Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.
Abstract
Cellule natural killer (NK) appartengono al sistema immunitario innato e sono una difesa immune prima linea anti-cancro; Tuttavia, essi vengono soppressi nel microambiente tumorale e il meccanismo di fondo è ancora in gran parte sconosciuto. La mancanza di una fonte affidabile e coerenza delle cellule di NK limita i progressi della ricerca di immunità delle cellule NK. Qui, segnaliamo un sistema in vitro che in grado di fornire alta qualità e quantità derivate da midollo osseo murine delle cellule di NK in una condizione senza alimentatore. Ancora più importante, inoltre dimostriamo che con successo silenziamento genico mediato da siRNA inibisce la maturazione delle cellule NK E4bp4-dipendente utilizzando questo sistema. Così, questa romanzo in vitro cellule NK differenziazione del sistema sono una soluzione di biomateriale per ricerca di immunità.
Introduction
Progressione del cancro dipende in larga misura il tumore microambiente1,2, tra cui immunociti host-derivato, ad esempio, le cellule NK. Numerosi studi hanno dimostrato che le cellule NK intratumoral sono correlate negativamente con la progressione del tumore3,4. Inoltre, studi clinici hanno mostrato che la terapia adottiva delle cellule NK è una possibile strategia per cancro5,6,7,8,9. L'immunoterapia del cancro basati su cellule NK recentemente è stato suggerito come opzione terapeutica per i tumori solidi, ma sfide esistano dovuto la secrezione di citochine immunosoppressive e downregulation di attivazione ligandi nel microambiente dei tumori solidi 10,11. Trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) è stato suggerito per svolgere un ruolo soppressivo nella carcinogenesi, ma paradossalmente le cellule tumorali producono anche TGF-β1 per supportare il tumore sviluppo12,13,14 , 15. segnalazione di TGF-β può sopprimere l'attività citolitica delle cellule di NK via giù-regolando la velocità di risposta dell'interferone e CD16-mediata di interferone-gamma (IFN-γ) produzione in vitro16,17, 18.
Anche se la rottura di segnalazione di TGF-β nel microambiente tumorale possa essere un modo possibile per l'eliminazione dei tumori, bloccando completamente segnalazione di TGF-β causerà malattie autoimmuni grazie alla sua funzione di anti-infiammatori, come testimoniano lo sviluppo della effetti collaterali tra cui l'infiammazione sistemica, difetti cardiovascolari e autoimmunità nel topo modelle19. Così, la comprensione del meccanismo di funzionamento di TGF-β-mediata immunosoppressione porteranno all'identificazione di un accessibile obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro.
Per delucidare gli eventi molecolari necessari per lo sviluppo delle cellule NK, Williams et al. stabilite un sistema in vitro per la differenziazione di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo murino in NK cells20. Questo sistema facilita in gran parte lo studio meccanicistico di sviluppo delle cellule NK, compresa l'individuazione di nuovi progenitori delle cellule NK21. Tuttavia, i progenitori di midollo osseo dovrebbero essere coltivati nel sistema con il supporto di cellule stromali OP9 come un alimentatore strato20,21, e questa popolazione cellulare eterogenea limita in gran parte l'applicazione ulteriore gene di interruzione strumenti (ad es., silenziamento genico mediato da siRNA) specificamente applicata per la differenziazione delle cellule NK.
Qui, descriviamo un sistema privo di alimentatore che è stato sviluppato modificando ulteriormente il sistema in vitro di Williams et al.20. Nel nostro sistema, le cellule stromal alimentatore OP9 non sono necessari, e invece OP9 medium condizionale è usato senza influenzare la differenziazione delle cellule NK in vitroe questo recentemente ci portano a scoprire che il TGF-β è in grado di promuovere la progressione del cancro tramite sopprimere lo sviluppo delle cellule NK E4bp4-dipendente nel microambiente tumorale22. Questo nuovo sistema fornisce con successo un metodo privo di sfondo per delucidare il meccanismo molecolare di sviluppo delle cellule NK in condizioni specifiche (ad es., alta TGF-β1, silenziamento genico mediato da siRNA, ecc.) in vitro.
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Protocol
Il protocollo per ottenere e differenziazione NK derivate da midollo osseo cellule (BM-NK) si basa su metodi precedentemente pubblicati20,21,22. Tutte le procedure con i topi sono state approvate da animale etica sperimentale Comitato (AEEC) presso l'Università cinese di Hong Kong.
1. preparazione del Medium condizionato OP9
- Cultura la linea cellulare murina stroma OP9 in alfa-MEM contenente 20% FBS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina, a 37 ° C in atmosfera umidificata di aria/CO2 (95%: 5%).
- Contare le celle con un emocitometro, poi seme 2 x 106 delle cellule OP9 per ciascun matraccio di cultura2 75cm con 15 mL di terreno. Cultura per 48 h.
- Quando la cultura raggiunge 80% confluenza, lavare il matraccio con 10 mL di PBS e aggiungere 20 mL di pianura medio di alfa-MEM (senza FB e antibiotici) per fiaschetta.
- Raccogliere il mezzo di condizione OP9 nel matraccio di cultura a 24 h, ripulire i detriti cellulari con 0,25 µm in polietersulfone (PES) filtro e conservare a 4 ° C (uso entro 2 settimane).
2. isolamento delle cellule del midollo osseo del topo
- Eutanasia di un mouse C57BL/6J 12-week-old con un sovradosaggio di pentobarbitone (100 mg/kg, l'iniezione intraperitoneale). Confermare la morte dalla mancanza di respirazione, quindi raccogliere le ossa di femore con un taglio di coltello chirurgico alle giunzioni tra le ossa e rimuovere i muscoli restanti con la lama graffiando delicato.
- Mettere le ossa in una provetta da centrifuga 50 mL contenente refrigerati sterile alfa-MEM e quindi eseguire la procedura seguente in una cappa di biosicurezza.
- Eliminare il terreno di alfa-MEM e sciacquare le ossa con etanolo al 70% per 30 s.
- Lavare le ossa con PBS sterile ghiacciata due volte per ripulire l'etanolo rimanente.
- Trasferire le ossa in un mortaio contenente 5 mL di PBS ghiacciata, e delicatamente frammentano le ossa con un pestello (non polverizzare li).
- Agitare delicatamente le ossa agitando il pestello per rilasciare cellule del midollo osseo in PBS. Raccogliere le cellule del midollo osseo contenente PBS in una nuova provetta da centrifuga 50 mL.
- Ripetere il passaggio 2.6 per quattro volte fino a quando diventano i frammenti di osso solido bianco a colori.
- Centrifugare la provetta a 465 x g per 5 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante.
- Risospendere il pellet con 18 mL di acqua distillata sterile e lasciar riposare per 30 s per rimuovere le cellule di anima rosse.
- Aggiungere 2 mL di 10 ghiacciata X PBS per arrestare la reazione, quindi filtrare la miscela attraverso un colino di cella di 70 µm per rimuovere cellule rosse del sangue lisate.
- Centrifugare la provetta a 465 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con 20 mL di PBS ghiacciata.
- Lavare le cellule ripetendo passo 2.11 una seconda volta.
- Trasferire il pellet cellulare in una piastra Petri sterile 100 mm con 10 mL di mezzo di condizionale OP9 da passo 1.2 completati con 20% FBS e una miscela di 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino di 100 U/mL.
- Incubare il piatto a 37 ° C con 5% CO2 per 2 h. trasferimento delle cellule non collegate in un nuovo contenitore di cultura ad una densità di 5 x 105 vitali cellule/mL (numero di celle di un emocitometro con esclusione del blu di trypan) con la stessa formula media come descritto al punto 2.13 e incubare a 37 ° C con 5% CO2.
- Il giorno 4, cambia la condizione di cultura medio condizionale OP9 completati con 20% FBS e 2.000 U/mL del-2 murino.
- Aggiornare il terreno di coltura ogni 3 giorni; cellule NK mature possono essere ottenute da giorno 7 e qualificate come nella sezione 4.
3. mediata da siRNA Gene Silencing differenziazione delle cellule di NK
- Il controllo di siRNA o sciocchezze (NC) con un agente di transfezione secondo il manuale del prodotto della premiscela.
- Eseguire il passaggio 3.1 in qualsiasi momento dal giorno 0.
- Aggiungere il 50 nM di siRNA o NC miscela alle cellule da passo 2.14.
- Ripetere il passaggio 3.1 su ogni media rinfresco (ad es., giorno 0, 4 e 7) fino al punto finale sperimentale.
4. analisi di differenziazione delle cellule NK mediante citometria a flusso
- Ad un momento opportuno, raccogliere la sospensione di differenziazione delle cellule e lavare con PBS ghiacciata.
- Fissare le cellule con buffer di fissazione delle cellule secondo il manuale del prodotto.
- Lavare le cellule fisse con PBS ghiacciata e quindi risospendere 1 x 106 cellule in 100 µ l di Buffer di macchiatura Cytometry di flusso contenente Cy3-coniugato anti-topo NKp46 e PE-coniugati di anticorpi anti-topo CD244 in un rapporto di diluizione di 1: 100.
- Macchia il campione al buio a temperatura ambiente per 2 h.
- Risospendere i campioni macchiati con 300 µ l di PBS, poi acquisire dati di FACS e analizzare con Cytobank piattaforma20 (http://cytobank.org/).
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Representative Results
Risultati rappresentativi sono ottenuti seguendo il protocollo descritto. Cellule in sospensione totale del midollo osseo sono state coltivate sotto il sistema di differenziazione privo di alimentatore per 11 giorni; significativo aumento nel tasso di proliferazione è stata osservata di giorno 7 rispetto al numero delle cellule totali il giorno 0 (Figura 1A). Cellule NK mature con alto rapporto nucleare citoplasmico e citoplasma ricco di granulo morfologia sono state trovate di giorno 6 nel sistema (Figura 1B).
Per delucidare l'effetto regolatore di segnalazione di TGF-β1/Smad3 nella differenziazione delle cellule NK, midollo osseo, le cellule sono state trasfettate con siRNA contro E4bp4 mRNA (siE4bp4, che sopprime efficacemente il livello di mRNA di E4bp4, come mostrato nella Figura 2) o sciocchezze controllare il giorno 0 e giorno 4 nella cella-alimentatore sistema libero. La differenziazione le cellule sono state coltivate nel sistema con o senza inibitore Smad3 SIS3 per 6 giorni. Analisi di flusso rilevato che atterramento di E4bp4 in gran parte soppressa la maturazione delle cellule NK come illustrato dalla riduzione nel CD244+ ve NKp46- ve NK cellule immature rispetto a controllo NC-transfettate, mentre l'inibizione dell'attivazione di TGF-β1/Smad3 Salva in modo significativo la soppressione mediata da siRNA di maturazione delle cellule NK rispetto al gruppo siE4BP4-trasfettate (Figura 3).
Figura 1 . Immagine di NK derivate da midollo osseo le cellule dal sistema alimentatore-free. (A) crescita curva del midollo osseo le cellule che subiscono la differenziazione delle cellule NK nel sistema fino al giorno 11, ottenuta mediante il conteggio delle cellule. (B) appaiono in cellule NK Mature con alto rapporto nucleare citoplasmico e morfologia di citoplasma ricco di granello di giorno 6, come indicato dalle frecce. Ingrandimento di 200 x, scala bar 50 µm. dati rappresentano media ± SEM per 3 esperimenti indipendenti, * * *p < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Effetto di silenziamento genico mediato da siRNA sul midollo osseo cellule che subiscono differenziazione delle cellule NK il giorno 6. La differenziazione le cellule transfected con controllo di assurdità (NC) o siRNA targeting murino E4bp4 mRNA (siE4bp4) il giorno 4 e 0. PCR in tempo reale mostra che il livello di espressione del mRNA di E4bp4 è stata ridotta significativamente in cellule di NK si-E4bp4 trattati il giorno 6 rispetto al gruppo di NC. I dati rappresentano la media ± SEM per 3 esperimenti indipendenti, * *p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Silenziamento di E4bp4 inibisce la differenziazione delle cellule NK derivate da midollo osseo murine in modo TGF-β1/Smad3-dipendente. (A) flusso cytometry analisi dimostra che atterramento di E4bp4 in gran parte diminuisce la produzione delle cellule NK immature (CD244+ ve NKp46-ve) il giorno 6 rispetto al gruppo di controllo (NC) di assurdità utilizzando il sistema privo di alimentatore in vitro , che può essere significativamente salvato sopprimendo l'attivazione di TGF-β1/Smad3 con 1 µM di Smad3 inibitore SIS3. (B) quantificazione dei risultati dell'analisi di flusso, * * *p < 0.01 confrontato con NC; ### p < 0.01 rispetto al gruppo siE4BP4-transfettate. Vengono visualizzati dati rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1. Gating strategia per analisi di flusso di espressione marcatore delle cellule NK nella differenziazione totale cellule il giorno 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel presente lavoro, abbiamo descritto un metodo novello per la produzione di cellule NK murina derivanti dal midollo osseo in vitro. L'alimentatore delle cellule nel sistema originale21,22 è sostituito con successo dal medium condizionato delle cellule OP9, che in gran parte aumentata la stabilità del sistema di differenziazione. Inoltre, il sistema può produrre elevate quantità e purezza di NK maturo cellule per in vitro come pure in vivo le analisi, che possono facilitare lo studio meccanicistico, nonché ricerca traslazionale delle cellule NK in malattie umane.
Il metodo descritto è stato utilizzato per indagare il ruolo normativo di segnalazione di TGF-β1 in soppressione delle cellule NK durante lo sviluppo di cancro23. Come non c'era nessuna influenza dalle cellule dell'alimentatore, in gran parte sono migliorare l'efficienza di atterramento di siRNA-mediata del gene come pure inibizione mediata da inibitore. L'assenza di cellule di alimentatore OP9 ci permette di dimostrare con chiarezza la funzione biologica del Smad3 nello sviluppo delle cellule NK E4BP4-mediata, mostrando l'atterramento o inibizione di geni bersaglio in vitro23.
Ancora più importante, questo sistema può essere ulteriormente utilizzato per produrre una grande quantità di cellule NK murine geneticamente per saggi in vivo . Ad esempio, abbiamo prodotto almeno 1 x 108 cellule NK mature da cellule del midollo osseo di un singolo mouse da questo sistema, e le cellule NK con colpo di un gene specifico sono state infuse nel modello di topo NOD/SCID del tumore-cuscinetto per illustrare la differenza di effetti di cancro-uccisione in vivo23. Infatti, altre modifiche possono essere fatto sulle cellule NK in questo sistema, come la sovraespressione genica virale, macchiatura delle cellule, ecc.
Tuttavia, dovrebbe essere notato che un massimo del 70% delle cellule NK mature possono essere prodotti dal sistema il giorno 9 (dati non mostrati), che è simile al risultato del sistema coltivato con OP9 stromal mostrato da Williams et al. 21 per superare questa limitazione, le cellule NK miste possono essere ulteriormente purificate con un flusso ordinamento macchina, nonché kit di isolamento delle cellule NK commerciali al fine di isolare la popolazione desiderata.
In conclusione, è sviluppato un nuovo metodo per la differenziazione delle cellule NK da cellule del midollo osseo murino. Questo sistema di romanzo può fornire un'opzione per l'ottenimento di elevata purezza e quantità di cellule NK mature per lo studio dell'immunità nelle malattie umane.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Research Grants Consiglio di Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) l'innovazione e fondo della tecnologia di Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), sovvenzione diretta per ricerca-CUHK (2016.035) e studioso di Hong Kong Programma.
H.-Y.L. progettato e supervisionato tutti gli esperimenti e contribuito alla preparazione del manoscritto. P.M.-K.T. eseguirono degli esperimenti, hanno analizzato i dati e ha contribuito alla preparazione del manoscritto. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., d.-M.W., e G.-Y.L. raccolti campioni animali e partecipato negli esperimenti sugli animali. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuito alla preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
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