ° com incrementos de 2 ° no eixo-A para cada destino.
Nota: Os ângulos de inclinação vão ser restrita mecanicamente pelo design do porta-amostra. O titular irá bloquear o feixe em ângulos de inclinação elevada. - Para coletar a segunda série de inclinação, gire o suporte de amostra de 90°. Adquira um novo atlas. Selecione posições correspondentes e adquirir a série de inclinação no eixo-B para cada destino.
Nota: Outros pacotes de software, tais como SerialEM e Xplore3D, estão disponíveis para coleta de dados automática.
5. reconstruir Tomograms 3D e volumes sub segmento usando Software
- Reconstrua tomograms de inclinação de eixo duplo imagens usando IMOD software11.
- Consulte o manual do usuário para detalhes de operação.
- Alinhe a inclinação individual série pelas posições de ouro marcadores fiduciais. Reconstruir tomograms ou pelo método de projeção volta ou pelo método simultâneo iterativo reconstrução técnica (SIRT) para ambos os eixos-A e B-eixo, respectivamente (Figura 3).
- Combine tomograms de eixo-A e B-eixo para gerar uma tomografia de dupla inclinação com reduzida faltando artefato de cunha.
- Unir a dupla inclinação tomograms serial seções para obter reconstruções cobrindo o volume inteiro da mitocôndria. Modele as lacunas entre as seções seriais pelo programa IMOD.
- Apare o tomograms se juntou e bin para um tamanho desejado para segmentação de volume.
- Analise se juntou tomograms serial usando software 3D.
- Consulte o manual do usuário para detalhes de operação.
- Filtre o tomograms com um filtro gaussiano (ou outro método desejado) para melhorar o contraste dos recursos e reduzir as densidades de fundo.
- Segmente a ultraestrutura mitocondrial manualmente ou automaticamente.
- Exibir modelos de segmentação para permitir a inspecção em 3D.
- Gere filmes usando ferramentas disponíveis em 3D.
Representative Results
Nós aplicamos a tomografia computadorizada serial-seção elétron para analisar as características estruturais das cristas mitocondriais que reflete seu estado energético e envelhecimento. Nós mostramos que as mitocôndrias de Drosophila IFM formam um sistema integrado de rede cristas e a matriz em 3D (Figura 4)7. Além disso, moscas mutantes com defeito de replicação de DNA mitocondrial e um fenótipo de envelhecimento acelerado acumularam mitocôndrias que continha subseções da cebola, como roda de núcleo (Figura 5)7.
Figura 1: ilustração da reconstrução de tomografia computadorizada de elétron de uma série de inclinação. No experimento, um feixe de elétrons é passado através de um objeto 3D quando o objeto é inclinado para vários graus. Para cada condição de inclinação, uma projeção 2D é gerada e capturada com uma câmera. As projecções 2D volta então são projetadas para reconstruir o objeto 3D baseado no teorema da fatia central. Na ilustração, o mesmo processo é mostrado para uma imagem 2D original que é projectada em uma única dimensão sob vários ângulos de inclinação. As projeções de 1D são usadas para reconstruir a imagem 2D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: coleta de dados automática. Uma exibição de visualizador de imagem de software mostrando o atlas de uma grade de slot que contém seções seriais, multi-escala, direcionamento de mitocôndrias e adquiriu inclina imagens. Barra de escala = 500 µm (painel superior esquerdo), 100 µm (painel inferior esquerdo), 1 µm (painel direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tomografia Serial-seção de elétron de uma única mitocôndria no músculo de voo indirecto de Drosophila . 2D micrografias (A) e (B) tomograms 3D da série seções cobrindo todo o volume de uma mitocôndria. (C), juntou-se a série-seção tomograms são projetados para criar uma secção longitudinal, com o eixo z mostrado verticalmente. Notadamente, tecido corte levou à perda de material, deixando lacunas entre tomograms juntou-se. Barra de escala = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: cristas intramitocôndrias e rede matriz revelada em 3D integrados. (A) fatias de reconstruções tomográficas de elétrons mitocondrial mostrando alterna entre membranas lamelares através do eixo z. (B) ilustrações das cristas observadas padrões de espirais bem destros ou canhotos de comutação. (C) segmentação tomográfica ilustrando uma espiral canhota em 3D (D) cristas comutação padrões foram analisados e processados de cor sobre o modelo de segmentação (E, F). Tomográfica fatia mostrando a matriz lateral confluência (escuras densidades, marcado a vermelho) através de membranas de cristas (densidades brancas). (G) segmentação modelo de tomografia, em (E), mostrando a confluência de matriz lateral (em vermelho) e cristas representante (em cinza). Barra de escala = 50 nm (A), 200 nm (C) e 300 nm (D, E, F, G). A figura foi a reimpressão de Jiang et al . 7 por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: mitocôndrias com cebola-como núcleos roda acumularam em moscas com defeitos de replicação de DNA mitocondriais durante o envelhecimento. Tomográficos representativos e a segmentação correspondente (painéis de direita), mostrando uma visão transversal (topo) e uma vista de corte longitudinal (fundo) de um núcleo roda. Segmentação de volume é indicada pela rendição de cor arbitrária para destacar o núcleo da rodando. Barra de escala: 200 nm. A figura foi a reimpressão de Jiang et al . 7 por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Temp | Tempo | Solução | |||
| 1 | -140 ° C e 0-9 ° C | 30 min | Nitrogênio líquido | |||
| 2 | -90 ° C | 96 h | Cocktail de FS | |||
| 3 | -90 ° C-60 ° C | 6 hr (5 ° C/h) | Cocktail de FS | |||
| 4 | -60 ° C | 12 hr | Cocktail de FS | |||
| 5 | -60 ° C a-25 ° C | 7 hr (5 ° C/h) | Cocktail de FS | |||
| 6 | -25 ° C | 12 hr | Cocktail de FS | |||
| 7 | -25 ° C a 0 ° C | 5 hr (5 ° C/h) | Cocktail de FS | |||
| 8 | 0 ° C | hr 1 x 3 vezes | Acetona | |||
| 9 | Temperatura ambiente | Infiltração de resina | ||||
Tabela 1: Protocolo de congelamento-substituição.
Discussion
Neste protocolo, descrevemos um fluxo de trabalho otimizado para a aplicação de tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar 3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto de Drosophila . Preservação da ultraestrutura na amostra é o principal desafio técnico para este tipo de análise. Para melhor preservar a ultraestrutura dois metodológicas passos foram incluídos. Primeiro, o tecido foi sampleado por seccionamento com micrótomo de lâmina de vibração, a fim de manter a arquitetura do tecido tanto quanto possível. Em segundo lugar, um protocolo de HPF/FS foi otimizado para preservar a ultraestrutura organela durante a preparação dos blocos da amostra incorporado. Espécimes foram congelados sob alta pressão, que abaixa o ponto de congelamento da água e reduz a formação de cristais de gelo que danificam a ultraestrutura1. Espécimes tão grossos como 0,1 mm podem ser vitrificados instantaneamente e em seguida submetidos para congelar a substituição para gerar blocos de amostra para análise EM. Melhor preservação da ultraestrutura HPF/FS observou-se, quando comparado aos métodos de fixação química. Preservação das membranas mitocondriais de duplas e membranas de cristas usando esta série de etapas para a preparação da amostra, foi drasticamente melhorada.
Obtenção de secções seriais do espécime é a etapa mais desafiadora do método. Como o feixe de elétrons tem limitado o poder de penetração, a espessura da seção é restrita a qualquer 250 nm ou 500 nm, utilizando uma temperatura de funcionamento em 200 kV ou 300 kV, respectivamente. Porque a espessura de uma mitocôndria pode ser superior a 2 µm, seções seriais são necessários para obter reconstruções de volume completo. No entanto, recuperar um número suficiente de seções seriais para abranger uma organela inteira é um desafio técnico. Aparar a face do bloco para ser tão liso quanto possível entre as bases do trapézio pode permitir que uma grade de slot acomodar mais seções e, assim, cobrir a volumes maiores. Além disso, usando um loop perfeito para seções finas aumenta a taxa de sucesso de transferir as seções seriais para a grade.
Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser realizada com equipamento de núcleo EM padrão. No entanto, o método tem algumas limitações inevitáveis que surgem a partir as limitações técnicas. Uma é que o material é inevitavelmente perdido entre seções seriais, deixando lacunas na reconstrução se juntou. Em segundo lugar está o artefato ausente da Cunha, que surge devido os ângulos de inclinação limitado que são realizáveis. Essa restrição ocorre porque o suporte de amostra não pode ser transformado em uma rotação completa sem bloquear o feixe de elétrons. Apesar dessas limitações, a tomografia computadorizada serial-seção elétron fornece resolução suficiente para revelar a ultraestrutura celular e das organelas em 3D.
Para a imagem latente de escala menor, tomografia computadorizada do cryo-elétron é uma tecnologia emergente que pode ser usada para obter a estrutura macromolecular complexos e montagens em situ em resolução nm ou sub angstrom em combinação com subtomográfica reconstrução3. Nesta aplicação, as células são diluídas por corte ou por feixe de íon focalizado sob nitrogênio líquido de moagem. Os tomograms são coletados sob condições de cryo onde estruturas moleculares são preservadas perto do estado nativo sem fixação química, desidratação ou incorporação. No extremo oposto da escala, para analisar volumes grandes de tecido, em detrimento da resolução, serial bloco-rosto microscopia eletrônica é uma modalidade de atraente mesmo que requer um instrumento específico4.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os estudos foram realizados no núcleo no Instituto de celular e biologia organísmica e o núcleo de cryo-EM da Academia Sinica, Taipei, Taiwan. O trabalho foi apoiado pela Academia Sinica e a maioria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
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