Summary
En protokoll for isolering av primære microglia fra murine hjerner er presentert. Denne teknikken hjelpemidler i å fremme den nåværende forståelsen av nevrologiske lidelser. Tetthet gradert sentrifugering og magnetiske separasjon kombineres for å produsere nok kapasitet i en svært ren utvalg. Videre skissere vi trinnene for karakterisering av microglia.
Abstract
Microglia, bosatt immunceller i hjernen, er de første responders betennelse eller skader i sentralnervesystemet. Nyere forskning har avdekket microglia være dynamisk, innta både pro-inflammatoriske og anti-inflammatorisk fenotyper. Både M1 (pro-inflammatoriske) og M2 (pro-reparative) fenotyper spille en viktig rolle i neuroinflammatory forhold som perinatal hjerneskade, og viser ulike funksjoner som svar på visse miljømessige stimuli. Modulering av microglial aktivisering har vært nevnt for å konferere neuroprotection dermed antyder microglia kan ha terapeutisk potensialet i hjerneskade. Men mer forskning er nødvendig for å forstå rollen som microglia i sykdom, og denne protokollen Letter. Protokollen beskrevet nedenfor kombinerer en tetthet gradert sentrifugering prosess for å reduserer mobilnettet rusk, med magnetiske separasjon, produsere en svært ren prøve primære microglial celler som kan brukes i vitro eksperimentering, uten den behov for 2-3 uker dyrking. I tillegg gir karakterisering trinnene robust funksjonelle data om microglia, hjelpe studier for å bedre vår forståelse av polarisering og grunning av disse cellene, som har sterke implikasjoner innen regenerativ medisin.
Introduction
Skade ervervet i perinatalperioden fra betennelse, hypoxic-Ischemi og blødning kan ha en rekke langsiktige sekvele. I komplekse Patofysiologien ved perinatal hjerneskade er theorized for å involvere betennelse og ischemia med påfølgende neuronal og axonal død1. Medfødte immunforsvaret spiller en viktig rolle i kaskade av hendelser som førte til skade2.
Microglia, bosatt immunceller i sentralnervesystemet (CNS), er de første responders skade3. Microglia er plast celletyper kapasitet til å være både beskyttende eller giftig, avhengig av miljøet4. De er involvert i chemotaxis, fagocytose, antigen presentasjon og produksjon av cytokiner og reaktive oksygen arter4,5. Senescent microglia konstant undersøkelsen miljøet og aktiveres av tilstedeværelsen av en utenlandsk eller skadelige stoffet4. Aktivering fører til en pro-inflammatoriske respons, kritisk i CNS beskyttelse4. Disse M1 "pro-inflammatoriske" fenotypen microglia er hovedsakelig involvert i antigen presentasjon og død av patogener4. Til tross for avgjørende rollen inflammatorisk respons i neuroprotection, kan ukontrollert eller langvarig betennelse være skadelig og føre til neuronal skade4. Men når de utsettes for visse miljømessige stimuli, kan microglia vise en anti-inflammatorisk fenotypen. Disse pro-reparative M2 microglia har en avgjørende rolle i sårtilheling og reparere6, slippe en rekke cytokiner og andre løselig meglere at downregulate betennelse, øke fagocytose og fremme reparere4, 7. rollene til microglia er variert og inkluderer kjøring oligodendrocyte differensiering under re-myelination8, beskytte neurons under oksygen og glukose uttømming i slag modeller9 og fremme neurite utvekst i ryggmargsskade modeller10.
Studiet av disse gliacellene representerer et viktig aspekt i forståelse og manipulere svaret neuroinflammation. Beskrevet protokollen lar for videre etterforskning i terapeutisk potensialet av microglia moduleringshjul i neuroinflammatory lidelser.
Modulering av microglial aktivisering mot en neuroprotective rolle er observert i en rekke forhold11,12,13. Dermed er forbedre nåværende forståelse og videre studere modulering av microglial aktivisering kritisk, krever bruk av ulike modeller inkludert både i vitro og i vivo. In vitro studier representerer et viktig verktøy for deres større effektivitet, lavere kostnader og evne til å etterforske en isolert celle befolkningen.
Det finnes en rekke protokoller beskrevet i litteraturen for isolering av microglia fra murine hjernen, utfordringen å effektivt produserer en høy avkastning prøve med god levedyktighet og høy renhetsgrad. Brukte metodene for isolering av primære microglia er av magnetiske separasjon og langvarig risting av blandet glial kulturer. Gjennom personlig erfaring, ble det funnet at det var en høy grad av mobilnettet rusk som hindret magnetiske kolonnen. Dermed ble følgende protokollen benyttet, hvilke opptar en innledende tetthet gradert sentrifugering trinn etterfulgt av CD11b magnetisk separasjon. Protokollen beskrevet nedenfor har blitt optimalisert for å produsere en svært ren prøve i tilstrekkelig mengde. Det er en fordel på grunn av dens høy renhetsgrad og kort tidsperiode-en kan utføre analyser innen 2 dager uten å kultur for 2-3 uker. Denne protokollen kan potensielt tilpasses for isolering av primære murine astrocyttene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende er godkjent av dyr etiske komiteen ved Monash University. Sunn ubehandlet neonate C57Bl6/J P3-6 mus ble brukt til å generere representant resultatene.
1. enzymatisk fordøyelse
Merk: Det er viktig å vurdere sterilitet når isolering og dyrking primære celler. Samtidig som miljøet er så sterilt som mulig, kan første disseksjon og harvest murine hjerner fullføres utenfor laminal flyt hette, med alle etterfølgende trinnene utført innen laminær strømning hette.
- Bruke sterilt instrumenter, euthanize musen av cervical forvridning, halshugge dyret og skyll med 100% etanol. Bruke liten sterilt saks, lage små incisions langs de høyre og venstre sidene av hodet. I denne alderen skreller huden bort lett. Ved hjelp av tips av buet pinsett, skyv vevet mot talerstol å avsløre skallen, inkludert Bregma.
- Stikk saks i åpningen av spinal kanalen og foreta en lateral snitt på ørekanalen. Gjør en snitt langs det sagittal suture Bregma, forsiktig peke spissen av saksen oppover for å hindre skade hjernen. Sett saks på Bregma og foreta lateral incisions de høyre og venstre sidene av hodet langs Koronal Sutur.
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig skrelle bort skallen for å avsløre hjernen. For å gjøre så, ta tak i kantene av skallen ved den laterale snittet, og trekk forsiktig skallen på siden. Hodeskallen bør løsner lett. Bruke buede tang, forsiktig scoop under hjernen til å fjerne den.
- Plasseres hjernen i 5 mL steril beholder, vask 2 - 3 ganger med iskald vask media (lav glukose Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) med 1% penicillin-streptomycin), ca 5 mL media per vask, å fjerne blod.
- Plass beholderen 5 mL i en liten Petriskål (35 mm), innholdet på is i laminær luftstrøm hette. Bruker et sterilt skalpell bladet eller sterilt saks, fjerne lillehjernen og Luktelappen. Gjøre en midtlinjen kuttet for å skille de to halvkulene.
- Nøye skrelle bort meningeal laget med fin tang, ta vare ikke for å skade halvdelene. Identifiser meningeal laget som et meget tynt lag av celler med en rød skjær på overflaten av hjernen, med synlige blodkar. Å holde hjernen kald er avgjørende for riktig meninges fjerning. Hvis meningeal laget bryter, Fortsett peeling unna revet fragmenter før den fjernes helt.
- Overføre halvkuler til en ny liten Petriskål (på is) og fyll med vask media. Hogge hjernen i små biter med sterilt skalpell blad/saks.
Merk: Disse skal være ~ 1 mm2 i størrelse, og forsiktighet bør utvises ikke å klippe dem i for liten stykker som dette kan redusere avkastningen. - Legge til 100 µL papain (17 U/mg stock) og 150 µL DNase til media og Inkuber i 30 min på 37 ° C
- Etter fordøyelsen, triturate tissue benytter en P1000 pipette. Hvis vev er for stor til å angi pipette, kan du vurdere å bruke et par eller sterilt saks for å utvide pipette spissen. Under denne prosessen ta vare ikke for å innføre bobler i media som dette kan redusere celle levedyktighet.
2. myelin rusk fjerning
- Bruk sterilt utstyr under laminær strømning hette, forberede en 50-mL konisk rør med en 100 µm celle sil, for hver hjernen. Hell innholdet i Petriskål, inneholder ufullstendig medium og hjernen bitene til en sil. Presse gjennom deler av hjernen ved hjelp av stempelet til en steril 3 mL sprøyte i sliping bevegelse inntil det er ingen flere vev synlige. Etter fordøyelsen, hjernevev skal oppløses lett.
- Kontinuerlig Filteren vaskes med vask media, ved påfylling celle silen prosessen. Dette vil vaske gjennom celler fanget i silen.
Merk: Dette bør gjøres før det er ca ~ 15 mL i røret. Dette er å sikre at silen er tilstrekkelig vasket gjennom og å maksimere mengden av celler samlet. -
Sentrifuge enkeltcelle suspensjon på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Samtidig forberede tetthet gradert medium som beskrevet.
- Forberede den lager isotonic percoll (SIP), som er tetthet gradert mediet som brukes. Gjør dette ved å legge til 9:1-forhold av tetthet gradert medium 10 x sterilt Hanks balansert salt løsning (HBSS).
- Forberede forløpninger som 30% SIP i DMEM og 70% NIPPE i 1 x HBSS. For eksempel, å forberede 10 mL av 30% SIP legge 3 mL SIP til 7 mL DMEM.
- Sug opp nedbryting fra konisk rør og resuspend celle pellets med 8 mL 30% NIPPE i DMEM. Overføre hele volumet til en frisk 15 mL konisk rør.
- Underlag 70% SIP løsningen. Gjør Fyll en overføring pipette med 70% SIP og forsiktig presse gjennom overføring Pipetter til bunnen av koniske røret. Når spissen er nær bunnen, skyv gjennom innholdet i overføring pipette.
Merk: Gjøre det sakte for ikke å forstyrre 30/70 grensesnittet. Det må være en klar linje skille de to lagene. - Sentrifuge SIP lag, inkludert cellene, på 650 x g med brems 0 og akselerasjon 4, for 25 min ved romtemperatur.
Merk: Det er viktig å fullføre spinn med brems av og tillate en sentrifuge sakte kommer til å stoppe, som anvendelse av brems vil forstyrre interphase og redusere samlingen celle mellom SIP lagene. - Sug opp mobilnettet rusk øverst på røret, og fjerne ca 4 mL media fra toppen. Dette vil lette fjerning av mononukleære celler i følgende trinn. Bruker en P1000 pipette, forsiktig lavere pipette spissen mot interphase. Isolere den mononukleære celler fra 30/70 tetthet gradert middels grensesnittet. Samle ca 3 mL fra skyet grensesnittet og overføre til en ny 15 mL konisk tube. Denne fortynne blandingen med 9 mL av HBSS å hjelpe fjerningen av tetthet gradert medium.
- Sentrifuge utvannet tetthet gradert middels interphase, som inneholder de mononukleære cellene på 500 x g for 5 min. Sug opp nedbryting og resuspend med 1 mL vekst medium (DMEM med 10% fosterets bovin serum og 1% antibiotika). Denne flekker resuspended cellene med trypan blå og utføre en celletall ved hjelp av en haemocytometer.
3. magnetiske aktivert celle sortering
Merk: Disse trinnene er endret fra produsenter protokollen.
- Sentrifuge samlet mononukleære celler på 300 x g i 10 min på 4 ° C fjerne vekstmediet som dette vil forstyrre magnetiske isolasjon. Bruker den samme celletall fra trinn 2.8, resuspend på 1 x 10-8 nucleated celler/mL i PBS (Ca++ og Mg++ gratis) som inneholder 2% FBS og 1 mM EDTA, innenfor et volum 0.1-2.5 mL.
- Legge hele volumet av celler kjerne i PBS fra forrige trinn slik polystyren runde bunnen frisk 5 mL (12 x 75 mm). Legge 50 µL CD11b PE merking reagens per 1 mL av prøven. Inkuber ved romtemperatur i 15 min beskyttet mot lyset.
- Legge til 70 µL utvalg cocktail (en kombinasjon av monoklonale antistoffer mot CD11b i PBS) per 1 mL av prøven. Inkuber ved romtemperatur i 15 min beskyttet mot lyset.
- Bland magnetiske partikler av pipettering opp og ned mer enn 5 ganger. Legge til 50 µL/mL til prøven. Inkuber ved romtemperatur for 10 min beskyttet mot lyset.
Merk: Disse partiklene deretter danner et tetramerisk kompleks med antistoffer og vil bli knyttet til kolonnen magnetisk. - Hvis det totale volumet av cellen blanding er mindre enn 2,5 mL, toppen til dette volumet med PBS (Ca++ og Mg++ gratis) som inneholder 2% FBS og 1 mM EDTA, og bland ved forsiktig pipettering 2 - 3 ganger. Sett røret (uten lokk) i magneten og ruge ved romtemperatur for 5 min.
- I en kontinuerlig bevegelse, fullt Inverter magneten som inneholder røret for 2-3 s, helle av nedbryting. Tilbake magneten til stående, og fjerne røret fra magneten. Forberede bleke de gjenværende cellene fra kolonnen.
Merk: Nedbryting inneholder umerkede og uønsket celler som er fjernet ved å snu røret mens fortsatt i magneten. Tuben inneholder de vedlagte Cd11b+ celler. - Vask cellene ved å gjenta trinn 3.5 og 3.6 to ganger mer. Hvis prøven er større enn 1 mL, anbefaler en ytterligere Gjenta trinn 3.5 og 3.6.
- Resuspend cellene i en ønsket oppblomstringen medium. Skyll siden av samling fartøyet også (f.eks. en 15 mL tube) å samle celler fra sidene av røret og maksimere avkastning.
4. bekreftelse av Microglia renhet
Merk: Den primære microglia isolert fra 3 L (n = 5 dyr totalt) ble bekreftet via fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) for å fastslå renhet representant resultat.
- Kultur celler i en T-25 bolle i vekstmediet som inneholder 10% FBS over natten, såing på en tetthet av 1-2 x 106 celler per kolbe.
- Vask cellene i T-25 flasker med PBS 3 x i 5 min å fjerne eventuelle gjenværende vekst medier som kan forstyrre trypsinization.
- Legg 2 mL 0,25% trypsin koble cellene fra flasker. Kontroller at volumet av trypsin er nok til å dekke hele overflaten av flasken. Etter milde virvler av kolbe å sikre ensartet dekning av trypsin, ruge i 5 min på 37 ° C.
- Slukke trypsinization prosessen ved å legge til 2 mL veksten mediet som inneholder 10% FBS i flasken.
- Samle nedbryting inneholder trypsinized celler og sentrifuge på 500 x g for 5 min på 4 ° C å samle celler.
- Fjern nedbryting inneholder oppblomstringen medium og trypsin og resuspend pellet 500 μL FACS buffer. Utføre celletall bruker trypan blå.
- Sentrifuger på 500 x g i 5 min på 4 ° C. Utføre Fc reseptor blokkere ved å legge til 50 μL FACS buffer + 1 μL FcR blokkering per 5 x 106 celler. Inkuber i 15 min på 4 ° C.
Merk: Fc reseptor blokken er en avgjørende skritt i flekker prosedyre å hindre uspesifisert binding av immunglobuliner Fc reseptorer i immun celle populasjoner. Dette blokade påvirker ikke nedstrøms binding av andre antistoffer. - Avslutte blokkerer prosessen ved å fortynne med 500 μL FACS buffer. Denne sentrifuge blandingen inneholder cellene på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend i frisk 500 μL FACS buffer.
- Plass fleste cellene (f.eks hvis resuspending cellene i 500 μL FACS buffer, bruk 400 μL) i et eksempel rør. Distribuere de gjenværende cellene blant kontrollrørene og topp opp til 100 μL per kontroll rør (f.eks for 6 kontroll rør, sette 16.67 μL i hver kontroll rør og topp med 83.33 μL FACS buffer). Gjør grupper (kontroll rør i fet skrift) som Unstained, enkelt farget (CD45, CD11b), enkelt live/dead flekken, FMOs og eksempel rør.
- Pellets cellene i alle rør av sentrifugering på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Stain cellene i røret med 1 μL antistoff per 100 μL FACS buffer per 5 x 106 celler. Inkuber etter 20 min på 4 ° C.
Merk: Bruk 50 μL antistoff cocktail hvis mindre enn 2 x 106 celler brukes. - Vask cellene med 500 μL FACS buffer. Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend cellene i 300 μL FACS buffer.
Merk: Bruk ~ 100 μl hvis celletall er mindre enn 2 x 106. - Bruker flyt cytometri analyse, kvantifisere cellene som CD45lav og positivt for CD11b flekker. Denne prosentandelen tilsvarer den isolerte primære microglia.
5. Immunohistochemical farging av primære Microglia
- Plate cellene i en 96-brønns plate på en tetthet 1 x 105 celler med vekstmediet og ruge over natten.
- Fjerne nedbryting og vask 3 ganger med PBS.
- Fastsette cellene med 4% paraformaldehyde i PBS i 15 min. Fjern PFA med en P1000 pipette, og deretter vaske dem 3 ganger med PBS + 0,1% Triton-X.
- Blokk for ikke-spesifikk bindingen med 3% bovin serum albumin 1t ved romtemperatur.
- Inkuber med kanin Iba-1 (1: 100) 24 h på 4 ° C. Denne fjern primære antistoff blandingen og vask 3 ganger med PBS.
- Inkuber med sekundær anti-kanin GFP konjugert (1:200) 1t ved romtemperatur. Denne fjern sekundær antistoff blandingen og vask 3 ganger med PBS.
- Montere lysbilder med et fluorescerende montering medium og ta bilder med et fluorescerende mikroskop.
6. kvantifisering av Microglia bruker pHrodo analysen
Merk: PHrodo analysen gir identifikasjon av fagocytose i kulturperler celler. Ved opptak via endocytose øker internalisering surere Environment fluorescens av bioparticle conjugates. Fluorescens nivåer kan deretter kvantifiseres av FACS. Følgende er endret fra produsenter protokollen.
- Kultur cellene i en T-25 bolle i vekst medium over natten, såing på en tetthet av 1-2 x 106 celler per kolbe. Vask cellene i T-25 flasker med PBS 3 ganger i 5 minutter.
- Koble celler med 2 mL 0,25% trypsin. Inkuber i 5 min på 37 ° C.
- Slukke trypsinisation prosessen ved å legge til 2 mL veksten mediet som inneholder 10% FBS i flasken.
- Sentrifuge celle suspensjon på 500 x g i 5 min på 4 ° C pellets celler.
- Fjern nedbryting og resuspend pellets som inneholder den primære microglia kultur medium på 106 celler/mL.
Merk: Alternativt plate celler i en 96-brønns plate minst en dag før og mål for 1 x 105 levedyktig celler per brønn på dagen analysen er utført. - Plate celler i 96-brønnen plate på 1 x 105 celler/godt, 100 μL per brønn. Plate kontroller og eksperimentelle brønner i tre eksemplarer, og la en tom brønn per positiv kontroll for en nei-cellekontroll bakgrunn subtraksjon.
- Tilsett 100 μL av veksten medier brønnene tomt for ingen-cellebakgrunn subtraksjon.
Merk: Som alle andre i vitro analysen, aktuelle kontroller er avgjørende for nøyaktigheten av lettleselig. Sammen med no-cellen kontroll (bakgrunn lesing), også inkludere kontrollen negative godt (pHrodo konjugert lagt, men lagt på is). - Dekk platen og ruge 1t i en inkubator med 5% CO2 på 37 ° C.
- Forberede eksperimentelle brønner ved å legge stimulerende og behandling. Legge til bilen kontroller (vekst medier bare) ubehandlet brønner.
Merk: Lipopolysakkarid 1 µg/mL [sentralstimulerende] og menneskelig amnion tarmepitelet (hAEC)-betinget media [behandling] ble brukt til å generere representant resultatene. - Tine ampuller konjugert fargestoff, Legg 2 mL opptak buffer og kort vortex. Overføre innhold til ren røret og sonicate etter 5 min, for å sikre at partikler er jevnt spredt.
- Sug opp kultur mediet microplate brønner og raskt erstatte med 100 μL fargestoff suspensjon. Dekk og ruge ved 37 ° C i 1 time.
Merk: Husk stain kontroll rør også. - Bruker flyt cytometri analyse, kvantifisere celler flekker positivt for konjugert pHrodo perler og presentere prosentvis (av overordnet) av aktivt phagocytosing microglia.
7. kvantifisering av Microglia apoptose etter inflammatorisk fornærmelse
- Gjenta trinn 1-7 fra "Bekreftelse på microglia Renhet"-delen.
- Plass fleste cellene (f.eks hvis du resuspended cellene i 500 μL FACS buffer, bruk 400 μL) i et eksempel rør. Distribuere de gjenværende cellene blant kontrollrørene og topp opp til 100 μL per kontroll tube (f.eks for 6 kontroll rør, sette 16.67 μL i hver kontroll rør og topp opp med 83.33 μL FACS buffer). Grupper (kontroll rør i fet skrift): unstained kvinne, single flekker (AnnexinV, Propidium iodide), single lever/døde flekker, FMOs, eksempel rør.
- Pellets cellene i alle rørene av sentrifugering på 500 x g i 5 min.
- Inkuber med 1 μL antistoff/100 μL FACS buffer/5 x 106 celler for 20 min på 4 ° C.
Merk: Bruk 50 μL hvis mindre enn 2 x 106 celler. - Vask cellene ved å legge 500 μL FACS buffer og sentrifuger på 500 x g i 5 min.
- Resuspend celle pellet 300 μL FACS buffer.
Merk: ~ 100 μL hvis celletall er mindre enn 2 x 106. - Kvantifisere celler i hver kvadrant (Q1: nekrose, Q2: sent apoptotisk, Q3: levedyktig, Q4: tidlig apoptotisk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av metodene beskrevet her, ren bestander av microglia kan isoleres og kan være klar for karakterisering ved hjelp i vitro og FACS analyse. Til å begynne med, kan opptil 18 dyr brukes per cull, med en forventet avkastning på ca 450.000-600.000 microglial celler. Det er viktig å først bekrefte renheten av isolerte cellene, og å gjøre så FACS analyse var utført av flekker for de to markørene CD45 og CD11b. identifikasjon av microglia kan være plagsom, som mange indikatorer uttrykt av microglia er også uttrykt av makrofager og bruk av disse to markørene kan nøyaktig og pålitelig kvantifisering. Spesielt microglia har en lav uttrykk for CD45, sammenlignet med høy uttrykket sett i CNS og eksterne makrofager, og er også positivt for CD11b (figur 1). Fra denne spesielle isolasjon, ble renhet av 89.3% rapportert. Etter for CD11b vi oppmerksom på at våre primære microglia dele lignende morfologiske funksjoner, med en rekke morphologies fra utpreget unramified (store sfærisk celle kroppen med liten eller ingen utvidet prosesser) til den mer ramified (med mindre, mer ovale somata og vanligvis sekundære ordre prosesser) samkjøre for aktivisering stater, som forventet å se i vivo (figur 2).
Denne to karakterisering analyser for microglia funksjon og overlevelse ble kjørt. Microglia er store phagocytic cellen i CNS, og pHrodo analysen gir kvantifisering av denne funksjonelle eiendom. En nær 3 ganger økning i phagocytic funksjon etter 24-h co kultur med hAEC aircondition medium (Figur 3) ble bemerket, målt ved kvantifiseringen fluorescerende pHrodo partikler. Til slutt, en AnnexinV-PI flekker følgende co kultur ble utført for å identifisere overlevelse av microglia etter en inflammatorisk fornærmelse. En reduksjon i microglia apoptose etter behandling med betinget medium (Figur 4) ble observert. Disse funnene tyder på at hAEC betinget medium beskytter microglia og forbedrer deres phagocytic aktivitet, som kan ha terapi perinatal hjernen skader og neuroinflammatory lidelser.
Figur 1 : Uttrykk for CD45 og CD11b av microglia. Hvert punkt representerer en merket celle og FACS analyse lar utviklingen av egen celle populasjoner. Microglia har et lavere uttrykk for CD45 antigen sammenlignet med eksterne monocytt-avledet makrofager og er positive for CD11b. tall under antistoff etiketten bytene gated celler uttrykt som prosent av befolkningen overordnede. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Morfologi av isolerte primære microglia. Som kan sees i denne figuren, microglia beholder sin sfærisk celle kroppen og tydelig ramified struktur. Skala bar = 20 µm.
Figur 3 : Kvantifisering av phagocytic funksjon i isolerte primære microglia. pHrodo-merket partikler bare fluoresce i surt miljøer, som cellular endosomes etter fagocytose. Her, er en økning i pHrodo partikkel opptak i microglia behandlet med hAEC aircondition medium observert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Analyse av microglia overlevelse etter inflammatorisk fornærmelse. (A) representant FACS tomter isolert microglia. Den kombinerte flekker av AnnexinV og propidium iodide tillater kategorisering til apoptotisk, nekrose, eller lever celler etter stimulering med LPS. (B) hAEC betinget middels reduserte microglia apoptose i forhold til kontroller, antyder en form for beskyttelse på denne cellen type. * betyr p < 0,05, student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vask medium |
| Lav glukose Dulbecco modifiserte Eagle Medium |
| 1% v/v penicillin-streptomycin |
| Digest medium (per hjernen) |
| 150 µL DNase jeg |
| 100 µL papain (17U/mg stock) |
| 3 ml vask medium |
| Oppblomstringen medium |
| Lav glukose Dulbecco modifiserte Eagle Medium |
| 10% fosterets bovin serum |
| 1% v/v penicillin-streptomycin |
Tabell 1: Tabell over løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia har muligheten til å være både pro og anti-inflammatorisk, endret av miljøet stimuli. Tidligere studier har vist modulering av microglia aktivisering kan tildele neuroprotection. Deres evne til å beskytte nevroner og reparere skader nødvendiggjør mer forskning for å fremme den nåværende forståelsen av disse komplekse cellene. Dermed er isolering av høy renhetsgrad primære microglia en viktig og nyttig teknikk. Dette er en relativt rask metode å oppnå svært ren primære microglia klar for i vitro eksperimentering innen 2 dager.
Det finnes en rekke protokoller beskrevet i litteraturen for isolering av primære microglia fra murine hjerner. Den viktigste utfordringen er å effektivt produsere tilstrekkelig utvalg, høy i levedyktighet og renhet. Den største fordelen med denne protokollen er avkastningen av en svært ren prøve uten behov for tiden i kultur. Dermed metoden forkortet fra 2 uker til 2 dager, Dette forenkler raske resultater. Karakterisering trinnene gir robust funksjonelle data om microglia, forsterke nåværende forståelse av disse komplekse cellene. Protokollen kombinerer to gjeldende tilnærminger - tetthet gradert sentrifugering og magnetiske separasjon. Magnetisk separasjon er validert i litteraturen for isolering av microglia godt i en relativt mild måte sammenlignet med andre isolasjon teknikker14,15,16. Mens det er utvilsomt endringer funksjonelle egenskaper den isolerte primære microglia i sin opprinnelige tilstand i vivo, endringer i microglia egenskaper som observert i analyser utviklet over beregnes fra en etter fordøyelsen grunnlinjen, og som sådan gjenspeiler direkte modulering av denne immun delsett.
Mens protokollen er relativt enkelt, vil forsiktig under avgjørende skritt bidra til å sikre en god avkastning. Først er det viktig å bruke lav glukose medier for å støtte glial vekst. Videre holdes murine hjernen is kaldt på alle tider under isolasjon. Dermed er det anbefalt å pre chill alle medium, samt instrumenter hvis mulig, og Følg fremgangsmåten på is. Betydelig, langvarig isolasjon ganger vil føre til dårligere cell helse og gi, derfor er det avgjørende å arbeide raskt. Videre er riktig fjerning av meningeal laget et viktig skritt når arbeider med voksen mus, ellers fibroblaster vil utkonkurrere gliacellene i vekst. Under enzymatisk fordøyelsen av hjernen, er det viktig ikke å kutte hjernen i for liten stykker som dette kan øke celledød, ideelt mål for 1 mm2 biter av vev. Når sliping vevet gjennom cellen silen, rense med media hver noen minutter for å sikre alle celler er vasket gjennom og ikke blir fanget i silen, i tillegg anbefales det å bruke en 100 μm celle sil, mindre filtre resultere i en redusert kapasitet. Et annet viktig skritt er underliggende av 70% tetthet gradert middels laget, utføre dette trinnet nøye og sakte for å sikre en klar interphase er sett er viktig, bruk av en Pasteur pipette anbefales. Bruk av 15 mL konisk rør anbefales også som separasjon av cellene var mindre effektive når 50 mL konisk rør ble benyttet. Til slutt, tetthet gradert sentrifugering må utføres i romtemperatur, som temperaturen kan påvirke tetthet graderingen.
Denne protokollen beskriver en pålitelig metode for å produsere svært ren primære microglia celler som vist av både høy uttrykk for CD45 og positive uttrykk for Cd11b (sammenlignet med lav CD45 uttrykk i perifert monocytter). Cellene kan også være isolert relativt raskt, slik det har omfanget til betydelig økt forståelse av disse glia cellene. Den kan brukes til å identifisere ulike microglia bestander fra ulike bakgrunner, slik at for studier som kan avdekke forskjeller mellom microglia isolert fra syke/skadet og friske dyr. Gjennom isolering av ren microglia innbyggere, kan terapeutiske modulering av immun celle befolkningen vurderes. For eksempel ble det funnet at hAEC-conditioned media økt fagocytose, samt økt microglia overlevelse under en inflammatorisk stimulans, dermed affording terapeutiske fordelene17. Dette korrelert til redusert apoptotisk rusk og dermed antyder klarering av disse rusk kan ha neuroprotective effekter.
Protokollen kan brukes på både neonatale og voksne mus, men eldre mus vil produsere en redusert ytelse. Videre, det kan tilpasses til å isolere primære astrocyttene fra neonatal eller voksen mus, igjen eldre mus vil resultere i en redusert ytelse. I tillegg kan endring av mekanisk dissosiasjon trinnet med en skreddersydd nylon maske med større pore størrelser i motsetning til 100 μm celle silen, ytterligere forbedre celle avkastning18.
Begrensninger av denne protokollen inkluderer lavere avkastning og tiden som kreves for denne protokollen. Avkastningen er omtrent 150 000-200 000 celler per cull av seks dyr, kontra millionene som kan oppnås gjennom uker med cellekulturer. I tillegg, mens celler kan oppnås innen to dager, er prosedyren på den første dagen ganske tidkrevende, tar ca seks timer.
Likevel, denne metoden er et svært nyttig verktøy i forståelsen av microglia i sykdom, i stand til å isolere og karakteriserer cellene innen to dager. Den produserer høy renhetsgrad primære microglia celler, tilrettelegge nøyaktig og effektiv forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
