Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere celle til celle overføring av oscillasjon informasjon av optogenetic kontroll og live overvåking av genuttrykk. Denne tilnærmingen gir en unik plattform for å teste en funksjonell betydning av dynamisk gene expression programmer i flercellet systemer.
Abstract
Cellene skal svare riktig på timelig skiftende omgivelser, som er påvirket av ulike faktorer fra de omliggende solcellene. Hakket signalveien er en slik viktig molekylær maskiner for celle til celle communications, som spiller nøkkelroller i normal utvikling av embryo. Denne veien omfatter en celle til celle overføring av oscillasjon informasjon med ultradian rytmer, men til tross for fremgangen i molekylærbiologi teknikker, har det vært utfordrende for å belyse virkningen av flercellet samhandlinger på oscillasjon genet dynamikk. Her presenterer vi en protokoll som tillater optogenetic kontroll og live overvåking av genet uttrykk mønstre på en presis timelige måte. Denne metoden avslørt har at intracellulær og intercellulære periodiske innganger hakk signalnettverk entrain iboende svingninger av frekvens tuning og fase skiftende i én celle oppløsning. Denne fremgangsmåten gjelder analyse av dynamiske funksjoner i ulike signalveier, gir en unik plattform for å teste en funksjonell betydning av dynamisk gene expression programmer i flercellet systemer.
Introduction
Celle til celle kommunikasjon spille viktige roller i embryonale mønstre i utviklingsprosesser. I virveldyr embryoer dannes metameric strukturer kalt somites langs anterior-posterior kroppen aksen med en presis timelige nøyaktighet under kontroll av en holder klokke, kalt segmentering klokken1. Under denne prosessen, en gruppe presomitic mesoderm (PSM) celler regelmessig konverteres til somites i en synkron måte. Denne prosessen innebærer synkronisert oscillasjon genuttrykk og PSM cellene som svinge i fase danner de samme somites. Den oscillasjon genuttrykk er rundt 2-3 h i mus og ca 30 min i sebrafisk. Når skilt, PSM cellene mister synkronisering2,3, men når de er re aggregerte, de kan selv organisere og gjenopprette befolkningen synkronisering4, antyder at celle-celle kobling er en nøkkel for den synkroniserte svingninger.
Omfattende arbeid avslørte at signalnettverk molekyler i Delta-hakk veien er tett koblet til synkroniserte svingninger av segmentering klokke genene. Farmakologiske hemmere eller genetiske mutasjoner hakk signalnettverk desynchronize befolkningen i oscillatorer. I sebrafisk vise mutanter av hakk signalering komponenter, for eksempel DeltaC, DeltaD og Notch1a, asynkron svingninger5,6. I kylling eller musen embryoer er ikke bare hakk ligand Delta-like1 (Dll1), men også hakk Modulator galning fringe (Lfng) nødvendig for synkroniserte svingninger7,8,9. Men det har vært vanskelig å teste forbedrer Funksjonsmulighetene av slike molekyler for dynamisk informasjon overføring fra celle til celle, fordi timelige vedtak av konvensjonelle forstyrrelsene av genet regulering dynamikken ikke var tilstrekkelig til å undersøke den prosesser av tidsskalaer 2-3 h (ultradian rytmer).
Vi har nylig utviklet en integrert metode for å kontrollere og overvåke genet uttrykk mønstre i pattedyrceller10. Denne teknologien lar induksjon av gene expression pulser av periodiske lys belysning på ultradian tidsskalaer. Denne protokollen representerer metodene fotosensitive cellelinjer og observere dynamisk svar reporter celler av live-celle luminescence overvåking i sammenhenger av celle-til-celle kommunikasjon. Denne metoden gjelder analyse av mange andre signalveier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon stabil linjer av Tol2 systemet
-
Transfect plasmider vektorer (figur 1A) Tol2-baserte optogenetic moduler sammen med transposase (Tol2) uttrykk vektoren (pCAGGS-mT2TP) i C2C12 celler. I alle trinnene, kultur celler med DMEM medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) og penicillin-streptomycin på 37 ° C (tabell 1), i nærvær av 5% CO2, ellers merket.
- Telle trypsinized celler med en celle-teller og plate 5 x 104 C2C12 celler per brønn i en 12-vel plate en dag før transfection.
- Co transfect 0.375 μg Tol2-baserte optogenetic vektorer (pAI177 eller pAI218), 0.125 μg av et stoff utvalg vektor (pAI170) og 0,5 μg av pCAGGS-mT2TP vektor ved hjelp av lipofection-reagensen.
- Trypsinize transfekterte celler, og plate dem i 100 mm kultur retter dagen etter hva.
- Exchange kultur medium for transfekterte cellene til kultur medium med 100 mg/mL hygromycin.
- Kultur celler for 3 dager å eliminere un transfekterte celler. Merk at medium endring ikke er nødvendig.
- Trypsinize transfekterte celler, og rense en populasjon av celler uttrykke fluorescerende proteiner for utvalg. For mottaker celler bærer pAI177, angi sortering porten til Green-PE kanal for rensing av mCherry-positive celle befolkningen. Angi sortering porten for foto-sensitive avsender celler bærer pAI218, APC kanal for rensing av iRFP713-positive celle befolkningen.
- (valgfritt) Opprette en klonal celle befolkningen ved standard metoder, som begrenset fortynning eller encellede sortering etter FACS.
2. evaluering av foto-følsomhet utviklet celler på befolkningsnivå
Merk: Denne delen beskriver en protokoll for å kontrollere dynamisk induksjon av Dll1 ligand proteiner på blått lys belysning av biokjemiske analyser, som qPCR og vestlige blotting.
- Definere to typer inkubatorer med eller uten lyskilder for en lys-indusert tilstand eller mørk betingelse, henholdsvis. Sette opp lys-intensiteten i en blå LED-trans-illuminator, som vist i figur 1B, ved hjelp av en lysmåler. Programmet beregner og varighet av lys belysning av lasting en kontroll-skriptet til en enkelt bord micro-kontroller som lar programmerbare tidsplaner for belysning (figur 1 c).
- Telle trypsinized celler med en celle-teller og plate 1.0 x 105 Foto-sensitive avsender celler med pAI218 og pAI170 på 35 mm diameter plast kultur retter (mer enn 12 retter for lysforhold og 1 parabolen for mørke tilstand) og angi rettene i skille inkubatorer for mørk/lys. Etter konfigurere retter, holde dørene til inkubatorer stengt til samle celle lysates.
- En og en halv dager etter plating, starte lys belysning (celler er forventet å være mer enn 80% confluent). Ikke utsett celler lys for å unngå uønskede Foto-stimulering.
Merk: Tidsplaner for belysning, avhenger av formålet med eksperimenter. Merk at en vedvarende belysning tilstand (f.eks. 1-min varighet og 10 min intervaller med 40 µmol/m2/s lyset intensitet) er tilstrekkelig for en enkel sjekk av foto-induksjon, og den sterke lys belysningen er skadelig for celler. Således, kontroller at ufarlig parametere for belysning er valgt. - Om 2 dager etter plating, forberede celle-lysate med 30 minutters intervaller. Flytte smake retter fra Inkubatorer på isen, og start forbereder celle lysates for videre analyse.
3. dynamisk avsender-mottaker analysen på befolkningsnivå: Real-time overvåkning av mobilnettet svar på optisk stimulering av avdrag
- Trypsinize og telle antall avsenderen og mottakeren cellene med standard metoder. Forberede en 1-mL totalvolum blanding suspensjon av 2.5 x 104 mottaker og 1,25 x 105 avsender celler (1:5 forhold).
Merk: 2:1, 1:1, eller 1:2 avsender-mottaker prosenter også arbeide med en total-celle rekke 1,5 x 105. 10 - Plate blandet celler i hver brønn av 24-vel svart plater med kultur medium med 1 mM luciferin.
- Analysere cellene på plate leseren for luciferase analysen, og Bekreft at utsignaler ikke er for høyt for opptak systemet.
Merk: Hvis utsignaler er høyere enn 1 x 106 Foton teller/s, de kan være mettet. I så fall redusere konsentrasjonen av luciferin optimale verdier slik at utsignaler er lavere enn 1 x 106 Foton teller/s. - Stille inn platen på innspillingssystem og starter et opptak program (figur 1 d). For eksempel starte lys belysning på 18 h etter innspillingen.
Merk: Timelige filtrering, som detrending signaler med glidende snitt og Savitzky-Golay filtrering er nyttige for visualisering av bølge-skjemaer og topp oppdagelser.
4. dynamisk avsender-mottaker analysen på encellede nivå: sanntid Imaging encellede svar under kontroll av Optogenetic forstyrrelsene
- Plate 0.5 x 105 mottakeren og 2,5 ganger 105 avsender celler på 27-mm-diameter-glass-base 35 mm diameter retter. Sikre at blandingsforhold og en total-celle nummer (en celle tetthet) er riktig justert.
- En dag etter plating, utveksle medium med 2 mL opptaksmediet (fenol-rød gratis DMEM middels med 5% FBS, penicillin-streptomycin og 1 mM luciferin), og angi glass-base parabolen på mikroskopet. Eventuelt bleke rusk av død celler med PBS (-).
Merk: Det er best å gjøre denne steg i en mørk tilstand. - Definere en invertert mikroskop utstyrt med en miljømessig kammer på 37 ° C og 5% CO2.
- Definere en avkjølt CCD kamera. Kontroller at temperaturen på CCD-sensor er avkjølt destinasjon verdien (vanligvis-90 ° C).
-
Angi parametere for "Multi-Dimensional Timelapse"-vinduet i automatisk Kjøp programvare å fange profilen med 5 min intervaller og flere 288 ganger (mer enn én overnatting opptak).
- Åpne "Multi-Dimensional Timelapse"-vinduet, Velg en luminescence kanal og en langsom 50 kHz skrivebeskyttet ut modus på rullegardinmenyen og 4 x 4 binning med 4 minutters eksponering. Kontroller at lese-out-modusen er angitt til langsom 50 kHz modus, som er avgjørende for å redusere skrivebeskyttet ut lyder for å oppdage svakt utslipp bioluminescent lys.
- Åpne "Multi-Dimensional Timelapse"-vinduet, Velg fluorescens kanaler og en rask 1 MHz skrivebeskyttet ut modus på rullegardinmenyen og 2 x 2 binning med 400 ms eksponering. Kontroller at lese-out modus er satt til rask 1 MHz modus å redusere tiden som kreves for fluorescens bildebehandling.
- Start tid-lapse innspillingen ved å klikke "Hent".
- Ekstra encellede spor av luminescence kanaler fra time-lapse filmer av bildet analyseprogramvare som følger. Først lage luminescence og fluorescens stakk bilder ved å importere bildedataene til analyseprogramvare. Luminescence bilder, fjerne varme piksler avledet fra kosmisk stråling ved å sammenligne intensiteten av bildepunktene i timelig tilstøtende bilder, erstatte pikselverdiene til timelige gjennomsnittet av de forrige og neste rammene (implementert som "SpikeNoise Filter"), bildene behandles gjelder filtere romlig utjevning, og trekk fra bakgrunnen bildepunktverdiene out-field utsikt fra hver ramme. Deretter kan du se en "områder av interesse" (ROI) for hver celle på et fluorescerende bilde på hvert punkt, Avkastningen gjelder selvlysende bilder og måle selvlysende intensiteten av hver avkastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilpasset den LightOn system11,12, som gir bilde-indusert genuttrykk i pattedyrceller, til studiet av genetiske oscillatorer med 2 - 3 h periodisitet. Dette systemet består av to deler: Foto-induserbart transcriptional aktivator-hGAVPO og en UAS-arrangøren kassett til stasjonen transkripsjon av vilkårlig gener av interesse. For å akselerere den pulsatile kinetics av foto-indusert genuttrykk, ble polyA rekkefølgen UAS-arrangøren kassetten erstattet av murine Hes1 3' UTR, som forkorter mRNA halveringstiden til 20 min i murine fibroblaster.
For å etablere stabil cellelinjer, tri-cistronic vektorer basert på Tol2 transposase systemet ble brukt13 (figur 1A). Tol2 uttrykk vektoren er avgjørende for å forbedre effektiviteten av chromosomal integrering av plasmider kassetter14. Disse vektorer bærer ikke bare uttrykk kassettene av lys-induserbart gener drevet av UAS-selskapet, men også uttrykk kassettene av foto-sensitive protein hGAVPO og lysrør proteiner (iRFP71315 eller mCherry). Denne utformingen tillot oss å rense en befolkning som effektivt integrert plasmider i vert genomer.
Vi etablert Foto-sensitive avsender cellene som produserer Dll1 ligand proteiner på blått lys belysning (figur 2A). Dette ble en Tol2-baserte bi-cistronic vektor (pAI218) brukt. For å sjekke induksjon av Dll1 ligand på lys belysning, ble celler kultivert i inkubatorer utstyrt med programmert LED blått lys kilder som vist i figur 1B og 1 C. Representant resultatene av foto-indusert Dll1 protein uttrykk dynamics oppdaget av vestlige blotting analyse er vist i figur 2B og 2 C.
For å etablere celler som svarer til hakk signalering innganger, brukte vi en Tol2-baserte bi-cistronic vektor (pAI177) bærer ustabil luciferase reporteren under kontroll selskapet hakk effektor genet Hes1 og phosphoglycerate kinase (PGK) promoter-drevet kjerner lokalisert røde fluorescerende reporter H2B-mCherry. I dette tilfellet er fluorescerende reporteren nyttig for både rensing og encellede sporing i time-lapse mikroskopi.
Når cellene Foto-induserbart avsender og mottaker er opprettet, er det klar til å utføre dynamisk avsender-mottaker analysen av co dyrking disse cellene (figur 2A). I denne analysen, foto-sensitive avsender celler som uttrykker hakk ligand protein Dll1 på blått lys belysning var co kulturperler med foto tittelen receiver celler som utfører endogene Hes1 oscillator og en bioluminescens Hes1 reporter ( pHes1-dLuc) (figur 2D). Mottaker-celler uttrykke endogenously hakk reseptoren, som svarer til Dll1 presentert av nabokommunene cellene.
Representant resultatene av dynamisk avsender-mottaker analyser er vist i figur 2E og 2F. For å oppdage dynamisk svarene på mottakeren celler med bioluminescens opptak, brukt vi først en live-celle overvåkingssystem utstyrt med en høy-sensitive Foto-multiplikator tube (avdrag) fotonet-telling og en LED blått lys kilde for lys stimulering ( Figur 1 d). Dette systemet gjør sanntid opptak av bioluminescens signaler på befolkningsnivå med planlagte lys belysning. Når disse to typer celler var co kultivert og utsatt for repeterende lys belysning (30 s varighet, 2,5 t intervaller), var syklisk svar mottaker celler i ulike forhold av miksing prosenter (figur 2E). I dette eksemplet har vi brukt Savitzky-Golay filtrering (4th orden og en 13 datapunkt vinduet) for å attenuere støyende signaler. Time-lapse mikroskopi med repeterende lys belysning (2 min varighet, 2,75 h intervaller) avslørte også de synkroniserte svarene mottaker celler på encellede nivå (grå linjer i figur 2F) og på befolkningsnivå (rød linje i figur 2F). disse data tyder på at syklisk uttrykket Dll1 protein i avsenderen celler er tilstrekkelig til å synkronisere Hes1 svingninger i nabolandet mottaker celler.
Figur 1: strategi for å analysere mobilnettet svar på optogenetic forstyrrelser. (A) skjematisk av representant plasmider vektorer brukes for denne protokollen. Disse plasmider er tilgjengelig på forespørsel. (B) et bilde av en CO2 inkubator utstyrt med en blå LED-enhet under en 6-vel celle kultur plate. (C) skjematisk diagram av en elektrisk krets til kontroll makten levere for LED-lyskilde som en programmerbar mikro-datamaskin. En SSD stafett (SSR) ble satt til stafett på/av stater digital PIN ut av mikro-datamaskinen til på/av stater LED-lyskilde. (D) et bilde og skjematisk av en live-celle bioluminescens overvåkingssystem. Merk at motorisert scenen kan flytte én retning fra en innspilling på innbetaling detektoren til belysning posisjon på LED-lyskilde. Også merke til at avdrag detektoren kan flytte fra godt til også å overvåke signaler fra individuelle brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempler på optogenetic forstyrrelsene eksperimenter. I disse eksemplene ble murine C2C12 myoblast linjer brukt. (A) skjematisk av dynamisk avsender-mottaker analysen. (B, C) Representant resultatene av lys-indusert Dll1 uttrykk analysert av vestlige blotting analyse. Dll1 proteiner ble indusert ved periodiske lys belysning med en 2,5 t periode, 2 min varigheten og intensiteten av 24.7 W/m2. (D) fluorescens bilde av co kultur-systemet av senderen og mottakeren celler. (E, F) Representant resultatene av dynamisk avsender-mottaker analysen. (E) timelige mønstre av mottakeren svar av live-celle overvåkingssystemet utstyrt med avdrag. Hvor totalt-cellen var festet til 1,5 x 105 celler, men forholdene mellom avsenderne og mottakere ble distribuert fra 5:1 til 1:2. (F) encellede imaging avslørte at oscillasjon informasjon, som ble indusert ved periodiske lys belysning (2 min varighet, 2,75 h intervaller), ble overført fra senderen til mottakeren celler. 1,5 x 105 celler med avsender-til-mottaker forholdet mellom 5:1 ble brukt. Tilpasset fra Ref. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste en metode for å kontrollere gene expression dynamics med en periodisitet av 2-3 h. Denne tidsskala er mye kortere enn de i andre konvensjonelle systemer, inkludert Tet på systemet og opprinnelige LightOn system. Nøkkelparameterne å nå de ultradian tidsskalaer er halv-livene til Foto-indusert molekylær produkter, mRNAs og proteiner. Parameterne kinetic kan avhenge celletyper og arter. Tuning av kinetikk, er erstatte Hes1 3 UTR sekvenser med andre en rett frem måte, fordi det ikke endrer funksjonene sekvenser og målet proteiner. For å søke andre 3' UTRs å få attraktive pulsatile mønstre spesielt cellene rundt, live-celle overvåking av dLuc av lys induksjon er et godt utgangspunkt og screening og validering.
En av de mest vanlige spørsmålene er om daglige håndteringen av lys-sensitive celler. Når det gjelder dynamisk avsender-mottaker analysen hakk signalnettverk, kunne vi gjøre daglig celle passasjer under rommet lysene, fordi våre systemer (Foto-induserbart dLuc eller Dll1 cellene og mottaker) ikke endre celle spredning og raskt gå tilbake til hvile USA innen seks timer etter at cellene er flyttet til en mørk tilstand. Hvis gener rundt skjebne fastsettelse faktorer, lekk uttrykk kan indusere differensiering eller hindre utvidelser av celler, og derfor er det viktig å konfigurere en røde lys miljø å unngå uønskede optogenetic forstyrrelsene under cellen håndtering.
I denne protokollen presenterte vi fremgangsmåtene for å generere stabil linjer med foto-induserbart gene expression kassetter. Dette er et viktig skritt for å få pålitelige resultater i dynamiske avsender-mottaker analysen. Man kan vurdere forbigående transfection for innføring av optogenetic moduler i celler, men det fungerer ikke bra i våre hender for kvantitative mål ultradian pulser. Vi fant at forbigående transfection av plasmider bærer UAS-arrangøren kassetter fører til lekk uttrykk på relativt høyt nivå selv under en mørk tilstand. Lekk uttrykket forårsaker høy bakgrunn uten noen lys stimulering og hemmer en pålitelig måling av tid-kurs. En alternativ metode å etablere stabil celler er et lentivirus system, som er nyttig for celletyper som ikke egner seg for hva12. Klonal cellelinjer presentere mer homogen svar enn heterogene cellelinjer, men selv i en klonal befolkning, celle svar er ikke alltid ensartet: noen celler ikke svarer til lys stimulering og derfor presentere en distribuert nivåer av lys-indusert protein uttrykk. Dette kan skyldes variabel uttrykk nivåer av hGAVPO protein og/eller variabel endogene overflod av flavin, en chromophore kreves for lys fra omgivelsene av hGAVPO.
Protokollen presenteres her gir et kraftig verktøy for analyse av gene expression dynamics, men det er noen begrensninger. En ulempe er at noen fluorescens kanaler for live-celle mikroskopi ikke er kompatible med blå lys stimulering. Blått lys belysning aktiverer ikke bare den blå-lys-sensitive proteiner, men også fluorescerende proteiner, inkludert grønn og gul fluorescerende proteiner (GFPs og YFPs), som Foto-bleking. Tvert imot, krever visualisering av GFP blått lys magnetisering som kan utløse uønskede aktivering av foto-sensitive celler under fange fluorescerende bilder. Bright-feltet (kontrast) imaging av omgivelseslyset kilden er også kompatibel med blå lys optogenetic eksperimenter, men en kan omgå dette problemet ved å bruke grønn eller lengre bølgelengde lyskilder for avbilding.
Dynamisk avsender-mottaker analysen vil være nyttig for å undersøke andre signalveier. En mulighet er en søknad til sekresjon signalering systemer. For Slike analyser er bruke renset ligander i mikro-fluidic enheter en alternativ måte å stimulere mottaker celler i en presis timelige måte16,17. De nærmer seg er imidlertid utilgjengelig for dynamisk produksjonsprosesser ligand molekyler i avsenderen celler. Ansette dynamiske avsender-mottaker analysen med foto-induserbart ligand uttrykk ville tillate ytterligere Disseksjon av signaloverføring fra sender til mottaker celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av JST, PRESTO (A.I.), Core forskning for Evolutional vitenskap og teknologi (JPMJCR12W2 (RK)), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) og 16 H 06480 (RK)), vitenskapelig forskning (A) (Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) 24240049 (RK)), og unge forskere (A) (Javaserver 15t 05326 (A.I.)), og en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder "fluorescens Live bildebehandling"MEXT, Japan og plattform for dynamiske tilnærminger til levende System fra MEXT, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
