Summary
Protokol her beskriver renset hEAG1 ion-kanal protein interaktioner med lille molekyle lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PIP2). Målingen viser, at BLI kunne være en potentiel metode til romanen små-molekyle ion-kanal ligand screening.
Abstract
Bio-lag interferometri (BLI) assay er et værdifuldt redskab til måling af protein-protein og protein-lille molekyle interaktioner. Her, vi først beskrive anvendelsen af denne roman etiket-gratis teknik til at studere samspillet mellem menneskelige EAG1 (hEAG1) kanal proteiner med lille molekyle PIP2. hEAG1 kanal er blevet anerkendt som potentielle terapeutiske mål på grund af dets afvigende overekspression i kræft og få gevinst af funktion mutationer involveret i nogle typer af neurologiske sygdomme. Vi renset hEAG1 kanal proteiner fra et pattedyr stabil ekspressionssystem og målt interaktion med PIP2 af BLI. Vellykket måling af kinetik af binding mellem hEAG1 protein og PIP2 viser, at BLI assay er en potentiel høj overførselshastighed tilgang anvendes til nye små-molekyle ligand screening i ion-kanal farmakologi.
Introduction
Målretning celle overflade-tilgængelige ion-kanal proteiner med små molekyler giver et enormt potentiale for ligand screening og biologiske drug discovery1,2,3. Således, en passende værktøj er nødvendig for at studere samspillet mellem ion-kanal og små molekyler og deres tilsvarende funktion. Patch-clamp optagelse har vist sig for at være en enestående og uerstattelige teknik i ion-kanal funktionelle analyse. Dog fastslå, om de små molekyler direkte målrette Ionkanaler kræver andre teknologier. Traditionelt, blev radioaktive ligand bindende assay brugt til at observere kinetik af binding mellem lille molekyle og dens mål ion-kanal protein. Brugen af denne teknik er dog begrænset på grund af dens krav i radioaktive mærkning og registrering. Desuden forhindrer de forudsætning skridt til at mærke de små ligand i undersøgelsen, dens bruger i mange typer af Ionkanaler uden kendte specifikke ligand. Nogle etiket-fri teknikker såsom NMR spektroskopi, røntgen diffraktion, individuel thermophoresis (MST)4 og overflade plasmon resonans (SPR) har været brugt til at måle de protein-lille molekyle interaktioner. Men disse typer af assays normalt ikke kan give tilstrækkelige oplysninger på grund af vanskeligheder ved at få fuld længde protein, lav opløsning af dynamics, lav overførselshastighed og høje omkostninger5. I modsætning til disse teknikker fremstår bio-lag interferometri (BLI) som en roman etiket-fri metode til at overvinde disse ulemper til påvisning af protein-lille molekyle interaktioner ved immobilisere et bittesmå mængder af protein prøve på overflader biosensor og måling af den optiske skiftende signaler6,7. Som en lovende biosensor platform, BLI teknik er allerede udført for at observere samspillet mellem små molekyler med naturlig vand opløselige proteiner som et humant monoklonalt antistof CR80208 og den detaljerede analyseprocedure er blevet rapporteret i en tidligere artikel9. Selvom nøglerolle ion-kanal protein for nye terapeutiske mål opdagelse er blevet anerkendt, ion-kanal protein-lille molekyle interaktion analysen baseret på BLI ikke er blevet beskrevet.
Menneskelige Ether à go-go kanaler (hEAG1) er udtrykt i forskellige typer af kræftceller og centrale nervesystem, hvilket gør kanal a potentielle terapeutiske mål for mange kræftformer og neuronale forstyrrelser10,11, 12,13,14. Den elektrofysiologiske undersøgelse i vores lab har bekræftet den hæmmende effekt af phosphatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PIP2) på hEAG1 kanal15. Baseret på vores resultater, test PIP2 direkte interaktion med hEAG1 ved hjælp af BLI teknik kan være et forbillede for andre typer af ion-kanal protein-lille molekyle sammensat interaktion især for de kanaler, der mangler specifikke ligander. Henhold til instruktionerne BLI assay, vi forberedte biotinylated hEAG1 proteiner og immobiliseret dem på overfladen af streptavidin (SA) biosensor tips efterfulgt af interaktion dem til PIP2 løsninger at observere deres direkte bindende mellem den protein og lipid. Efter udlæg i PIP2 hEAG1 protein coated overflade, tykkelse af lag på overfladen øger, som direkte korrelerer den spektrale Skift og kan måles i real-time16. Bindende kinetik kan bestemmes på grund af en positiv forskydning i foreningen trin og en negativ forskydning i dissociation trin. Ifølge dette princip vi renset funktionelle hEAG1 ion-kanal protein fra HEK-239T stabil udtryk system ved hjælp af affinitet rensning metode til at opretholde den in vitro- funktionelle tilstand, derefter målt kinetik af bindingen af forskellige koncentration PIP2, og gav en semblable kinetiske data som observeret i elektrofysiologiske målinger15. Tæt korrespondancen mellem resultaterne fra BLI og elektrofysiologiske målinger viser for første gang BLI egnethed som et relevant analytisk værktøj for ion-kanal membran protein-lille molekyle interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Linjen HEK-293T celle løbende udtrykker FLAG-markeret hEAG1 kanal protein er konstrueret af transfecting en pCDH lentiviral plasmid som indeholder DNA sekvens af hEAG1 med et FLAG på den distale C-terminus HEK-293T celler efterfulgt af den puromycin-resistente udvalg som tidligere beskrevet15.
1. affinitet rensning af FLAG-markeret hEAG1 kanal Protein fra HEK-293T celler
- Tø celler stabilt at udtrykke hEAG1 kanaler fra flydende kvælstof til 37 ° C varmt vand hurtigt. Seed celler (ca 5 x 106 frosne celler) i et 10 cm parabol. Vokse cellen overnatning i Dulbeccos modificerede Eagle's (DMEM) medium suppleret med 8 mL 10% føtal bovint serum (FBS), 100 enheder/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 4 mM L-glutamin og ændret medium den næste dag.
- Check normal god landbrugspraksis fluorescens af disse HEK-293T celler ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende for at sikre den høje procentdel af celler udtrykker stabilt hEAG1 kanaler i de dyrkningsbaserede system. Eksponentielt trypsinize de voksende celler med 1 mL 0,25% trypsin i 1 minut ved stuetemperatur og thenadd 2 mL serum-holdige kultur væske til at opsige fordøjelsen. Overføre 400 μL af cellesuspension til en 15 cm parabol indeholder 15 mL af komplet DMEM medium. Forberede fire 15 cm retter i alt.
-
Høste disse celler efter 2-3 dages kultur når cellerne kommer til på omkring 90% confluency.
- Fjern vækstmediet fra cellerne og vaske dem to gange med 4 mL af phosphat bufferet saltvand (1 x PBS, pH = 7.4).
- Kassér PBS efter vask.
- Skrab cellerne i 2 mL 1 x PBS for hver tallerken ved hjælp af celle Skrab og overføre de skrabede celler med 1 mL afpipetteres i en 15 mL tube.
- Centrifugeres cellesuspension i 5 min på 420 x g ved 4 ° C.
- Syren fradekanteres, og supernatanten.
- Resuspenderes celle i alt 4 mL af lysisbuffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7,0, indeholdt komplet protease hæmmer) i 30 min på isen, og vortex grundigt til lysate hver 10 min.
- Centrifugeres cellen lysate i 10 min på 12.000 x g ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten til en 5 mL tube og holde det på køl til umiddelbar brug.
-
Forberede anti-FLAG M2 affinitet harpiks.
- Grundigt suspendere harpiks (leveres som en 50% suspension i butikken buffer) af blid inversion sikre anti-FLAG M2 affinitet gel flaske er en ensartet suspension af gel perler.
- Straks overføre 400 μL af suspension til et koldt 1.5 mL tube.
- Der centrifugeres suspension for 30 s på 8, 000 x g ved 4 ° C, og supernatanten omhyggeligt at vaske ud butik bufferen.
- Tilsæt 500 μL 1 x PBS til harpiks og suspendere pellet med 1 mL pipette. Derefter centrifugeres suspension for 30 s på 8, 000 x g ved 4 ° C og kassér supernatanten PBS omhyggeligt. Gentag disse wash skridt til at klare den lagrede buffer.
- Tilsæt 500 μL protein ekstrakt supernatanten forberedt på trin 1.3.8 til harpiks pellet at suspendere pelleten og overføre suspension til en ny kølet 5 mL tube. Gentag dette trin igen for at sikre ingen gel perler venstre. Føj venstre protein ekstrakt til blandingen.
- Inkuber blanding natten på en shaker på 8 rpm ved 4 ° C til at fange FLAG fusion protein.
- Der centrifugeres blandingen efter 12 h inkubation i 10 min på 1, 000 x g ved 4 ° C.
- Supernatanten og vaske pellet tre gange med 500 μL 1 x PBS. Hold det på køl til umiddelbar brug.
-
Eluering FLAG hEAG1 protein med 3 x FLAG peptid.
- Forbered 3 X FLAG eluering løsning. Opløse 3 X FLAG peptid i 500 μL stamopløsning (0,5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7,5) i en koncentration på 8 μg/μL.
- Tilføje 10 μL 3 x FLAG eluering løsning til 390 μL af PBS som en 200 ng/μl slutkoncentration løsning.
- Tilsæt 400 μL af 3 x FLAG eluering løsning til gel perler forberedt på trin 1.8.
- Inkuber prøve på shaker på 8 rpm i 2 timer ved 4 ° C.
- Centrifugeres harpiks for 30 s på 8 000 x g.
- Overføre supernatanten til en frisk 1,5 mL tube og opbevares ved 4 ° C til umiddelbar brug.
2. koncentrering analyse og bekræftelse af renset FLAG Fusion hEAG1 af BCA Protein Assay Kit og Western Blotting
- Bestemme koncentrationen af oprenset protein ved hjælp af BCA protein assay kit ifølge producentens instruktion.
- Brug 30 μL prøve for vestlige analyse til at bekræfte interesse protein var blevet renset ved hjælp af et anti-FLAG antistof som tidligere beskrevet15.
3. mærkningen renset kanal Protein med Biotin for BLI Assay
- Forberede 5 mg/mL biotin stamopløsning i PBS. For hver test (to biosensorer), skal du tilføje en 3-fold kindtand overskud af biotin til 20 μg renset protein til at opnå en bedre N-terminale biotinylation af oprenset protein i PBS.
- Inkuber prøven i mørke på isen i mindst 30 min.
- Forberede fortynding (SD) prøvebuffer: PBS med 0,02% Polysorbat 20 og 0,1% bovint serumalbumin (BSA, pH 7,4).
- Udføre ultrafiltrering for at ændre buffer renset kanal protein til SD buffer. Fjerne den ubundne biotin ved hjælp af ultrafiltrering enhed med molekylvægt cutoff af 30 kDa, tilføjer SD buffer og centrifugering prøve på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Fjerne ultrafiltratet fra centrifugeglasset af ultrafiltrering enhed, tilføje 200 μl SD buffer ind i filter enheden og centrifugering prøve på 12.000 x g i 10 min. ved 4° C. Denne operation gentages mindst tre gange.
- For at indsamle bufferen udveksles prøve, tilbageføres indsætte filter enhed i en 1,5 mL tube og centrifugering dem på 2.000 x g, i 5 min. ved 4 ° C. Hold prøve på ice til umiddelbar brug.
4. forberedelse af PIP2 løsning for analysen
- Forbered stamopløsningen af PIP2 (1 mM) i ionbyttet H2O ved sonicating for 30 min på is som tidligere beskrevet17. Gemme løsningen i hætteglas ved-20 ° C og udvande det til de endelige koncentrationer umiddelbart før eksperimenter ved kraftig vortexing.
5. BLI Assay
- Tænd udstyret og kontrollere statusvinduet "instrument" for at bekræfte maskinen i tilstanden "klar" til prewarm udstyr mindst i 30 min før BLI undersøgelse.
- Sørg for, at instrumentet er lukket før åbning datafangst software og vælg "Ny kinetik eksperiment" i guiden eksperiment.
- Definere brønde skal anvendes på den 96-brønd plade af lige falde i hak for at vælge buffer, belastning og prøve. For eksempel wells, enheden for koncentrationen af biotinylated FLAG fusion hEAG1 protein bør være input som molar (10 μg, 0,09 μM).
- Definere assay trinnene herunder baseline, lastning, association og dissociation. Vælg en assay trin og dobbeltklik på den respektive kolonne. En dublet af assay definition er angivet til kontrol sensorer. Indstille rpm som 1.000. Vælg 1 min til baseline skridt og 5 – 10 min for lastning, association og dissociation, henholdsvis. Udføre test ved stuetemperatur (ca. 24 ° C).
Bemærk: Der er to vigtigste procedurer: lastning biotinylated kanal protein til sensorer og boltpistoler interaktion med lille molekyle forbindelser. De kan være fortsatte løbende (baseline, lastning, baseline, association og dissociation). Alternativt, de kan være fortsatte separat for ikke at spilde test forbindelser, når den første ladning del forgæves. - Klik på de kolonner, der indeholder sensorerne og klik på "Fyld" for at angive placeringen af sensorer i bakken sensor.
- Gennemgå alle planlagte trin for at kontrollere for fejl og gå tilbage til at rette dem.
- Angive placeringen af datafiler og klik på "Go" til at starte analysen.
Bemærk: Sensorerne skal befugtet i mindst 10 min i SD buffer, hvis dette trin er gjort, så indstillingen "Forsinket eksperiment start" skal springes over. Hvis ikke, sæt en 600 s forsinkelse før prewetting sensorer. - Sætte en sort 96-brønd plade i bunden af bakken og indsætte A1 hjørne af pladen i hak oven på bakken med plads til pladen. Brønde til at indlæse sensorerne, tilføje 200 μL analysebuffer pr. brønd i 2 brønde i række A og 2 brønde i række B i 96-brønd plade.
- Forberede en anden sort 96-brønd plade som prøve plade og fylde brøndene med 200 μl SD buffer i række B kontrol eller biotinylated hEAG1 protein løsning (10 μg) i række A som tildeles under programmering i trin 5.3.
Bemærk: Undgå at indføre bobler. - Åbne døren til instrumentet og indsætte bakken sensor og prøve plade i venstre og højre plade-indehaveren, henholdsvis. Kontroller, at sensoren bakke og prøve plade er placeret korrekt baseret på form af venstre plade holder og "A1" markør i øverste højre hjørne af rigtige plade holder. Lukker døren og begynde analysen.
6. dataanalyse
- Åbn dataanalyse software og indlæse den mappe, der indeholder data, analyse. Klik på "Behandling" for at komme ind i forarbejdning menu interface og vi kan se de farverige rå kinetic kurver.
- Under trin 1: "Data Selection", klik på "Sensor valg". På "Sensor bakken #1", klik på sensor wells kun chloroformvædet med SD buffer og højreklik for at "Ændre Sensor Type" til "Reference Sensor". På den ' prøve plade kort ", udpege alle de ikke-specifik binding brøndene, og højreklik for at"Ændre godt Type"til"Reference godt".
- Sæt kryds i boksen før "Subtraktion" af trin 2 og punkt "Dobbelt Reference".
- I trin 3: "Juster Y akse", Vælg "Baseline" som justering skridt. "Tidsinterval", indtaste de sidste 10 s af oprindeligt (dvs. fra: 0,1 til: 59.8).
- I trin 4: "Inter trin korrektion", Vælg "Juster til Baseline" at minimere signal forskydninger mellem trinene association og dissociation.
- I trin 5: "Proces", Vælg Savitzky-Golay filtrering funktion i de fleste tilfælde og Fortsæt "procesdata".
- Gemme Raw-Data for yderligere dataanalyse ved hjælp af anden software i trin 7: "Gem resultater".
-
Klik på "analyse | Kurven montering".
- "Skridt at analysere", Vælg "forening | Dissociation". "Model", Vælg 1:1.
Bemærk: vi vælge 1:1 model fordi det monteret godt på vores oprindelige data og undgå muligheden for over montering under 1:2 eller 2:1 model på grund af deres høje frihed. Men andre muligheder findes her og kan vælges passende for andre montering analyse for forskellige bindende modeller af analysand. - "Montering", Vælg Global (fuld). For "Gruppe af", Vælg "Farve". Vælg "Rmax uden hyperlinks af Sensor" til at tillade uafhængige montering for maksimal signal reaktion (Rmax).
- Klik på "Fit kurver!" til at starte den ikke-lineær regressionsanalyse. Hill ligning og enkelt eksponentiel funktion blev brugt i vores undersøgelse.
- Klik på "dataeksport | Gem rapporten"gemme montering resultater. Eller klik på "dataeksport | Eksportere resultater fra montering"til at gemme de rå data for yderligere graftegning og dataanalyse med anden software.
- "Skridt at analysere", Vælg "forening | Dissociation". "Model", Vælg 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi renset FLAG fusion hEAG1 kanal protein fra HEK-293T celler stabilt overexpressed hEAG1. Funktionen af denne fusion protein er blevet påvist ved hjælp af metoden patch-clamp og kvalitet og specificitet af oprenset protein er bekræftet af vestlige skamplet (figur 1). Renset kanal protein er biotinylated til at udføre en interaktion assay med lipider (PIP2) ved hjælp af real-time BLI analysen. BLI bindende assay konfiguration er vist i figur 2. En typisk binding kurve mellem hEAG1 og PIP2 er vist i figur 3. I dette tilfælde 3 μM PIP2 er opløst i PBS buffer (konfigurationen af PIP2 er vist i tillægs figur 1), og signalet er analyseret ved hjælp af en dobbelt reference subtraktion protokol til at fratrække den ikke-specifik binding (den bindende mellem sensor og PIP2), baggrund (interaktion mellem biotinylated hEAG1 protein og PBS), og signal drift (binding mellem sensor og PBS) forårsaget af sensor variabilitet. Og bindende spor er globalt passer og vist en velsiddende overlay (tillægs figur 2). Også, vi måler kinetik af bindingen af PIP2 til renset hEAG1 kanal kompleks af inkubere proteiner i forskellige koncentrationer af PIP2. Efter analyse får vi en dissociation konstant (Kd) værdi 0,35 ±0.04 μm, som ligner den IC50 værdi fra elektrofysiologiske målinger15. Disse resultater viste, at BLI assay er passende for ion-kanal membran protein og lipider interaktion analyse.
Figur 1: identifikation af udtryk, funktion og specificitet af rekombinante hEAG1 protein fra HEK-293T celler ved normal god landbrugspraksis imaging, patch klemme og vestlige skamplet, hhv. (A) stabil udtryk hEAG1 HEK-293T system er oprettet af monoklonale puromycin-resistente udvalg efter Transfektion med hEAG1-pCDH lentivirus system som det fremgår af normal god landbrugspraksis udtryk i næsten alle celler. (B) Pulse-protokollen (øverst) og overlejret aktuelle spor fra en repræsentativ hele-celle patch-klemme optagelse fra hEAG1 kanalerne i en stabil celle i A. Nuværende er fremkaldt af depolariserende spændinger fra bedriften spænding af-80 mV til 70 mV med trin 10 mV efterfulgt af repolarisering til-80 mV. Cellerne inkuberes i den normale K+ kanal optagelse løsninger som tidligere beskrevet15. Spænding-afhængige udad kalium strømme tyder på, at funktionelle hEAG1 kanaler er stærkt udtrykt i HEK293T celler. (C) vestlige skamplet hEAG1 kanal protein fra oprenset protein prøver. Anti-FLAG antistof genkender en enkelt protein band af ~ 110 kDa, viser en fuld-længde af FLAG-markeret hEAG1 kanal udtryk. Denne figur 1 c er blevet ændret fra Han et al. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en skematisk diagram viser BLI bindende assay protokol. Fire sensorer bruges parallelt i biotinylated-kanal proteiner eller deres opløst SD buffer til at indlæse kanal proteiner og referencer. Efter dette overføres disse fire sensorer for at assay fase til at opdage association og afstandtagen med fosfolipider eller dens løsning buffer. Kanal proteiner, fosfolipider og buffer holdninger er farvet som angivet. Den vandrette røde stiplede linje angiver BLI undersøgelse to hovedtrin: lastning og interaktion assay fase. Denne figur 2 er blevet ændret fra Han et al. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skærmbilleder viser de rå og forarbejdede data i en typisk BLI undersøgelse. (A) typisk lastning og ækvilibrering kurver viser ækvilibrering trin (60 s) med SD-buffer (baseline), lastning skridt med hEAG1 proteiner (indlæsning) og reference kurven ekvilibreres og fyldt med hEAG1 proteiner (læsning), samtidig måling af to individuelle sensor tips. (B) de lodrette røde linjer angiver den overførsel af sensorer fra lipid løsning til stødpudeopløsning under assay drift. (C) den oprindelige optiske signaler på association og dissociation faser efter forarbejdning dobbelt reference subtraktion trække ikke-specifik binding signaler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Resultater fra BLI analysen viser hEAG1 kanal protein direkte interagere med PIP2. (A) Screen capture viser de rå data over hEAG1 protein binding med PIP2 på koncentration-afhængighed måde (0,03 – 3 μM). De akkumulerede koncentrationer af PIP2 betegnes svarende til biosensorer data spor. (B) den rå behandling viser ændringerne i optisk interferens i forskellige koncentrationer af PIP2 i en repræsentativ assay. (C) kurven passer med Hill ligning fremstillet af spidsværdien af optisk interferens signalet måles ved forskellige PIP2 koncentrationer for bestemmelse af ligevægt dissociation konstanter (Kd) af samspillet mellem den hEAG1 kanal protein og PIP2 (n = 3). Figur 4B og 4 C er blevet ændret fra Han et al. 15. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: konfiguration af langkædede phosphatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PIP2). Venligst klik her for at downloade denne figur.
Tillægs figur 2: Screen capture af monteret overlayet fra BLI analysen af figur 3. Data, der er behandlet og monteret og kun vist Association og Dissociation faser. Behandlede data kurve er blå og ikke-lineære montering kurve er rød. Godhed af fit: R2 = 0.984789 X2 = 0.019109. Parameteren maksimal binding (Rmax) = 0.2875 nm (± 0.0006). Venligst klik her for at downloade denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran Ionkanaler er blevet bekræftet som de primære terapeutiske mål på over 13% af aktuelt kendte lægemidler til behandling af en lang række sygdomme, herunder hjerte-kar- og neurologiske lidelser18. Patch-klemme optagelse, har den gyldne standard for måling af de funktionelle Ionkanaler med små molekyler, været meget anvendt for ion-kanal ligander screening. Dog kan ikke sådan elektrofysiologiske metoder påvise om de små molekyler bindes til kanal direkte eller ikke19, fordi den lille molekyle kunne handle på andre proteiner eller intercellulære veje, der interagerer med kanalen. Sammenlignet med almindeligt anvendte radioaktive ligand bindende assay og andre almindeligt anvendte etiket-fri biosensor metoder, har BLI betydelige fordele i form af relativ enkel ordning, ubegrænset association fase, høj hele analysen design tættere til in vivo-system og et behov for lille mængde af immobiliserede protein (et par μg), og det kan give detaljeret indsigt i kinetiske data5,6,20.
For at inddæmme simulere i vivo situation, vi renset funktionelle hEAG1 kanal proteiner fra pattedyr stabilt ekspressionssystem. En nem og effektiv protokol for både rensning og identifikation af overexpressed ion-kanal protein fra vedhængende pattedyrceller præsenteres. Nogle vigtige tips til vellykket rensning af membranproteiner er: 1) rensningsprocessen kan være enten reduceret eller skaleres op ifølge udtryk overflod af interesse proteiner i pattedyr udtryk systemer; 2) vi smeltet en FLAG tag på hEAG1 kanal at lette rensning af dette protein med anti-FLAG affinitet perler ved hjælp af den kommercielle kit og rensning protokol C endestation. En elektrofysiologiske målinger viste, at fusion FLAG har ingen effekt på funktionen af denne kanal15; 3) inkubation af blandingen af anti-FLAG perler og protein ekstrakt natten over ved 4° C med forsigtigt ryste er nyttigt til at indfange FLAG fusion protein; 4) ved hjælp af affinitet rensning, vi kan få nok hEAG1 ion-kanal protein fra fire 15 cm retter med over 90% celle confluency for en gang assay proces.
Renset hEAG1 kanal proteiner er biotinylated ved hjælp af overskydende biotin (3-10 fold) og udveksle løsning buffer med SD buffer for yderligere BLI analysen. Den overskydende biotin kan maksimalt ændre membran kanal protein til at forbedre belagt på overfladen af biosensor tips, og SD analysebuffer indeholdende lave koncentrationer af BSA og Polysorbat 20 kan minimere uspecifik bindende9. På trods af fortsætter disse centrale operationer, til ikke-ideelle interaktioner stadig kunne findes især når du udfører en bindende undersøgelse med høj koncentration af lille molekyle, der kunne ikke-specifikt bundet til overfladen af SA sensorer og resultatet af falsk-positive interaktion som den cyanine kurve vist i figur 4A. Således, en dobbelt reference subtraktion protokol er stadig nødvendigt at få pålidelige resultater ved at fratrække de uspecifikke bindings herunder samspillet mellem sensor og lille molekyle, biotinylated hEAG1 protein med lille molekyle løsning, og sensorer med lille molekyle løsning. Denne dobbelte reference subtraktion operation har brug for fire biosensorer for en gangs skyld assay. To biosensorer vil blive belagt med biotinylated Membranproteiner og procedure samspillet assay med lille molekyle og sin buffer. De andre to sensorer bliver fugtet med SD buffer og interagere med lille molekyle og sin buffer. Kun et samspil mellem membran protein immobiliseret biosensor og lille molekyle viser det positive signal og resten af tre interaktion signaler arbejde som kontrolelementer (figur 2). Ved hjælp af denne procedure, som vist i figur 3 og figur 4, vores resultater klart demonstrere stærk interaktion mellem hEAG1 kanal proteiner og PIP2 og vise en koncentration-afhængighed profil. Det skal påpeges, at der er flere begrænsninger i vores måling. For eksempel er der nogle andre membran lipider, som kunne binde sig til renset kanal protein. Også, det er stadig ikke klart, om den forankrede oprenset protein holde deres oprindelige konformation og aktivitet. Det er meget vanskeligt at måle de reelle konfigurationer af lille molekyle lipider, når de interagerer med protein. Selvom de detaljerede processer er ukendt, vores undersøgelse viser at den bindende kinetik af BLI stemmer overens med dem, afledt af elektrofysiologiske optagelse, hvilket gør programmet roman BLI for ion-kanal protein-lille molekyle interaktion i en supplerende måde.
I Resumé bekræfter vores undersøgelse, at det er en pålidelig strategi ved at rense den funktionelle membran protein fra pattedyr udtryk system til at opdage den direkte interaktion med sin ligander. Den vellykkede anvendelse af BLI for membran protein-lille molekyle interaktion vil lette den lille molekyle screening og mekanisme udforskning i ion-kanal drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Bio-ID Center og SJTU tværfaglig forskningsfond i medicin og teknik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217) og nationale grundlæggende forskning Program af Kina (2014CB910304).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
