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利用18F-FDG PET/CT成像与定量组织学方法测量肺癌小鼠模型中葡萄糖代谢的动态变化

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DOI：

10.3791/57167

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2018年7月21日

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine, 2University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles, 4Andor Technology, 5Division of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles David Geffen School of Medicine

通讯作者： David B. Shackelford <DShackelford@mednet.ucla.edu>

本文内容

摘要

在本方案中，我们描述了如何利用[18F]-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖正电子发射断层扫描与计算机断层扫描（18F-FDG PET/CT）成像来测量肿瘤对靶向治疗MLN0128的代谢反应 Kras/Lkb1 肺癌突变小鼠模型及高分辨率成像联用 离体 放射自显影与定量组织学

摘要

晚期肿瘤的一个显著特征是向有氧糖酵解的转变，这一过程可通过[18F]-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（18F-FDG PET）成像。共突变 KRAS 原癌基因和 LKB1 肿瘤抑制基因的失活是肺癌中常见的事件，可驱动高代谢、糖酵解型的肿瘤生长。调控此类肿瘤生长与代谢的关键通路是雷帕霉素机械靶点（mTOR）通路，该通路可通过选择性催化型mTOR激酶抑制剂有效靶向。mTOR抑制剂MLN0128可抑制携带Kras与Lkb1共突变肿瘤的小鼠（称为KL小鼠）中的糖酵解。KL小鼠对治疗的反应首先通过 18F-FDG PET 及计算机断层扫描（CT）成像在给予 MLN0128 前后的应用。通过利用 18F-FDG PET/CT，研究人员能够在肺癌的基因工程小鼠模型（GEMMs）中，通过靶向治疗干预后，测量葡萄糖代谢的动态变化。随后是 离体 放射自显影及使用形态计量软件的定量免疫组织化学（qIHC）分析。qIHC的应用能够检测并量化治疗后生物标志物谱的显著变化，同时可表征不同的肿瘤病理特征。将正电子发射断层扫描（PET）成像与定量组织学相结合，是识别代谢反应和治疗反应的有效策略 体内 在疾病的小鼠模型中。

引言

我们的研究一直致力于探索并靶向具有肝激酶B1（Liver kinase B1，LKB1，亦称为STK11）突变的癌症1。LKB1是一种关键的肿瘤抑制因子，它通过激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）来抑制mTOR复合物1（mTORC1），从而调控细胞生长与代谢。因此，LKB1的缺失会导致mTORC1的异常激活，并进一步激活HIF1-α，引发一种以糖酵解为主的代谢表型，通常被称为瓦伯格效应（Warburg Effect）2,3,4。LKB1失活突变可直接导致一种罕见的家族性癌症易感综合征——佩茨-耶格综合征（Peutz-Jeghers Syndrome, PJS）的发生，其特征是出现称为错构瘤的良性胃肠道息肉5,6,7。此外，LKB1常与致癌性KRAS发生共突变，从而导致高代谢性且侵袭性强的人肺部肿瘤8,9。

Lkb1相关疾病在小鼠中易于建模。在小鼠中对Lkb1进行杂合失活可导致错构瘤的形成，准确模拟了佩吉特-杰格斯综合征（PJS）10,11,12,13。此外，在小鼠中易于建模的Lkb1突变能够准确重现肺、皮肤、胰腺和乳腺的癌症表型14。在转基因小鼠的肺组织中，通过Cre重组酶介导的致癌性KrasG12D等位基因激活以及Lkb1的双等位基因缺失，实现Kras/Lkb1共突变，可导致侵袭性强且具有转移性的肺肿瘤形成15,16。对从小鼠中分离出的KrasG12D;Lkb1-/-（KL）肺肿瘤进行表征显示，这些肿瘤表现出高水平的mTORC1激活，并具有强烈的糖酵解活性，这一结论可通过直接测定葡萄糖和乳酸的代谢物水平，或通过正电子发射断层扫描（PET）联合计算机断层扫描（CT）检测[18F]-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖（18F-FDG）的摄取来证实17。LKB1突变肿瘤中mTORC1的过度激活为测试mTOR的变构抑制剂和催化性激酶抑制剂用于治疗此类癌症提供了明确的理论依据。

在之前的一项研究中，我们证实了变构mTORC1抑制剂雷帕霉素（RAPA）能够有效抑制胃肠道（GI）肿瘤的生长及其糖酵解活性，采用一种 Lkb1+/- PJS 转基因小鼠模型3雷帕霉素（RAPA）目前已被批准作为单药疗法用于治疗肾细胞癌，但在非小细胞肺癌（NSCLC）中疗效有限18,19,20雷帕霉素（RAPA）是一种变构型mTORC1抑制剂，其作用效果可能通过开发下一代mTOR催化性激酶抑制剂得到提升，后者可实现对mTOR复合物1和2（分别为mTORC1和mTORC2）更接近完全的抑制21目前，MLN0128等药物正在接受临床前研究和早期临床试验的评估。22,23我们实验室最近的一项研究表明，MLN0128 在人肺癌细胞系中是一种强效的 mTOR 抑制剂 体内 在肺癌的KL GEMMs中15,16MLN0128 抑制了这些小鼠的肺肿瘤生长和葡萄糖代谢24.

本研究利用了特征明确的腺病毒Cre诱导型肺癌小鼠模型，该模型由条件性激活的Lox-Stop-Lox-KRASG12D癌基因启动15,25。将KrasG12D小鼠与Lkb1基因floxed等位基因（Lkb1L/L）小鼠杂交，以生成KrasG12D; Lkb1L/L（KL）小鼠16。在通过鼻内递送表达Cre重组酶的腺病毒或慢病毒后，KL小鼠在肿瘤诱导后4周即可出现早期病变。至第6周时，KL小鼠的肿瘤由腺瘤性肿瘤转变为更具恶性、侵袭性的肺癌癌变表型；至第8至10周，小鼠发展为完全的癌变，外显率为100%16,26。

PET/CT 成像和定量免疫组织化学均可用于评估靶向治疗（如 MLN0128）给药后肿瘤的分子与代谢反应以及治疗反应17,26,27。本文所述实验方案采用18F-FDG PET 成像来测量对 MLN0128 靶向治疗的代谢反应。将 PET 成像与定量组织学相结合，可实现对 mTOR 抑制的分子反应、肿瘤负荷及肿瘤组织学特征的量化分析。

方案

本方案中所述所有操作均已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 小鼠的18F-FDG PET 与 CT 成像

警告：操作放射性物质时应使用防护设备。操作放射性物质时须遵守所有适用的监管程序。

  1. 将待成像小鼠所在的笼子置于37 °C的加热垫上，提前1小时预热 18F-FDG 注射以减少棕色脂肪消耗 18F-FDG
    注意：将小鼠禁食 4 - 16 小时有助于减少心肌对能量物质的消耗 18F-FDG
  2. 称量小鼠并记录其体重。
  3. 使用浓度为2-3%的异氟烷与氧气（流速0.5-2 L/min）在37°C的麻醉舱内对小鼠进行麻醉，持续2-3分钟。通过轻捏小鼠脚趾检查其是否已进入麻醉状态；若无反应，则表明小鼠已成功麻醉。在小鼠眼部涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
  4. 稀释 18F-FDG（放射性半衰期109分钟）溶于无菌生理盐水中，经衰变校正后调整注射浓度为70 - 75 µCi/100 µL。
    注意：遵循 PET 扫描仪制造商推荐的 18F剂量以获得最佳扫描成像效果。
  5. 用带有28 G针头的胰岛素注射器抽取70 - 75 µCi，使用剂量校准仪测量放射性活度，并记录测量值及时间。将注射器置于铅制注射器屏蔽容器中。
    注意：试剂的用量 18使用活度计测量每剂F-FDG的放射性活度，活度计需根据制造商的方案，利用标准参考物质（如铯-137）进行校准。同时记录测量时间，以进行衰变校正。
  6. 用血糖仪针刺小鼠尾尖采血，测定小鼠血糖水平。
  7. 用温水浸湿的纱布温暖尾部 1 - 2 分钟。注射前用 70% 异丙醇擦拭尾部，以扩张尾静脉。注射 100 µL 的 18F-FDG（注射器中的全部体积）通过团注方式注射 通过 侧尾静脉注射并记录注射时间。使用剂量校准仪测量注射器中剩余的剂量，并记录测量值和时间。
    注意：注射器中会残留一定量的探针。建议使用胰岛素注射器，而非带针头连接的注射器。 通过 由于注射后滞留在注射器/针头内的剂量减少，导致鲁尔锁紧。
  8. 将注射后的小鼠放入麻醉舱中，在37 °C条件下持续给予1.5–2%异氟烷，以促进探针的分布 通过 在进行PET扫描前1小时，使小鼠全身循环。
    注意：扫描前排空膀胱可能有助于更顺利地进行扫描 18小鼠下 flank 部位移植肿瘤的 18F-FDG PET 显像。
  9. 1小时后，将小鼠置于成像室中，通过鼻罩给予异氟烷麻醉，并保持体温为37 °C，用医用胶带将其四肢固定于仰卧位置。
  10. 将成像室放入PET/CT扫描仪中。
  11. 按照 PET/CT 扫描仪使用手册中所述的方法获取 PET 和 CT 扫描图像28.
    注意：PET图像的采集时间为600秒，能量窗设置为150–650 keV，采用最大似然期望最大化法进行重建，并对光子衰减、探测器归一化和放射性核素衰变进行校正（未应用散射校正）。CT图像使用50 kVp、200 µA的X射线源和平板探测器，以连续模式采集50秒，并采用Feldkamp算法进行重建。
  12. PET/CT 扫描完成后，将小鼠从成像舱中取出，并放回笼中使其恢复。监测小鼠状态，直至其完全恢复意识并能维持胸卧位。
  13. 将重建的PET/CT图像通过点击导入AMIDE软件 文件，然后 开放，并选择适当的文件。
  14. 将PET数据转换为每克组织占注射剂量百分比（%ID/g）单位，需输入注射时的剂量（扣除注射器中残留剂量后的净注射剂量）；若转换为标准化摄取值（SUV）单位，还需额外输入受试者的体重。操作方法为：右键点击PET数据集，并在弹出界面中找到%ID/g字段 基本信息 输入之前记录的 %ID/g。
  15. 在肿瘤和正常组织（肝脏、肌肉、肺、心脏、脑和皮下脂肪）上绘制感兴趣区域（ROIs）。操作方法为单击 编辑，选择 添加 ROI，选择 ROI 形状 并为该ROI命名。在肿瘤和组织上绘制ROI，并调整其尺寸，以覆盖所有三个轴向上感兴趣区域的组织。
    注意：为了校正动物间PET探针生物分布的差异，可将肿瘤感兴趣区域（ROI）的数值进一步归一化为肝脏ROI的数值。肝脏是一个灌注良好且糖酵解活性极低的器官，常作为参考区域 18循环中的F-FDG。在同一小鼠上对肿瘤和正常组织进行感兴趣区域（ROI）分析。肺部肿瘤病灶通常通过以下方式识别： 18F-FDG PET 因其 18正常肺组织对F-FDG的摄取相对较低。CT还可用于识别病灶，特别是那些 18F-FDG 不摄取。一种 离体 对离体肺的分析也有助于定位肿瘤病灶。

2. 18F-FDG 自动放射自显影

  1. 准备小鼠以进行成像 18F-FDG，步骤如下1.1 - 1.12，但此时，稀释 18无菌生理盐水中的F-FDG，经校正衰减后注射浓度为1,000 µCi/200 µL。
    注意：更高剂量的 18F-FDG 用于放射自显影，以考虑额外的样品处理时间，并通过磷屏实现最佳检测。
  2. 处死小鼠 通过 5% 异氟烷吸入致死或一氧化碳致死2 （一项经IACUC批准的程序）。
    注意：不应采用颈椎脱位法，因其可能损伤肺组织。
  3. 将小鼠腹面朝上固定，并用70%乙醇喷洒以压平毛发，为切口做准备。
  4. 沿中线切开胸腔，剪除膈肌并移除胸壁。小心剥离唾液腺以暴露气管。将动脉夹尽可能靠近下颌夹住气管，确保其紧密固定于气管上。将连接3 mL注射器的23 G针头插入动脉夹下方的气管内，注入约2 mL OCT:PBS（1:1）（最佳切割温度包埋剂:磷酸盐缓冲液）溶液。
    注意：OCT 包埋剂黏性很高，需与 PBS 混合以利于更顺畅地注入肺组织。
  5. 从气管中取出针头，并用镊子夹住注射部位，以防止OCT:PBS溶液泄漏。
  6. 小心地将肺脏从胸腔中取出，并将左肺叶与其他肺叶分离。将左肺叶置于已标记并盛有数滴OCT的冷冻模具中。待肺叶放入模具后，用OCT充满模具至顶部。
  7. 对右半肺重复相同的步骤。
    注意：如果 18预计心脏中的 F-FDG 信号会较高，或者如果肺部肿瘤靠近心脏，则去除心脏可能有助于防止任何示踪剂渗漏。 alternatively，可将整个肺组织包埋于单个低温包埋模具中。使用 OCT 时应避免产生气泡。
  8. 使用长镊子将制备好的冷冻模具放入装有干冰和异戊烷混合物的闭孔挤塑聚苯乙烯泡沫容器中。
    注意：在将冷冻模具放入该混合物中进行冷冻前，混合物温度应约为 -70 °C。OCT 包埋剂凝固后会变为白色。若同时处理多个样本，包埋于 OCT 冷冻模具中的样本可暂时保存在干冰中。
  9. 从冷冻模具中取出冷冻组织块，固定于冷冻切片机上进行切片。使用微切刀片（34°/80 mm，高轮廓）将组织块切成4 µm厚度的切片。将组织切片转移至室温下保存的玻璃载片上。
  10. 将样本载玻片放置于磷屏成像板上，将成像板放入暗盒中并轻轻合紧，防止载玻片发生移位。将暗盒置于 -20 °C 冰箱中进行成像板曝光，通常过夜保存。
    注意：使用前需将培养板和盒预冷至 -20 °C。将样品置于 -80 °C 也可接受。
  11. 曝光后，从培养板中取出载玻片，并在图像读取仪上读取结果。
  12. 载玻片可用塑料薄膜包裹后于 -80 °C 保存，或进行苏木精染色前处理 & 伊红染色或免疫组织化学。

3. 用于组织学的肺组织收获

  1. 按照步骤 2.2 - 2.4 操作，但此时不再使用 OCT:PBS 溶液，而是注入 2 - 3 mL 的 10% 正常缓冲福尔马林溶液以固定肺组织。
  2. 从气管中取出针头，并用镊子夹住注射部位以防止福尔马林泄漏。小心地将肺组织从胸腔中取出，并放入含有约 20 mL 10% 正常缓冲福尔马林的 50 mL 锥形管中，固定 16 - 24 小时，以确保完全固定。
    注意：固定肺组织有助于保存最佳的解剖学特征。
  3. 次日，将固定好的肺组织从福尔马林转移至 70% 乙醇中，并准备将其放入组织包埋盒中。
  4. 使用剪刀沿 5 个肺叶之间的分支部位小心分离肺叶，肺叶编号为 1 - 5，如图 1D所示，将各肺叶按不重叠的方向放置于组织包埋盒中。轻轻在肺组织上放置一块泡沫垫，以保持其方向不变。
  5. 将分离好的肺叶保存在 70% 乙醇中，直至进行石蜡包埋。
  6. 按照标准操作程序将组织包埋盒中的组织进行石蜡包埋，并切取 4 µm 厚的切片用于染色。

4. 使用商业软件进行组织分割与定量分析

  1. 图像苏木精和伊红（H&E）&E) 使用商用多光谱成像系统以1.25倍放大倍率对染色的肺组织切片进行成像。
  2. 将图像转换为数字图像立方体并加载（点击 文件，然后在 载入光谱库预构建的H光谱库&E
    注意：光谱库是通过获取单染肺组织切片的光谱图像预先建立的，其中一张切片仅用伊红染色，另一张仅用苏木精染色，这些图像被保存为开源专有光谱库文件（.csl）。成像系统配备的操作软件可根据采集协议定义的所需波长逐个采集相应图像。这些图像（即 "图像立方体"）以开源专有的多光谱文件格式（.im3）存储。使用形态学软件从图像立方体中提取光谱，并将其存储于独立的光谱库文件中。
  3. 光谱解混伪彩色 H&E 通过点击获取整个肺部的图像 解混 按钮。
    注意：解混时间少于1秒。使用形态计量图像分析软件对每种组织类型中的像素数量进行定量。
  4. 通过将多光谱数据与人眼对波长依赖的颜色响应进行卷积，并结合每幅图像的强度，将其转换为等效的三色（红、绿、蓝）图像，以可视化每个图像立方体。
    注意：生成的3幅图像以标准24位彩色图像形式显示。
  5. 使用用户选择的颜色对每个解混图像进行伪彩色处理例如红色、绿色、紫色 等。并将该图像与其他伪彩解混图像合并，生成一幅标准的24位彩色图像。
  6. 所有分析均使用默认设置。
    注意：通常情况下，由于此类分割依赖于对结果的视觉评估（即，即评估训练集之外图像分割效果的好坏），合理地将图像划分为训练集、测试集和验证集至关重要。
  7. 从2-3张图像开始作为训练集（对于人体活检样本为10-15张），在这些图像上进行训练，直至结果良好，然后将该算法应用于另外2-3张图像。随后，将得到的算法应用于完整的验证集。
    注意：很可能需要进行一些重新训练。
  8. 通过计算每只小鼠1-5叶肺叶中红色伪彩色肿瘤的总像素数，分析全肺切片中的肿瘤区域。
    注意：正常组织以绿色伪彩显示，血液/血管以粉色伪彩显示，如下图所示 图3通过测量每只小鼠的总像素数，计算各治疗组的平均肿瘤负荷。

结果

18F-FDG PET 成像在 KL 小鼠上进行，结果显示这些小鼠的肿瘤具有高度糖酵解活性，表现为 18F-FDG 摄取增加（图 1A），这与先前发表的研究结果一致26,29。对整肺进行切除后，可见多个肿瘤存在（图 1B）。小鼠肺可分为 5 个独立的肺叶，如 图 1C 和 1D 所示。肺叶 1 至 5 在经 H&E 或葡萄糖转运蛋白 1（Glut1）染色的肺组织切片上进行了标注（图 1D）。Glut1 是葡萄糖和 18F-FDG 的主要转运蛋白，其在肿瘤细胞质膜上的表达和定位与 18F-FDG SUV 值直接相关29。对 18F-FDG 高摄取肺肿瘤中 Glut1 染色进行更高分辨率的分析（40X）显示，该转运蛋白在质膜上的表达水平升高且定位明显（图 1D）。

由于PET成像的分辨率有限，因此同时进行了PET/CT和组织自显影。自显影具有更高的分辨率，可能识别出更小的肿瘤和/或肿瘤内18F-FDG分布的异质性。在肿瘤诱导后，对KL小鼠进行了18F-FDG PET/CT成像（图2A），随后对这些小鼠分离的肺组织进行自显影（图2B和2C）。如图2B和2C所示，自显影发现了两个额外的较小肿瘤，这些肿瘤对18F-FDG呈阳性，但在PET图像上不易察觉。在完成自显影后，含有组织的切片还可用于生物标志物的免疫组织化学（IHC）染色。肿瘤的H&E染色证实了左肺叶中存在肿瘤（图2D）。

接下来， 18F-FDG PET 成像在 MLN0128 处理后进行 KrasG12DLkb1-/- 小鼠以用于 18F-FDG 作为肺癌葡萄糖代谢的功能性生物标志物图3）。我们发现，MLN0128 处理显著抑制了 mTORC1 信号通路和糖酵解，表现为降低的 18F-FDG 消耗（图3A 和 3B）。这些结果与本实验室先前发表的在KL小鼠中评估MLN0128的临床前研究结果一致17,27最后，对肿瘤进行了IHC染色（图3C）。肿瘤样本经 H 染色&E 或使用抗磷酸化 S6 抗体进行检测，S6 是 mTORC1 的保守底物，其磷酸化水平可用于指示 mTORC1 的激活状态（P-S6） 与 失活（S6） 图3C 与载体处理组相比，MLN0128在KL肿瘤中显著抑制P-S6，该结果与先前发表的研究一致17除了KRAS之外，表皮生长因子受体（EGFR）等致癌驱动因子也在肺癌中支持糖酵解代谢。因此，我们检测了使用厄洛替尼抑制组成型激活的突变型EGFR是否能够抑制 18小鼠异种移植瘤中F-FDG的代谢 图3D 和 3E 表明携带EGFR del19突变的人肺肿瘤细胞系HCC827表现出显著降低的 18厄洛替尼治疗五天后F-FDG的消耗情况。

最后，对切片的肺组织和肺肿瘤进行形态计量学组织分析，以量化总肿瘤负荷，并区分包括组织亚型、坏死、血管以及正常肺组织和气腔在内的肿瘤病理特征。KL GEMMs 模型发展出一种复杂且病理上异质性的疾病，表现为具有不同组织病理学特征的肺肿瘤。这些肿瘤包括腺癌（ADC）和鳞状细胞癌（SCC）——这种异质性使得该癌症的治疗面临巨大挑战。图4A 显示一个经 H&E 染色的肺叶，其中存在两个较大的肿瘤。在 图4B 中展示的高倍放大图像可识别出正常肺组织、血管和气腔，以及肿瘤坏死区域，同时还包括具有明确乳头状结构的腺癌和鳞状细胞癌。图4C 表示使用 Inform 形态计量软件对肺叶和肿瘤进行伪彩着色。图4D 显示了正常肺组织、血管以及肿瘤坏死等各病理成分的百分比，并将高分化腺癌与鳞状细胞癌等肿瘤亚型进行了有效分割。

PET/CT 与 H&E、Glut1 肺叶分析；横断面、矢状面、冠状面扫描；组织学结果。
图 1：具有代谢活性的 KrasG12D; Lkb1-/-（KL）突变型肺肿瘤对18F-FDG 呈阳性，并高表达葡萄糖转运蛋白 1（Glut1）。 图中A和B展示了部分携带鳞状肺癌的FDG高摄取KL小鼠的18F-FDG-PET与CT分析的最大强度投影图像[也称为三维（3D）图像]。图中显示了（A）3D重建图像以及（B）肺部肿瘤（T）的横断面、矢状面和冠状面视图。（C）本图展示了在图A和B中成像的KL小鼠完整肺组织的组织学切片，分别经H&E染色（上图）或使用特异性抗Glut1抗体染色（下图）。肺叶已编号。比例尺 = 2 mm。（D）本图示为小鼠肺叶的方位与编号（上图），以及图C所示切片中H&E或Glut1染色肿瘤的高分辨率40倍放大图像，分别为H&E染色（中图）或使用特异性抗Glut1抗体染色（下图）。比例尺 = 25 µm。 请点击此处查看本图的高清版本。

PET/CT 扫描与自显影图解；代谢活性；左叶分析；苏木精-伊红染色研究
图2： 18F-FDG 自显影技术可识别具有代谢活性的小肿瘤。 (A）此 18F-FDG PET/CT 图像显示 18KL 小鼠体内 F-FDG 高摄取肿瘤的最大强度投影图像。T1 和 T2 = 肿瘤，H = 心脏，B = 膀胱，K = 肾脏。B此图展示了 离体 对小鼠左右肺叶的连续切片进行放射自显影。左、右图中的肺组织完全相同，左图肺组织以橙色伪彩显示，右图肺组织以黑白显示。肿瘤（T1、T2 和 T3）以箭头标示。C这是放射自显影图像的放大视图，上方为橙色伪彩图像，下方为黑白图像。D) 该图展示了 H&左叶上段切片的E染色结果，如图中所示 B比例尺 = 200 µm 请点击此处以查看此图的放大版本。

癌症治疗影响分析：SUVmax 图表、分子影像、组织学分析、药物疗效。
图3：mTOR 抑制剂 MLN0128 可抑制 KL 小鼠肺癌组织中的葡萄糖摄取，通过 18F-FDG PET 检测得到证实。（A）该图显示了经载体处理（18F-FDG 高摄取，左侧）或 MLN0128 处理（18F-FDG 低摄取，右侧）的 KL 小鼠的代表性 18F-FDG PET/CT 图像。图中展示了横断面（上图）、冠状面（中图）和矢状面（下图）视图。肿瘤区域以红线标出；H = 心脏，L = 肝脏。（B）该图显示了载体处理组与 MLN0128 处理组肿瘤间 SUVmax（%ID/g）的定量比较结果。（C）该图显示了经载体或 MLN0128 处理的 KL 小鼠全肺切片的 H&E 染色及 P-S6 免疫组化染色结果。比例尺 = 25 µm。（D）该图显示了 HCC827 EGFR（del19）异种移植瘤在厄洛替尼治疗前和治疗后的代表性 18F-FDG-PET 与 CT 图像。肿瘤（T）以箭头指示，K = 肾脏，B = 脑。（E）该图显示了 HCC827 异种移植瘤在厄洛替尼治疗前后 SUVmax（%ID/g）的定量分析结果。n = 每组 10 个肿瘤。请点击此处查看该图的高清版本。

肺组织分析；组织学图示，鳞状细胞癌与腺癌的区分；像素数据。
图 4：使用形态测量软件对肿瘤负荷及肿瘤组织学进行量化。
（A）该图显示来自一只 KL 小鼠的一个小鼠肺叶的 H&E 染色图像，其中包含肿瘤组织。（B）这些高分辨率图像分别显示了鳞状细胞癌（左上）、正常肺组织、血管和气腔（右上）、分化良好的乳头状腺癌（左下）以及坏死区域（右下）。（C）该图显示使用形态测量软件对 H&E 染色的肺叶进行伪彩着色的结果。（D）该图显示通过 Inform 软件测定的单个肺叶及肿瘤病理类型的百分比。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本文描述了一种基于成像的实验方法，该方法结合使用18F-FDG PET/CT成像与定量免疫组化（qIHC），以测量mTOR抑制剂MLN0128给药后肺癌肿瘤的代谢和分子反应。MLN0128显著降低了18F-FDG的摄取，表明肿瘤发生了明显的代谢反应。通过将PET/CT成像与免疫组织化学相结合，我们能够将切片后的肿瘤组织与三维PET/CT图像进行空间配准，从而在细胞和分子水平上对整个肿瘤进行详细分析。这使得我们能够证实MLN0128抑制了mTOR信号通路，从而确认该药物在肿瘤中产生了靶向性的分子反应。最后，通过利用定量组织学技术，我们能够绘制并区分不同的肿瘤病理特征，例如将总体肿瘤质量与肿瘤坏死区分开来，鉴别腺癌与鳞状细胞癌，并对microPET成像结果进行补充。

目前，MicroPET 受限于约 1 mm 的空间分辨率。此外，某些组织中 18F-FDG 的滞留可能受到多种因素影响，包括血浆葡萄糖水平、麻醉剂的类型和暴露时间、环境温度以及动物的整体健康状况，这些因素可能影响 18F-FDG 的药代动力学30。这些参数已针对本实验方案进行了优化，但应根据不同动物模型进行相应优化。关于小鼠皮下肿瘤 18F-FDG 成像的可重复性研究表明，平均 %ID/g 的变异系数约为 15%，提示通过 18F-FDG PET 评估单只小鼠的肿瘤治疗反应时，其变化应超过此阈值，方可被视为可靠且具有显著性31。

可通过组织放射自显影评估PET示踪剂的细胞乃至亚细胞分布，随后对切片进行染色，并与定量免疫组化（qIHC）共定位。将PET与CT图像配准，可使PET图像获得解剖学背景信息；即使CT软组织对比度较低，此方法仍极具价值。CT软组织对比度不足的问题可通过磁共振成像（MRI）克服。此外，荧光成像的生物标志物可用于评估糖酵解。 体内，但肺腔内的光子吸收和散射可能影响准确定量或检测灵敏度32总之，利用全动物PET/CT成像结合定量组织学可准确、实时地呈现肿瘤生物学在治疗干预后的变化图谱。

多光谱成像（MSI）适用于任何可以使用彩色图像的场景。最基本的情况下，MSI 提供的信息与彩色图像相同，而在某些应用中，MSI 能够比简单的宽带三色（RGB）图像提供关于样本光谱特性的更详细信息。通常情况下，MSI 的局限性与彩色成像相同，但 MSI 成像速度较慢，获取图像所需时间更长。形态计量软件用于获得可重复且准确的图像分割结果，相关软件见于材料表。此外，还有其他一些市售产品可用于组织分割及组织学定量分析。

癌症代谢的复杂性远不止于瓦伯格效应和葡萄糖代谢33,34。肿瘤极有可能迅速适应仅抑制糖酵解的单药治疗。氨基酸代谢在癌症中的重要性已有充分文献记载，预计肿瘤会依赖多种氨基酸（如谷氨酰胺、甘氨酸和丝氨酸）以及其他代谢物（如游离脂肪酸）35,36,37。除了18F-FDG外，诸如18F-和11C-标记的谷氨酰胺、胆碱、乙酸盐、1-(2'-脱氧-2'-氟阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶（FAC）以及氟代胸苷（FLT）等探针，已成功用于在癌症动物模型中成像氨基酸、核苷酸和脂质代谢过程38,39,40,41。自动化和微尺度示踪剂放射化学技术，结合更高分辨率和更高灵敏度的PET扫描仪，将提升PET在测量多种生物学过程中的可及性42,43。随着对代谢机制的理解不断深入，PET放射性示踪剂的种类也必将随之增加，使研究人员和临床医生能够无创地描绘肿瘤的代谢特征。

采用PET/CT成像与定量组织学技术，满足了将实验室研究成果快速转化为临床应用这一重要的临床需求。为实现这一目标，研究人员必须能够准确测量治疗反应以及药物产生的耐药性，而PET/CT成像技术正可实现这一功能。此外，肺部肿瘤的PET/CT成像与免疫组织化学分析目前已被用作患者的临床标准诊疗手段，因而可直接应用于临床实践。尤为重要的是，PET/CT成像能够快速识别出对治疗耐药的肿瘤，研究人员可分离这些肿瘤并在分子水平上对其进行深入分析，从而更深入地理解疾病的发生机制。这一迭代过程使得人们能够更清晰地认识耐药机制，并设计出更有效的治疗策略，以推动其向临床转化。

披露

Kevin P. Francis 是 Perkin Elmer 的员工。James Mansfield 持有在纳斯达克上市的 PerkinElmer, Inc（PKI）股票。作者没有其他需要披露的内容。

致谢

感谢加州大学洛杉矶分校Crump临床前影像技术中心在小鼠PET/CT成像方面提供的帮助，感谢加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院转化病理学核心实验室和统计核心在肿瘤样本制备与分析方面的支持。本研究经费来源如下：David B. Shackelford获得加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院临床与转化科学研究所（CTSI）KL2转化科学奖项目资助（项目编号KL2TR000122和UL1TR000124），以及美国国防部肺癌研究计划转化研究合作项目（W81XWH-13-1-0459）和美国癌症协会研究学者奖（ACS RSG-16-234-01-TBG）的资助。Sean T. Bailey获得美国国立卫生研究院（NIH）T32培训项目（项目编号HL072752）通过加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院提供的资助。Anthony Jones获得加州大学洛杉矶分校肿瘤细胞生物学培训项目（美国卫生与公共服务部Ruth L. Kirschstein机构国家研究服务奖# T32 CA009056）的资助。Gihad Abdelhady获得美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）多样性补充项目R01CA208642的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
G8 PET/CTPerkin ElmerCLS139564用于小鼠18F-FDG PET与CT成像
Axio Imager.M2Zeiss490020-0003-000获取FFPE肺肿瘤切片图像
Inform软件Perkin ElmerCLS135781用于肿瘤病理图像分析的形态计量学工具
Glut1抗体Alpha DiagnosticsGT12-AFFPE肺肿瘤切片的免疫组化染色
磷酸化-S6核糖体蛋白（Ser235/236）(D57.2.2E) XP™ 兔单克隆抗体Cell Signaling Technologies4858FFPE肺肿瘤切片的免疫组化染色
MX35 Premier切片机刀片 Thermo Fisher Scientific3051835用于组织切片以进行自体放射显影的切片机刀片

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KRAS LKB1 mTOR MLN0128 1
利用18F-FDG PET/CT成像与定量组织学方法测量肺癌小鼠模型中葡萄糖代谢的动态变化
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