Summary
Den nuvarande artikeln beskriver generation och metabola karakterisering av fettrik kost-matade möss som en modell av kost-inducerad insulinresistens och fetma. Här finns ytterligare detaljerade protokoll för att utföra den oralt glukostoleranstest och insulin tolerans test, övervakning av glukos metabolism i vivoförändringar på hela kroppen.
Abstract
Fetma representerar den viktigaste enda riskfaktorn i patogenesen vid typ 2-diabetes, en sjukdom som kännetecknas av ett motstånd mot insulin-stimulerat glukosupptag och en grov dekompensation av systemisk glukosmetabolism. Trots betydande framsteg i förståelsen av glukosmetabolism fortfarande molekylära mekanismer för dess reglering vid hälsa och sjukdom under-undersökt, medan nya metoder att förebygga och behandla diabetes behövs omgående. Kost härledda glukos stimulerar bukspottskörteln utsöndringen av insulin, som fungerar som den huvudsakliga regulatorn av cellulära anabola processer under fed-tillståndet och därmed balanserar blodsocker nivåer för att behålla systemisk energistatus. Kronisk övergödning utlösare meta-inflammation, vilket leder till förändringar i perifer insulin receptor-associerade signalering och minskar känsligheten för insulin-medierad glukos förfogande. Dessa händelser i slutändan leda till förhöjt fasteglukos och insulinnivåer samt en minskning i glukostolerans, som i sin tur fungera som viktiga indikatorer för insulinresistens. Här presenterar vi ett protokoll för generering och metabola karakterisering av fettrik kost (HFD)-matade möss som används ofta modell för kost-inducerad insulinresistens. Vi visar i detalj den oralt glukostoleranstest (OGTT), som övervakar perifera avyttring av ett oralt glukos belastning och insulin sekretionen över tid. Dessutom presenterar vi ett protokoll för insulin tolerans test (ITT) att övervaka hela kroppen insulinkänsligheten åtgärd. Tillsammans, utgör dessa metoder och deras nedströms tillämpningar kraftfulla verktyg att karakterisera den allmänna metabola fenotypen av möss samt att särskilt bedöma förändringar i glukosmetabolismen. De kan vara särskilt användbart i fältet bred forskning av insulinresistens, diabetes och fetma att få en bättre förståelse för patogenes samt att testa effekterna av terapeutiska interventioner.
Introduction
I den utvecklade världen nått fetma och diabetes epidemiska dimensioner på grund av fysisk inaktivitet och överkonsumtion av bearbetade livsmedel, effekter som drivs av snabba urbaniseringen, industrialiseringen, samt globalisering. Även om forskning på insulinresistens och det är komorbiditeter, såsom hyperlipidemi och åderförkalkning, har fått framträdande under de senaste decennierna, de komplexa biologiska mekanismer som reglerar ämnesomsättningen i hälsa och sjukdom förbli ofullständigt förstod och det finns fortfarande ett akut behov av nya behandlingsformer att förebygga och behandla dessa sjukdomar1.
Insulin och det är motverkande hormonet glukagon fungera som de huvudsakliga regulatorerna av cellulär energi försörjning och macronutrient balans, därmed också upprätthålla korrekt systemisk blod glukos koncentrationer2. Glukos själv fungerar som en av de viktigaste stimulatorer av insulinsekretionen genom bukspottkörtelns β-celler, medan andra makronäringsämnen, humorala faktorer liksom neurala input ytterligare ändra detta svar. Insulin utlöser följaktligen ätit anabola processer genom att underlätta diffusion av överflödigt blodglukos i muskel- och fettceller och ytterligare aktiverar glykolys samt protein- eller fettsyra syntesen, respektive. Dessutom dämpar insulin nedsatt glukos utdata genom att hämma glukoneogenesen. Kroniskt överskott av energi och meta-inflammation leda till Hyperandrogenism och perifer insulinresistens på grund av ned-regleringen av insulin receptoruttryck samt förändringar i nedströms signalvägar, vilket resulterar i nedsatt känslighet för insulin-medierad glukos förfogande samt otillräcklig hämning av nedsatt glukos produktion3,4,5,6.
Ett brett utbud av djurmodeller med genetiska, näringsmässiga eller experimentella induktion av sjukdom har visat sig vara utmärkta verktyg för att studera molekylära mekanismer för insulinresistens och olika former av diabetes liksom dess åtföljande sjukdomar7 . Ett paradexempel är utbredda och väletablerad HFD-inducerad musmodell, som kännetecknas av snabb viktuppgång på grund av ökade intaget i kombination med nedsatt metabolisk effektivitet, vilket resulterar i insulin resistens8, 9. både i djurmodeller och människor, en höjning i fastande glukos och insulin i blodet, samt en försämrad tolerans till glukos administration är vanliga indikatorer av insulinresistens och andra systemiska förändringar av glukos ämnesomsättningen. Övervakning glukos och insulin i blodet vid basal staten eller efter stimulering är därför lättillgängligt utläsningar.
Protokolls beskriver generationen av HFD-matade möss samt två vanliga metoder, den oralt glukostoleranstest (OGTT) och insulin resistens testet (ITT), som är användbara att karakterisera den metabola fenotypen och utreda förändringar i glukosmetabolismen. Vi beskriver OGTT i detalj, som utvärderar avyttring av ett oralt glukos belastning och insulin sekretionen över tid. Vidare, vi ge instruktioner om hur man genomför ITT för att undersöka hela kroppen insulin-action genom att övervaka blodglukoskoncentration som svar på en bolusdos av insulin. De protokoll som beskrivs i denna artikel är väletablerad och har använts i flera studier10,11,12. Vi lämnar förutom smärre ändringar som kan bidra till att öka framgång, riktlinjer för experimentell design och analys av data, samt användbara tips att undvika potentiella fallgropar. De protokoll som beskrivs häri kan vara mycket kraftfulla verktyg för att undersöka påverkan av genetiska, farmakologisk, kost och andra miljöfaktorer på hela kroppen glukosmetabolism och dess associerade sjukdomar såsom insulinresistens. Förutom stimulering med glukos eller insulin, kan en mängd andra föreningar användas för stimulering beroende på syftet med enskilda forskning. Även om utanför tillämpningsområdet för detta manuskript, kan många andra nedströms tillämpningar utföras på de dragna blodproverna, såsom analys av blodvärden än glukos och insulin (t.ex., lipider och lipoprotein profiler) samt detaljerade analys av metabola markörer (t.ex., av kvantitativa realtid Polymerase Chain Reaction (PCR), Western blot analys och enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA)). Ytterligare flödescytometri och fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) kan användas för att undersöka effekterna i distinkta enda cellpopulationer, medan transcriptomic, proteomiska och metabolomiska metoder kan också användas för oriktade analys.
Sammantaget erbjuder vi ett enkelt protokoll för att generera en HFD-inducerad musmodell, samtidigt som ytterligare beskriver två kraftfulla metoder för att studera hela kroppen metabola förändringar, OGTT och ITT, som kan vara användbara verktyg för att studera sjukdomspatogenes och utveckla nya behandlingar, särskilt i området metabolism-associerade sjukdomar såsom insulinresistens och diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén vid medicinska universitetet i Wien och genomförs enligt de Federation av Europeiska laboratoriet Animal Science föreningar (FELASA). Observera att alla procedurer som beskrivs i detta protokoll bör endast utföras efter institutionella och statliga godkännande samt av personal som är tekniskt skickliga.
1. HFD-matade möss
Obs: Upprätthålla alla C57BL/6J möss på en 12-h ljus/mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
- Vid 6 veckors ålder, placera möss för 8-12 veckor på ett HFD (40-60% fett kalorier) inducera fetma, medan utfodring lean-gruppen kontroll en fettsnål kost (LFD) (10% fett kalorier).
- Bestämma kroppsvikt mössen på veckobasis. Vikt kurvor bör visa liknande mönster i båda grupperna, med en högre lutning i gruppen HFD matad.
2. OGTT
Obs: Om blod provtagningspunkter tid väljs under OGTT varje 15 min, experimentet bör utföras med högst 15 möss parallellt, för att ha minst 1 min samtalshantering-tid per mus.
- Förberedelser dagen före OGTT
- Överföra mössen i en bur med färska sängkläder och fast dem över natten innan du testar (14 h), samtidigt som mössen har tillgång till dricksvatten (t.ex., ta bort maten kl 6:00 för en starttid på nästa morgon kl 8:00).
Obs: Fasta möss över natten är standardmetoden, men en kortare snabb (5-6 h) är mer fysiologiska för möss (se diskussion för detaljer).
- Överföra mössen i en bur med färska sängkläder och fast dem över natten innan du testar (14 h), samtidigt som mössen har tillgång till dricksvatten (t.ex., ta bort maten kl 6:00 för en starttid på nästa morgon kl 8:00).
- Förberedelser dagen av experiment (men före experimentet)
- Förbereda 10 mL 20% glukoslösning (lös D-(+)-glukos i destillerat vatten).
Obs: Alla reagenser som administreras till djur måste vara farmakologisk grad och sterila. - Förbereda en plattan med 96 brunnar för insamling av plasma, genom att fylla en brunn för varje provtagningspunkt för tid och varje mus, med 5 µL NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8,0 i 0,9% NaCl, lagring på RT). Under experimentet, lagra denna platta på is.
Obs: Se kompletterande figur 1 för en detaljerad checklista.
- Förbereda 10 mL 20% glukoslösning (lös D-(+)-glukos i destillerat vatten).
- Mät alla möss kroppsvikt och markera deras svansar med en permanent spritpenna för att göra mössen lätt urskiljbara (t.ex., mus 1 = 1 dash, mus 2 = 2 streck, etc.).
- Glukos mätning och blodprovstagning (figur 2)
- Skär försiktigt av 1-2 mm av svans spets med vass sax (”Variant A” i figur 2). Torka alltid av den första droppen blod för att undvika hemolys eller kontaminering med vävnadsvätska före att ta nytt blodprov för bestämning av blod glukos. Rita ett litet blodprov (~ 3 µL) för mätning av basal blodglukosnivån (= tidpunkt 0) med Glukometer.
FÖRSIKTIGHET: Kontrollera och justera kontonumret av teststickor på en Glukometer.
Obs: Som en provtagningsmetod som alternativa blod, nick laterala svans ven av en mus med en vass skalpell blad (”Variant B” i figur 2). Laterala svans venen nås vanligtvis ungefär en tredjedel längs svansen från svans spets, riktning mot basen av svansen för flera prover. Användning av en lokalbedövning kräm rekommenderas. Stoppa blodflödet genom att tillämpa fingertryck på den mjuka vävnaden i minst 30 s innan djuret är tillbaka till sin bur. - Samla ett blodprov (omkring 30 µL) använder en färsk kapillärrör (håll den kapillärrör horisontellt). Töm den kapillärrör med pipett genom att placera pipettspetsen överst i kapillärrör slutet och försiktigt trycka samlas blodet i en brunn av plattan med 96 brunnar, samtidigt undvika luftbubblor. Upprepa proceduren för alla möss - en i taget.
Obs: Som ett alternativ för blodinsamling via ett kapillärrör, använda pipett justeras till den korrekta volymen (t.ex., 30 µL) att samla in blod, eller samla en droppe blod från svansen på paraffin filma och Pipettera det i EDTA-lösningen. Strikt undvika kontakten av vaselin med blod eller Glukometer teststickor, eftersom det kan påverka efterföljande mätningar av glukos och insulin.
Varning: OGTT är mycket stressande för möss: lean möss kan förlora cirka 15% av sin kroppsvikt under nattens fasta. Dessutom leder blodprovstagning vid olika tidpunkter till en betydande förlust av blod. För enklare blodprov är det möjligt att försiktigt massera mouse-tail med vaselin.
Obs: Institutionella riktlinjer kan begränsa den tillåtna mängden blod som samlas in inom en viss tid. Provtagning volymer och tidpunkter bör justeras för att inte överstiga den tillåtna maximala storleken. Mössen kroppsvikt bör användas för att beräkna totalen blod uttag tillåts.
- Skär försiktigt av 1-2 mm av svans spets med vass sax (”Variant A” i figur 2). Torka alltid av den första droppen blod för att undvika hemolys eller kontaminering med vävnadsvätska före att ta nytt blodprov för bestämning av blod glukos. Rita ett litet blodprov (~ 3 µL) för mätning av basal blodglukosnivån (= tidpunkt 0) med Glukometer.
- Beräkna volym glukoslösning baserad på kroppsvikt (1 g glukos/kg kroppsvikt; detta kan ökas upp till 3 g/kg) krävs att administreras av oral sondmatning för varje mus. En mus med en kroppsvikt på 30 g skulle exempelvis behöva 150 µL av en 20% glukoslösning att administrera 30 mg glukos.
Obs: Om du vill basera dosen av glukos på vikten på musen är det normala förfarandet. Om kroppen sammansättning data finns tillgängliga, dosen av glukos för OGTT bör beräknas utifrån lean kroppsmassa (se diskussion för detaljer). - Glukos administration
- Förbereda everythingthat behövs under hela experimentet i förväg (timer, experiment diagrambladet, glukos remsor, kapillärerna, och övervaka sprutor, glukoslösning, plattan med 96 brunnar, skalpell, kalkylator, balans, permanent spritpenna, bänk papper, en överför med pipett med en spets, och handskar).
- För glukos, hindra musen genom att greppa det ordentligt av kragen. Applicera tillräckligt fasthet till huden runt halsen att förhindra musen från vrida ur hindra och korrekt luta sitt huvud bakåt. Också se till att musen kan andas ordentligt.
Obs: När glukos administration startas, god tidsplanering är mycket viktigt. - Noggrant administrera glukoslösning (baserat på steg 2.5) direkt in i magen med en utfodring nål. Försiktigt direkt utfodring nålen genom munnen mot matstrupen. Låt musen att svälja nålen: nålen helt sjunker i nedre matstrupen/magen av musen. Injicera sedan glukoslösning (figur 3a).
- Om något motstånd är uppfyllda eller om djuret kämpar omedelbart, dra ut injektionsnålen och flytta den. Starta timern omedelbart efter den första sondmatning och administrera glukos till alla andra möss i 1 min intervall.
Obs: Det kan vara bra att applicera en droppe glukoslösning direkt från utfodring nålen till mynningen av musen, som kommer att stimulera slicka och svälja, vilket underlättar lättare införande av utfodring nålen. Gäller inte trycket när du infogar utfodring nålen som detta kan allvarligt skada djuret.
- Om något motstånd är uppfyllda eller om djuret kämpar omedelbart, dra ut injektionsnålen och flytta den. Starta timern omedelbart efter den första sondmatning och administrera glukos till alla andra möss i 1 min intervall.
- Efter 15 min, mäta blodsockernivåer med Glukometer och dessutom ta blodprov (~ 30 µL) (som beskrivs i detalj i steg 2,4) av varje mus i samma ordning som de injicerades.
Obs: Tidsplanering är mycket viktigt; Följ så nära som möjligt med samma tidsintervall som för sondmatning. Låt möss flytta så fritt som möjligt och begränsa besöksförbud till ett minimum under hela förfarandet att minska stress, vilket kan ändra resultaten. Mjölk svans med ena handen och samla in blod med den andra. - Upprepa steg 2,7 vid valda tidpunkter beroende på de förväntade resultaten (t.ex., på 30, 45, 60, 90, 120, 150 och 180 min efter administrering av glukos). Om de valda tidpunkterna är längre än 120 min, säkerställa att mössen har tillgång till dricksvatten. Säkerställa att mössen alltid har tillgång till dricksvatten. När du är klar med experimentet tillbaka möss till sina hem burar utrustad med mat och vatten.
Varning: OGTT är mycket ansträngande för möss. Därför vänta åtminstone 1 vecka innan du utför nästa metabola test, såsom en ITT. - Efter experimentet, Centrifugera blodprov 2 500 x g, 30 min, 4 ° C. Överför supernatanten (plasma) för att tömma brunnar i plattan och förvara den vid-20 ° C fram till analys.
- Spela in hemolys av prover om närvarande (se avsnitt 3).
- Bestämma plasma insulinnivåer med hjälp av en kommersiellt tillgänglig ELISA kit (se Tabell för material) efter tillverkarens anvisningar av kit.
Obs: Beroende på fastande tillstånd samt på metabolismen för utredas möss, uppstå svårigheter under denna analys: nattens fasta insulin nivåer (tidpunkt 0) är mycket låg och därför nära detektionsgränsen. Att undvika det här problemet, dubbla mängden rekommenderade plasmavolymen och således halvera resultatet av ELISA-testet. Däremot, om möss nå insulin toppen under OGTT, särskilt i HFD-matade möss, insulinnivåerna kan överskrida detektionsgränsen: Späd provet (t.ex., 10-faldig med 0,9% NaCl) och upprepa ELISA-testet. Hemolys i plasmaprover kan leda till nedbrytning av insulin, vilket resulterar i en minskning av avläsning värden. Nedbrytningen beror på tid, temperatur och hemoglobin koncentrationen i provet. Håll alltid hemolyserade prover kallt eller på is att minska insulin nedbrytning.
3. ITT
Obs: De samma försiktighetsåtgärder som beskrivs för OGTT (hantering av möss, blod, Glukometer och vaselin användning) måste också tillämpas när du utför ITT. Till exempel bör alla injektioner genomföras inom 15 min i 1 min intervall om 15 möss testas parallellt. För ITT är insamling av blodprov med kapillärrör valfritt.
- Förberedelser innan experimentet
- Snabb möss för minst 2 h innan insulin injektion, samtidigt som mössen har tillgång till dricksvatten (t.ex., ta bort mat kl 8:00, testa möss 2-5 h senare).
- Späd ut insulin 1:1,000 i 0,9% NaCl (lager: 100 U/mL insulin; arbetande koncentrationen 0,1 U/mL) och förbereda 20% glukos (D-(+)-glukoslösning löses i destillerat vatten) ska administreras om mössen blir hypoglykemiska.
Obs: ITT utförs normalt efter en kort snabb att undvika hypoglykemi som annars kan uppstå i natten fastande djur. Alla reagenser som administreras till djur måste vara farmakologisk grad och sterila.
- Mäta kroppsvikt av möss, markera svans, skär svans spetsen med vass sax och mät basal blodsockernivå som tidigare beskrivits för OGTT i steg 2,4.
- Insulininjektionen
- Att injicera insulin intraperitonealt (0,75 U insulin/kg kroppsvikt, beräknas i förväg), hindra musen av metoden kragen.
- Använd en fräsch, sterila 27 eller 30 gauge nål för varje djur att undvika obehag och risk för någon injektionsstället infektion.
Obs: Sterilisering av huden kan förlänga varaktigheten av insulin administration och därmed kan orsaka ytterligare störningar till djuret. Det rekommenderas därför inte. - Tilt mus huvudet ner i en liten vinkel att exponera den ventrala sidan av djuret. Placera den steril kanylen med den fasade kanten upp och 30 ° vinkel i den nedre högra kvadranten av djurets buk (figur 3b). Starta timern omedelbart efter den första musen injiceras.
Obs: Låg dos komboskini (0,1 E/kg) kan utföras för att bedöma särskilt nedsatt insulinkänslighet. När det gäller OGTT, beräkna injektionsvolymen baserad på kroppsvikt är det normala förfarandet, medan basera dosen på lean body mass är att föredra om kroppen sammansättning data finns tillgängliga.
- Mäta blodsockernivån vid valda tidpunkter (t.ex., efter 15, 30, 45, 60 och 90 min).
Obs: Eftersom insulin har en kort halvtid på ~ 10 min i möss13, sen skillnader efter insulin administration (t.ex., efter 2 h) återspeglar inte en direkt effekt av insulinets verkan. Administrera 20% glukoslösning om en mus blir hypoglykemiska (blodsockernivåerna under 35 mg/dL) och är i riskzonen för att dö. - Efter sista gången pekar, placera mössen tillbaka i sina hem burar som tillagas med mycket mat och vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en schematisk tidsplan för metabola fenotypning av möss på Dieter. Vid en ålder av cirka 6 veckor, bör möss placeras på en HFD, medan en LFD-grupp kan tjäna som kontrollgruppen. Ännu viktigare, bör kroppsvikt fastställas varje vecka att observera om det finns en förväntad ökning i kroppsvikt. Någon form av stress(t exbuller eller aggressivt manliga beteende) kan störa kroppen viktökning och bör avlägsnas omedelbart. Varje kohort av möss för diet experiment bör bestå av minst 10 möss eftersom dessa kost-experiment är tidskrävande och extremvärden är ofta (e.g., möss inte ökar i vikt eller möss med onormal glukos eller insulinnivåer). Efter den valda tidsperioden (beroende på studie hypotesen och tidpunkten av förväntade förändringar), kan OGTT och ITT utföras för utvärdering av glukos tolerans och insulin åtgärder. I detta papper valdes sen tidpunkter för metabola test.
Ännu viktigare, bör en återhämtningstid på minst 1 vecka mellan OGTT och ITT eftersom dessa experiment leda till betydande blod-förlust och således är mycket stressande för möss. Om blod insamling volymerna minskade (t.ex., om utför en ITT utan ytterligare blodinsamling först), kan denna återhämtningsperiod också förkortas eller utelämnas, i linje med riktlinjerna för flera blod dragningar i djur14, 15,16,17.
I denna stora studie med 60 C57BL/6J möss totalt hälften av mössen sattes på HFD eller LFD vid en ålder av 6 veckor (n = 30/grupp) och viktökning övervakades under 16 veckor på diet. Konsumtionen av HFD resulterade i en betydande ökning i kroppsvikt som visas i figur 4. Vid 6 veckors ålder var kroppsvikt 20,2 g i båda grupperna. Medan möss på LFD visade en konsekvent, något ökande kroppsvikt (31,2 g ± 2,7) under perioden observerade möss på HFD ökade kroppsvikten snabbt, särskilt under de första veckorna och nådde sin kropp vikt max efter 16 veckor på dieten. Även om vikt kurvorna visade ett liknande mönster under experimentet, jämfört mössen i HFD-gruppen nådde en 1,5 till 2 gånger högre kroppsvikt (44,4 g ± 4,0) till LFD-matade möss.
För att undersöka metabola fenotypen av de två kohorterna, utfördes en OGTT (figur 5) och ITT (figur 6). Som blodvolym är begränsad i små gnagare, för en point-of-care (POC) analys för diabetiker människor (Glukometer) att kontrollera blodsockernivåerna under dessa metabola fenotypning experiment. Som framgår i figur 2, blod glukos bildskärmarna är lätt att använda, behöver bara en liten droppe blod, och Visa blodsockernivåerna inom sekunder för dokumentation. Figur 5 presenterar tidsförloppet för absoluta glukos (figur 5a–b) och absolut insulin (bild 5 c) nivåer under OGTT. I allmänhet en frisk mus med normal glukostolerans visar en karakteristisk snabb ökning i blod glukos, når sin topp 15-30 min efter glukos utmaningen.
Efterföljande glukosupptag, främst utförs av muskler, fett-vävnad och levern-vävnad leder till en gradvis minskning av koncentrationen för glukos i blodet. I alla experiment, LFD-matade mössen tjänstgjorde som glukos tolerant kontrollgruppen och således uppfyllda förväntade metabola profilen: toppen av blodglukosnivån ~ 240 mg/dl nåddes ungefär 15 min efter administrering av glukos, omedelbart följt av en minskning som når basala nivåer cirka 60 min efter glukos utmaningen, som anger korrekt glukos eliminering. I skarp kontrast, HFD-möss nådde cirka ~ 320 mg/dL glukos och visade nästan ingen avyttring av glukos, som anger glukos motstånd. När blodsockernivåerna mellan två grupper redan skiljer sig i fastande tillstånd (som denna representativa exemplet), bör en beräkning av ytan under kurvan (AUC) ovanför baslinjen glukos utföras för att validera resultaten (figur 5a– ( b).
Dessutom bestämdes de cirkulerande insulin i blodet med en insulin-ELISA-testet (bild 5 c) för att ge mer information om den underliggande patofysiologin i denna modell. Medan insulinnivåerna var nästan oförändrat i kontrollgruppen, visade möss matas en HFD 16-fold förhöjda fasta nivåer jämfört med kontrollgruppen, liksom ett kraftigt ökat insulin svar, som anger HFD-inducerad kompenserande Hyperandrogenism som ett försök att motverka nedsatt glukos eliminering kapacitet, vilket kan orsakas av insulinresistens. Tänk dock på att inte alltför tolka resultaten av OGTT, eftersom detta test utvärderas inte direkt insulinets verkan och bör inte användas för att avsluta uttalanden om insulinresistens.
För att mäta insulinkänslighet i HFD-matade mössen, utfördes en ITT 1 vecka efter OGTT (figur 6a). I denna analys representerar den grad till vilken blod glukos koncentrationer falla efter administrering av insulin hela kroppen insulinkänsligheten åtgärder effektivare. HFD-matade mössen uppvisade en nedsatt sänkning av blodsockernivåerna jämfört med gruppen LFD matad kontroll vid alla tidpunkter under ITT, vilket tyder på insulinresistens. ITT resultaten presenteras oftast som tidsförloppet för blodsockernivån, men dessutom också inversen AUC nedanför baslinjen glukos kan visas som visas i figur 6b. Om de grupper som jämförs har liknande fastande blodglukosnivåer (vilket inte är fallet i detta experiment), kan glukosnivåerna under ITT också presenteras som en procentsats av basala glukos. Liksom i möss, en motverkande reaktion på insulin aktiveras om blodglukosnivån faller under ~ 80 mg/dL18: defekter i detta motverkande svar i en viss musmodell kan misstolkas som en ökning i insulinkänslighet. Under HFDs och efterföljande metabola fenotypiska experiment inträffa ofta extremvärden. Möss som inte vinna vikt på HFD, eller de som uppvisar onormala fasteglukos eller insulinnivåer bör uteslutas från analysen. För de båda sistnämnda, en outlier test kan utföras för varje experimentella gruppen separat (t.ex., Grubbs test)
I denna studie, som ett exempel vi visade och tolkad data av metabola experiment i vivoutföras på möss med kost-inducerad övervikt, glukosintolerans och insulinresistens och jämfört dem med en kontrollgrupp med normal kroppsvikt. Som väntat, var det nedsatt glukostolerans och Hyperandrogenism i feta möss överensstämmer med insulinresistens jämfört med åldersmatchade kontroll möss; Detta avslöjades med väletablerade, tillförlitlig, tid - och budget-vänlig metoder, som är relativt lätta att utföra. Skillnader i glukostolerans, insulinnivåer samt liksom insulinkänslighet, som hämtas alla av de presenterade metoderna vid OGTT och ITT, kan ofta hjälpa till att planera nästa steg i en studie, som kan innefatta mer sofistikerade experiment såsom hyperglykemiska eller hyperinsulinemic klämmor, samt experiment med isolerade Langerhanska.
Figur 1. Schematisk tidsplan för en föreslagna kost regim och metabola experiment i vivo. För att undersöka de metabola effekterna av HFD i möss, djur av den experimentella gruppen är placerade på HFD vid ca 6 veckors ålder, medan kontrollgruppen får en LFD. Mössen kroppsvikt bör fastställas på veckobasis att bedöma korrekt viktökning. Efter ca 12 veckor på diet (eller en vald tidpunkt beroende på forskning hypotesen) utvärderas metaboliska fenotypen av mössen av en OGTT följt av 1 vecka för återhämtning-tid och därefter en ITT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Metoder för blodprovstagning under metabola experiment. För OGTT samt när det gäller den ITT, där krävs upprepade blodprov, rekommenderar vi rita blod via noggrant skära en 1-2 mm bit svans spetsen med vass sax (Variant A), följt av bestämning av glukos i blodet med en Glukometer och ytterligare insamling av blod med en kapillär att bestämma insulinnivåer och andra relevanta blodvärden. Alternativt kan blod också provtas via svans venen (Variant B) eller arteriell kateterisering (visas inte). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Oral sondmatning av glukos (en) och intraperitoneal insulin injektion (b). Representativa bilder av oralt glukos administration använder en utfodring nål under OGTT (en) och intraperitoneal injektion av insulin under ITT (b). Se protokoll för en detaljerad beskrivning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kroppen viktökning av HFD matad och LFD matad C57BL/6J möss. C57BL/6J möss var antingen uppsättningen på 60% HFD, eller 10% LFD att fungera som en kontroll, för en period av 20 veckor. Medan möss på HFD visade en förväntad ökning i kroppsvikt, särskilt under de första veckorna på diet, LFD-matade möss visade nästan konstant kroppsvikt under den observerade perioden. Resultaten är medelvärde ± SEM. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. n = 30 per grupp. ANOVA och Tukey's post hoc test användes för att testa för olikheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. OGTT utföras i HFD matad och LFD matad C57BL/6J djur. (en) glukos nivåer under OGTT. Efter en natts fasta mättes glukosnivåer (mg/dL) i fastande tillstånd och 15, 30, 45 och 60 min efter administrering glukoslösning muntligen via sondmatning (1 g glukos/kg). Glukosnivåer i HFD-gruppen var förhöjda i fastande tillstånd samt efter glukos utmaning. Den ökning som nådde sin kulmen efter 15 min följt av en försenad och långsam minskning. Resultaten är medelvärde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per grupp. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA och Tukey's post hoc test. (b) glukos area under kurvan (AUC) vid OGTT. För att beräkna baslinjen korrigerade AUC, basala glukos nivåer (tidpunkt 0) var subtraheras från alla senare erhöll blodsockernivåerna för varje mus individuellt, följt av beräkningen av de individuella AUCs. AUC ovanför baslinjen glukos illustrerar glukos motståndet i HFD-matade mössen. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA och Tukey's post hoc test (blodsockernivåer) eller elevens två tailed t-test (AUC). (c) Insulinnivåer under OGTT. Insulinnivåer (ng/mL) mättes efter en fastande 4 h och 15, 30 och 60 minuter efter administrering glukoslösning muntligen via sondmatning (1 g glukos/kg). HFD-matade möss inte bara kompenseras för glukos injektion med en högre ökning av insulin i blodet, de också började och slutade OGTT med förhöjda insulinnivåer jämfört med kontrollgruppen. Resultaten är medelvärde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per grupp. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA och Tukey's post hoc test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Enlace utförs i HFD matad och LFD matad C57BL/6J djur. (en) glukos nivåer under ITT. Glukosnivåerna (mg/dL) mättes i fastande och 15, 30, 45 och 60 min efter injektion av insulin intraperitonealt (0,75 e insulin/kg). Under ITT, HFD-matade möss visade förhöjda blodsockernivåer. Blodglukosnivån sänktes inte tillräckligt i HFD-matade möss efter insulininjektionen. Resultaten är medelvärde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per grupp. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA och Tukey's post hoc test. (b) glukos area under kurvan (AUC) under ITT. För att beräkna baslinjen korrigerade inversen AUC, basala glukos nivåer (tidpunkt 0) var subtraheras från alla senare erhållna blodsockernivåerna för varje mus individuellt. Värdena var inverterad (multiplikation med -1), följt av beräkningen av de individuella AUCs. Till följd av den högsta glukosnivån i HFD-matade möss under OGTT korrigerade baslinjen inversen AUC var lägre i HFD-matade mössen jämfört med kontroll möss, som vidare föreslagits minskad insulinkänslighet. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA och Tukey's post hoc test (blodsockernivåer) eller elevens två tailed t-test (omvänd AUC). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Checklista för experiment förberedelse. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande figur 2. Insulinnivåer under Enlace. Plasma insulin nivåer under ITT i den LFD matad jämfört med HFD matad grupperna visade liknande dynamics i insulin plasmanivåerna efter insulininjektionen i båda grupperna. Som förväntat, uppvisade HFD möss starkt ökande basinsulin nivåer jämfört med kontrollgruppen. Vidare var ökningen av insulinnivåerna i HFD-matade mössen starkare, vilket kan delvis orsakas av överskattningen av muskelmassa om mängden injicerat insulin beräknas baserat på hela kroppen massa (metoden med konventionella normalisering) som framförs i detta experiment. Dock insulin svaret var nedsatt i gruppen HFD matad (otillräcklig minskning av plasmanivåerna glukos), vilket ytterligare betonar den insulinresistenta staten i dessa djur. Resultaten är medelvärde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistisk analys utfördes med hjälp av ANOVA och Tukey's post hoc test. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den höga prevalensen av diabetes och associerade sjukdomar hos världens befolkning finns det ett starkt krav för forskning behandlar molekylär mekanism, förebyggande och behandling av sjukdom19. Presenterade protokollet beskriver väl inarbetade metoder för generering av HFD möss, en robust djurmodell som används för metabolisk forskning, liksom överledning av OGTT och ITT, som är potent verktyg för bedömning av hela kroppen metabola förändringar såsom insulinresistens. De metoder som presenteras i detta dokument kan vara lämpligt att studera roll misstänkta gener, miljöfaktorer samt farmakologiska, kosten, fysisk eller genetiska behandlingar på hela kroppen glukosmetabolism9,10. Medan glukos fungerar som den viktigaste stimulansen för insulinutsöndringen i en OGTT, presenterade protokollet kan ändras av (co-) tillämpa andra ämnen såsom andra makronäringsämnen och hormoner som är kända för att ändra den insulin svar2. Likaså kan protokollet ITT ändras (co-) tillämpningen av andra ämnen(t exglukagon eller katekolaminer) enligt individuella forskningsfrågan. Huvudsakliga avläsning av protokollen beskrivs OGTT och ITT är blod glukos och insulin koncentrationer; mätning av andra blod parametrar såsom glukagon, fettsyra och lipoprotein nivåer samt olika metabola markörer på mRNA och protein nivå kan dock också vara användbara beroende på syftet med studien.
Utredarna bör vara medveten om att de neuroendokrina Svaren till hypoglykemi, insulinutsöndringen, insulinets verkan samt den totala metabola fenotypen starkt beror på den genetiska bakgrunden av möss10. Här, utnyttjade vi möss inom C57BL/6J genetiska bakgrunden som en HFD-inducerad modell av diabetes, som har en partiell nedsättning i glukos-medierad insulinutsöndringen på grund av naturligt förekommande borttagning i genen nikotinamid nukleotid transhydrogenas 20, att göra dem en lämplig modell för att studera fetma associerade insulin resistens8,9. Protokoll som beskrivs här maj emellertid också användas för att karaktärisera metaboliskt alternativa musmodeller av insulinresistens och diabetes, som oftast bygger på monogena sjukdomar eller kemiska förstörelsen av β-celler21, 22 , 23. försiktighetsåtgärder vid experimentell design inkluderar testning åldersmatchade möss, som insulin känsligheten minskar med ålder24respektive utföra experiment på möss från samma kön. Eftersom genetiska mutationer och behandlingar kan resultera i olika fenotyper beroende på kön25,26, kan det också vara lämpligt att undersöka båda könen separat från varandra.
Blod urvalsmetoden beskrivas i detta protokoll kräver inte narkos, som kan påverka hjärtfrekvens, blodflödet och glukosmetabolism, ger icke-fysiologiskt resultat10. Alternativt kan en arteriell kateter implanteras, som tillåter vaskulär provtagning utan hanterar stress under experimentet, men lägger även ansträngning, kostnader samt risken för djurs förlust till experimentet. För OGTT, möss är vanligen fastade övernattning (14-18 h), som framkallar en katabola tillstånd hos möss, starkt nedbrytande leverns glykogen butiker. Även om detta minskar variabiliteten i baslinjen blodsockernivåerna, långvarig fast minskar ämnesomsättningen och förbättrar glukos utnyttjande i möss, som står i kontrast till situationen i människor10,27. Som de utfodring mönsterna hos möss inte också härma mänskligt beteende, kan det således mer fysiologiska att utföra en OGTT efter en kort fasta. Som dygnsrytmen har en stark effekt på systemisk glukos metabolism28, är det viktigt att tänka på vid vilken tid på dagen de experiment som beskrivs här bedrivs. För att undersöka metabolismen av möss under sin aktiva period (den mörka fasen), kan en omvänd ljus-mörk-cykel vara värdefullt att generera fler fysiologiska resultat.
Den beskrivna administreringsvägen kan också varieras beroende på specifika hypotesen testas. Peroral administrering av glukos under ett glukostoleranstest leder till mer rörlig insulinutsöndringen, som magtömningen, gastrointestinal motilitet, hormoner (Inkretinerna) och neurala input ändra och förlänga den insulin svar2, 10. under väl beskrev ”inkretinsystemet effekt”, upptaget av glukos från tarmen leder till frisättning av gastrointestinala hormoner såsom GLP1, som förstärker oral glukos-levererade insulin pressmeddelande29. För att kringgå dessa effekter, en glukos bolus kan också administreras intravenöst (IVGTT) eller intraperitonealt (IPGTT). Utflykter både glukos och insulin varierar betydligt beroende på valt leverans rutten. Jämfört med OGTT, leder intraperitoneal administrering av glukos till en ökad och långvarig topp i plasma glukosnivåer, medan plasma insulinnivåer stiga i en försenad, men mer ihållande mode30. På samma sätt kännetecknas intravenös glukos förvaltning av en fördröjd insulin svar31. De kraftigt stigande insulinnivåer samt mer robust AUC-insulin-uppgifter som erhållits under OGTT föreslår att muntliga leverans av glukos kan vara känsligare att upptäcka förändringar i glukosmetabolismen i chow matad kontra HFD-matade möss30, 31. både intragastrisk och intraperitoneal leverans är likartad i fråga om svårighetsgrad för de djur och tekniska svårigheten, medan intravenös administrering är vanligtvis svårare samt mer stressande för möss32. Oral administrering ytterligare eliminerar 10-20% graden av fel under intraperitoneal injektioner i intestinala lumen eller magen, vilket kan påverka graden av glukos leverans och omfördelning33,34.
Men det är mest fysiologiska rutten av glukos leveransen, är OGTT begränsad redovisning för endast glukosupptaget, medan en fullständig måltid innehåller även proteiner, komplexa kolhydrater, fetter, fibrer och mikronäringsämnen. Standardmetoden vid OGTT är att basera glukos dosen på kroppsvikten av musen, medan vanligtvis 1-3 g glukos/kg kroppsvikt administrerad35,36. I vissa fall kan en högre glukos lastning än 1g/kg behövas att avslöja en nedsatt glukos tolerans30. Många musmodeller av fetma och diabetes kännetecknas av förändringar i kroppssammansättning, särskilt en massiv ökning i fettmassa, medan muskelmassa (muskel, hjärnan och levern), som är den viktigaste platsen för glukos förfogande inte ändras proportionellt. Den konventionella normalisering strategin för kroppsvikt därmed resulterar i ett oproportionerligt högre dos av glukos som lean vävnaden i en feta mus utsätts jämfört med icke-feta musen. Denna bias ökar med en högre glukos dos30. Därför bör optimalt dosen av glukos (OGTT) samt insulin (ITT) beräknas på muskelmassa, om kroppen sammansättning data är tillgängliga37. Om bedömningen av kroppssammansättning inte är möjligt på grund av tekniska begränsningar, bör doseringen utföras enligt kroppsvikt (kompletterande figur 2), medan tillämpar en fast dos, såsom i en mänsklig OGTT bör vara en sista utväg om utför dessa tester i möss10,35,36. I protokollet presenteras användes en handhållen helblod monitor att mäta glukos i blodet, vilket är fördelaktigt i tester såsom OGTT och ITT som kräver flera provtagning av små blod volymer. Dessa enheter är dock utformade för humanblod, att ha en reducerad dynamiskt omfång. Alternativt, glukos nivåer kan mätas i de insamlade plasmaprover, t.ex., med fullt automatiserad kemi analysatorer i rutinmässiga laboratorier. Förutom insulin, kan C-peptid mätas i protokoll som beskrivs som ett mer direkt indikator på β-cellen sekretoriska funktion, som inte utvinns i levern i motsats till insulin38,39. Glukoneogenes behöver bedömas, kan pyruvat tolerans test (PTT) tillämpas, vilket är en annan variant av protokollen för det här beskrivna, övervakning glykemiskt utflykter efter administrering av en pyruvat bolusdos40.
De här beskrivna metoderna av OGTT och ITT kan ofta förklara observerade skillnader i glukostolerans och kan ytterligare tjäna att föreslå vilka efterföljande, mer sofistikerade experiment ska utföras nästa (t.ex., hyperglykemiska klämmor eller studier på isolerade öar). Sammanfattningsvis vi presentera ett enkelt protokoll för generering av en HFD-inducerad musmodell och ytterligare beskriva OGTT och ITT, som är kraftfulla verktyg för att bedöma förändringar i metabola fenotyp i vivo och kan vara användbart att studera metabolism-associerad sjukdomsmekanismer samt nya behandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av medicinska vetenskapliga fonden av borgmästare av staden Wien och Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa - Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa - Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid - Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline - creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
References
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G.
- Reaven, G. M.
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S.
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J.
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
