Summary
Combinazioni di farmaci sinergici sono difficile e richiede molto tempo per identificare empiricamente. Qui, descriviamo un metodo per identificare e convalidare sinergiche piccole molecole.
Abstract
Anche se farmaci antimicrobici hanno aumentato drammaticamente la durata e la qualità della vita nel 20° secolo, la resistenza antimicrobica minaccia la capacità di tutta la nostra società di trattare infezioni sistemiche. Negli Stati Uniti da solo, infezioni resistenti agli antibiotici uccidono circa 23.000 persone un anno e il costo circa 20 miliardi USD nel settore sanitario aggiuntiva. Un approccio per combattere la resistenza antimicrobica è terapia di combinazione, che è particolarmente utile nella critica fase iniziale dell'infezione, prima che l'organismo d'infezione e del relativo profilo di resistenza di droga sono stati identificati. Molti trattamenti antimicrobici utilizzano terapie di combinazione. Tuttavia, la maggior parte di queste combinazioni sono additivo, che significa che l'efficacia combinata è lo stesso come la somma dell'efficacia antibiotica individuo. Alcune terapie di combinazione sono sinergiche: l'efficacia combinata è molto maggiore di additivo. Combinazioni sinergiche sono particolarmente utili perché possono inibire la crescita di ceppi resistenti ai farmaci antimicrobici. Tuttavia, queste combinazioni sono rari e difficili da identificare. Ciò è dovuto il numero di molecole necessarie per essere testato in modo pairwise: una libreria di 1.000 molecole ha 1 milione di combinazioni possibili. Così, sono compiuti sforzi per predire le molecole per sinergia. Questo articolo viene descritto il nostro metodo di alto-rendimento per pronosticare coppie sinergica piccola molecola conosciute come la sovrapposizione2 metodo (O2M). O2M utilizza modelli di set di dati chimico-genetica per identificare i mutanti che sono ipersensibili ad ogni molecola in una coppia sinergica ma non ad altre molecole. Il laboratorio marrone sfrutta questa differenza di crescita eseguendo uno schermo ad alta produttività per molecole che inibiscono la crescita di mutante ma non selvaggio-tipo celle. Lavoro del laboratorio precedentemente identificate molecole che agendo in sinergia con l'antibiotico trimetoprim e il fluconazolo antimicotico usando questa strategia. Qui, gli autori presentano un metodo per schermo per nuove combinazioni sinergiche, che può essere modificato per molteplici microrganismi.
Introduction
Batteri resistenti agli antibiotici causano infezioni più di 2 milioni e 23.000 morti ogni anno negli Stati Uniti secondo il CDC1. Nuovi trattamenti sono necessari per superare queste infezioni. Le strategie per identificare questi nuovi trattamenti includono lo sviluppo di nuovi farmaci antimicrobici o il riuso di piccole molecole approvate per le altre condizioni per il trattamento di infezioni microbiche2,3,4. Tuttavia, la nuova scoperta della droga è molto costoso e richiede tempo. Repurposing farmaci potrebbe non identificare nuovi farmaci o obiettivi della droga di5,6. Il nostro laboratorio si concentra su una terza strategia conosciuta come terapie di combinazione sinergica. Combinazioni sinergiche si verificano quando due piccole molecole insieme hanno un'efficacia maggiore l'effetto additivo di loro efficacies individuale7. Inoltre, combinazioni sinergiche possono essere efficace contro un agente patogeno resistente a una delle piccole molecole nella coppia oltre ad avere meno effetti indesiderati fuori bersaglio, rendendoli grande potenziale8,9, 10.
Coppie sinergiche sono rare, che si verificano in circa 4-10% di droga combinazioni11,12,13. Così, tecniche tradizionali come schermi pairwise sono difficile e faticosa, con migliaia di combinazioni possibili da una piccola biblioteca di un centinaio di molecole. Inoltre, interazioni sinergiche solitamente non possono essere previsto dall'attività dei composti14. Tuttavia, gli autori hanno sviluppato un approccio di alto-rendimento alla schermata per coppie sinergiche, chiamato sovrapposizione2 Method (O2M)12. Questo metodo, descritto qui, consente per l'identificazione più veloce, più efficiente di questi accoppiamenti sinergici. O2M richiede l'utilizzo di una coppia di sinergica nota e un set di dati di chimica-genetica. Chimica-genetica DataSet vengono generati quando una libreria di mutanti knockout è coltivata in presenza di molte piccole molecole diverse. Se una molecola in una coppia di sinergica nota induce lo stesso fenotipo da un mutante di knockout particolare come la seconda molecola sinergica, qualsiasi altra piccola molecola che suscita il fenotipo da quello stesso mutante dovrebbe anche potenziare con ogni membro del conosciuto coppia sinergica. Questa logica è stata utilizzata nel laboratorio di marrone per identificare sinergiche coppie antibiotiche attive contro Escherichia coli (Escherichia coli) e sinergica farmaco antifungino attivo contro il fungo patogeno Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M non solo è adattabile per vari agenti patogeni, ma per lo screening di grandi librerie di molecole permette di identificare le coppie di sinergiche facilmente e rapidamente. Lo screening con il mutante genetico identificato da O2M permette di convalidare solo quelle piccole molecole preveduti per sinergia. Così, una libreria di 2.000-molecola per i test pairwise Occorrerebbero mesi, considerando che se c'erano solo 20 molecole in quanto Biblioteca preveduta a sinergizzare, test per sinergia ora prende una questione di giorni. O2M non richiede competenze di programmazione, e l'attrezzatura necessaria è disponibile nella maggior parte dei laboratori o strutture di nucleo. Oltre ai ricercatori interessati a combinazioni di farmaci, analisi O2M sono di interesse a chiunque che ha completato un test antidroga e vuole espandere i loro successi identificando le interazioni farmaco-farmaco importante. Di seguito è riportato il protocollo per l'identificazione di molecole piccole sinergiche nei batteri, nonché di convalidare il predetto interazioni sinergiche in dosaggi ben noto15,16.
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Protocol
1. identificazione di mutanti di pronostico sinergia da chimica-genetica Dataset con il metodo2 di sovrapposizione (O2M)
Nota: Questo è il metodo per l'identificazione di mutanti di pronostico sinergia utilizzando il dataset pubblicato da Nichols et al. 17 in e. coli. Tuttavia, questo può essere fatto su qualsiasi sostanza chimica-genetica dataset e microorganismo. Questi set di dati contiene una libreria di mutanti knockout sviluppate in presenza di più di 100 piccole molecole, dando un punteggio di crescita quantitativa per ogni mutante in ogni piccola molecola. Una coppia sinergica deve essere conosciuta, e ci dovrebbe essere spartiti di crescita per entrambe le molecole piccole incluse nel set di dati.
-
Calcolare il Punteggio di crescita media e deviazione standard per tutti i mutanti in presenza di una concentrazione unica di ogni piccola molecola.
Nota: Questo può essere fatto utilizzando qualsiasi software di foglio di calcolo. Il laboratorio marrone usa Excel e le funzioni =AVERAGE(B3:B3981) e =STDEV(B3:B3981) per i calcoli di ogni colonna di piccola molecola.- Calcolare le medie e le deviazioni standard da ogni colonna di piccola molecola, se questo orientamento può variare se si utilizza un set di dati diverso.
- Calcolare i punteggi di Z per ogni concentrazione di piccola molecola utilizzando il dataset stesso da Nichols et al. 17 in un foglio di calcolo. Per questo, i punteggi di z negativo sarà Z(2.5) = dire - 2.5 * deviazione standard e punteggi z positivo sarà Z(2.5) = media + 2.5 * deviazione standard.
- Determinare quale gene mutanti contengono significativi punteggi Z nelle piccole molecole che compongono la coppia sinergica nota, essere sicuri di guardare a tutte le concentrazioni di tali molecole. Se la crescita di Punteggio di un mutante è minore di Z negativo (2,5) Punteggio ottenuto o è superiore al Punteggio di Z (2,5) positivo per quella piccola molecola, è considerato significativo.
- Determinare se uno qualsiasi dei mutanti gene significativi appartengono a un operone.
Nota: Per e. coli, gli autori suggeriscono il controllo "Ecoli wiki" per informazioni per quanto riguarda se i geni sono trascritti come parte di un polycistronic RNA. - Identificare mutanti del gene/operone che sono comuni alla maggior parte di piccole molecole di interesse alle concentrazioni differenti (ad es., quando cerca di identificare molecole che agendo in sinergia con l'antibiotico trimetoprim, mutanti che mostrano un significativo Z Punteggio ottenuto quando coltivate in presenza di trimetoprim e i suoi partner sinergici noti come Sulfametizolo o sulfamethoxazole). Queste sono presunti sinergia Pronostico mutanti.
2. Synergizers all'interno del Dataset di chimica-genetica di O2M di predizione
- Tornando al dataset17, identificare ogni concentrazione di piccola molecola che suscita un punteggio di crescita significativa dal mutante di predizione di sinergia. Questo viene fatto guardando i punteggi Z calcolati per ogni concentrazione di piccole molecole. Ancora una volta, un punteggio di crescita significativa è minore il punteggio Z negativo o superiore al punteggio Z positivo per la concentrazione di piccole molecole.
Nota: Se anche una sola delle sue concentrazioni viene visualizzato una molecola, la molecola è considerata un synergizer previsto. Qualsiasi molecola che non suscitano un punteggio di crescita significativa è un non-synergizer previsto.
3. validazione delle interazioni sinergiche previsti
- Trovare la concentrazione inibitoria minima (MIC) di synergizers previsto.
- Far crescere una cultura durante la notte di e. coli in media minimi M9 a 37 ° C.
Nota: Ogni cultura durante la notte possa essere coltivata in terreno opportunamente definito per l'organismo di interesse. Il laboratorio marrone non consiglia contenuti multimediali come LB o YPD. Media minimi M9 è costituito da 10,5 g/L brodo di M9, acidi casamino 0,2%, 0,1 M CaCl2, 0,4% glucosio, 1m MgSO4, 0,25% di acido nicotinico e tiamina 0,33% in H2O. - Se non ci sono dati MIC per patogeno di interesse nella letteratura dopo aver ricevuto le piccole molecole, sciogliere in dimetilsolfossido (DMSO) ad un'alta concentrazione (> 10 mg/mL).
- Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 100 µ l di M9 media in ciascun pozzetto. Aggiungere un extra 100 µ l di M9 media nella colonna 1 modo contiene un totale di 200 µ l.
- Aggiungere una quantità arbitraria (~ 10 µ l) di soluzione concentrata piccola molecola nella colonna 1. Una piccola molecola per pozzetto della colonna 1 (8 piccole molecole per piastra).
Nota: Queste sono le piccole molecole di interesse, che sono prevedute per sinergizzare. Il lab marrone aggiunge generalmente 10 µ l di soluzione altamente concentrata piccola molecola, che è inferiore all'importo di 100% DMSO che possa inibire Escherichia coli. - Una volta che le piccole molecole sono state aggiunte, diluire le piccole molecole attraverso l'asse x della piastra. Prendere 100 µ l di soluzione dalla colonna 1, inserire nella colonna 2 e mescolare. Prendere 100 µ l dalla colonna 2, posto nella colonna 3 e mescolare. Continuare questo processo fino a 100 µ l sono collocati nella colonna 11. Mescolare colonna 11, quindi prendere 100 µ l di tale colonna e scartare. Lasciare la colonna 12 con pochi mezzi per normalizzare i dati.
- Inoculare la piastra. Ottenere la densità ottica (OD600) da una cultura durante la notte. Preparare una soluzione con la cultura e i media M9 a un OD600 di 0,002 (o concentrazione che rappresenta 500 cellule / µ l per l'organismo desiderato di interesse del caso). Pipettare 2 µ l di soluzione di cultura in tutti i pozzetti della piastra, quindi ci sono 1.000 cellule per pozzetto.
- Agitare la piastra delicatamente e ottenere il OD600 per la h 0 lettura. Lasciare la piastra crescere a 37 ° C per 24 h. Ottieni il OD600 per la 24h di lettura.
Nota: Uso appropriato crescendo condizioni per altri organismi di interesse. - Calcolare la crescita netta per ogni pozzetto usando un foglio di calcolo.
- La netta crescita media del colonna 12 per ottenere la media nessuno sviluppo di droga. Normalizzare l'altri pozzi alla media di nessuna crescita di droga utilizzando un software di foglio di calcolo. Look per qualsiasi bene con meno di 10% di crescita per identificare il MIC90. Qualsiasi bene con meno del 50% la crescita indica la MIC50. Calcolare la concentrazione di piccole molecole in quei pozzetti.
- Far crescere una cultura durante la notte di e. coli in media minimi M9 a 37 ° C.
- Saggi di scacchiera per interazioni sinergiche
- Far crescere una cultura durante la notte di e. coli in media minimi M9 come prima.
Nota: Uso appropriato crescendo condizioni per altri organismi. - Aggiungere 100 µ l di M9 media in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 e un extra 100 µ l nella colonna 1.
- Aggiungere il test piccola molecola (~ 8 x MIC) a ciascun bene in colonna 1 e aggiungere il doppio della concentrazione (~ 16 x MIC) al pozzetto A1 (una piccola molecola testato per piastra).
Nota: Tale importo è determinato dal precedente test completato MIC e differisce per ogni potenziale synergizer. - Creare una sfumatura diluizione sull'asse x prendendo 100 µ l dalla colonna 1 e trasferimento alla colonna 2. Continuare questo processo fino a 100 µ l viene aggiunto alla colonna 11. Mescolare, poi prendere 100 µ l dalla colonna 11 e alienare. Non aggiungere qualsiasi droga a colonna 12 (Figura 1A).
- Impostare la seconda sfumatura di droga attraverso l'asse y per la droga di input. Aggiungere 100 µ l di supporto contenente 2 x MIC della molecola dell'input nella riga r. Mix e diluito come prima, prendendo 100 µ l dalla riga A e l'immissione in B. continuare fino a 100 µ l è disposto in fila G. Mix, prendere 100 µ l e dispose, garantendo non di aggiungere qualsiasi farmaco input nella riga H. In questo modo la riga H e colonna 12 per contenere singoli microfoni della coppia farmaco testata (Figura 1B).
- Inoculare la piastra. Aggiungere 2 µ l di una coltura di Escherichia coli di OD600 0,002 a ciascun pozzetto (1.000 cellule per pozzetto).
- Misurare il OD600 di ciascun pozzetto della piastra per la lettura di 0 h.
- Incubare la piastra per 24 h a 37 ° C.
- Misurare il OD600 di ciascun pozzetto a 24 h.
- Far crescere una cultura durante la notte di e. coli in media minimi M9 come prima.
- Calcolo dell'indice di concentrazione inibitoria frazionario (FICI) da scacchiere
- Calcolare la crescita netta per ciascun pozzetto della piastra sottraendo il OD600 a 0 h dalla OD600 a 24 h in un foglio di calcolo.
- Normalizzare la crescita nel software dividendo ogni pozzetto da altro H12, che non contiene nessuna piccola molecola.
- Trovare il MIC90 della molecola dell'ingresso nella colonna 12 e MIC90 del sinergizzante potenziali nella riga H.
- Cercare tutti i pozzetti che inibiscono il 90% della crescita.
- Calcolare il FICI90 per il bene che è sia il più basso di sotto (sinergico) o più alto sopra (antagonista) entrambi i valori MIC90, usando l'equazione:
- Prendere in considerazione qualsiasi FICI ≤ 0,5 come sinergici e FICI ≥ 4 come antagonista (Figura 2).
Nota: Questo può essere fatto anche con MIC50 (50% di inibizione della crescita) per ottenere un FICI50 basato su questi valori MIC.
- Test di indipendenza di Bliss
Nota: Indipendenza di Bliss è gestito con qualsiasi sinergizzante potenziali che non hanno un microfono sul proprio.- Far crescere una cultura durante la notte di e. coli nei media M9 a 37 ° C, come prima.
Nota: Ancora una volta, adeguate condizioni di crescita per altri organismi di interesse possono essere utilizzate in questo passaggio. - Preparare piastre da 96 pozzetti per testare il potenziale sinergica molecola, la molecola di input, la combinazione e un controllo non trattato.
- Creare la lastra sinergizzante potenziali aggiungendo 50 µ l di M9 media in ciascun pozzetto. Aggiungere 50 µ l di supporto contenente una concentrazione set (10 µM o 100 µM) del sinergizzante potenziali in ciascun pozzetto di una riga. Prova 8 molecole per piastra.
- Creare la piastra di ingresso molecola aggiungendo 50 µ l di media in ciascun pozzetto. Aggiungere 50 µ l contenente 4 x MIC della droga ingresso ad ogni pozzetto nella colonna 1. Creare una diluizione gradiente lungo l'asse x simile a piastre MIC, prendere 50 µ l dalla colonna 1, dispersione e miscelazione nella colonna 2. Continuare questo processo fino a colonna 12, smaltimento 50 µ l dalla colonna 12. Aggiungere un ulteriore 50 µ l di media in ciascun pozzetto, quindi è la fine totale per ciascun pozzetto 100 µ l.
- Creare la combinazione piastra utilizzando una piastra ben 96, aggiungere 50 µ l di media in ciascun pozzetto. Aggiungere 50 µ l contenente 4 x MIC della droga ingresso ad ogni pozzetto nella colonna 1. Diluire lungo l'asse x simile a piastre MIC, prendere 50 µ l dalla colonna 1, dispersione e miscelazione nella colonna 2. Continuate in questo tutta la strada a colonna 12, smaltimento 50 µ l dalla colonna 12. Aggiungere 50 µ l di supporto contenente il sinergizzante potenziali a µM 10 o 100 µM a ciascun pozzetto di una riga. Ancora una volta, ci dovrebbe essere una concentrazione o farmaco per ogni riga.
- Creare il controllo non trattato aggiungendo 100 µ l di M9 media in tutti i pozzetti della piastra.
- Inoculare tutte le piastre aggiungendo 2 µ l di coltura batterica con un OD600 di 0,002 o 1.000 cellule ad ogni pozzetto come prima.
- Misurare il OD600 di ciascun pozzetto a 0 e 24 h.
- Far crescere una cultura durante la notte di e. coli nei media M9 a 37 ° C, come prima.
- Calcolo del Punteggio di indipendenza di Bliss
- Calcolare la crescita netta per ciascun pozzetto della piastra sottraendo il OD600 a 0 h dalla crescita a 24 h utilizzando un programma di foglio di calcolo.
- Normalizzare i pozzi per la crescita media dalla piastra di nessuna droga in un foglio di calcolo.
- Utilizzando software di foglio di calcolo, calcolare l'inibizione sottraendo la crescita netta da 1.
- Media le colonne nella piastra di controllo contenente solo il gradiente input nel software foglio di calcolo.
- Calcolare il Punteggio di beatitudine per ciascun pozzetto dall'equazione:
Bliss il Punteggio = (X ben + colonna di input X) – combinato X bene - Cercare punteggi negativi in pozzi sotto il MIC90 di input.
Nota: I punteggi negativi più concentrazioni indicherebbe un'interazione sinergica.
4. high-throughput schermo con sinergia Pronostico mutanti per identificare le coppie sinergiche novelle
-
Identificare i mutanti di predizione di sinergia
Nota: Passaggio 1.5 identificato mutanti Pronostico putativo sinergia. Qui, siamo di determinare quale di questi mutanti funzioneranno meglio in uno schermo ad alta produttività per farmaci sinergici. Abbiamo effettuato questo test in una macchina di Bioscreen, ma i lettori di micropiastre ben 96 dovrebbero anche essere accettabili.- Crescere ogni presunto sinergia Pronostico mutanti e cellule wild-type in media minimi M9.
- Impostare il 100 alveolare ben piatto (o piatto ben 96) con il mezzo appropriato sviluppo, crescita medio + ingresso droga, crescita medio + partner sinergici noti della droga di input e crescita medio + farmaco noto non sinergica. Garantire per includere comandi del veicolo.
Nota: Si consiglia di che quattro replicare pozzi per ogni ceppo/droga/concentrazione. - Inoculare 1.000 cellule per pozzetto, compreso pozzetti di controllo vuoto.
- 48 ore a 37 ° C, con agitazione, di crescere e leggere OD600 ogni 20 min.
- Determinare il punto di concentrazione e tempo di droga che mostra la più grande differenza di crescita tra wild-type e sinergia Pronostico cellule mutanti in presenza del farmaco di ingresso e i suoi partner sinergici noti. Presso il punto di tempo ottimale e la concentrazione, non dovrebbe esserci molta differenza di crescita tra sinergia e del selvaggio-tipo cellule mutanti Pronostico quando coltivate in presenza di farmaci noti per non agire sinergico con la droga di ingresso (Figura 3).
-
Schermo ad alta produttività per farmaci sinergici
- Crescere cellule wild-type e cellule mutanti di predizione di sinergia in media minimi M9.
Nota: Utilizzare il terreno di coltura appropriato per organismo di interesse. - Aggiungere farmaci dalla libreria media così ogni bene che contiene 100 µ l supporto con piccole molecole a set di concentrazione che è stata determinata nel passaggio precedente. Includono i pozzi in bianco (senza cellule) e con comandi del veicolo (e. g., DMSO) per tenere conto di qualsiasi inibizione della crescita del veicolo di diluizione del farmaco.
- Preparare almeno quattro pozzetti di controllo del veicolo per piastra, idealmente sparsi su tutta la piastra a rappresentare ben posizione effetti. Se i dosaggi sono variabili, quindi includere almeno un controllo del veicolo anche per riga/colonna e utilizzare ogni controllo di riga/colonna, nonché il controllo per calcolare i punteggi di Z per ogni riga/colonna anziché per un'intera piastra (punto 4.2.5).
- Aggiungere 2 µ l di cultura ad ogni pozzetto come prima. (Una piastra per batteri di tipo selvaggio e una piastra per batteri mutanti sinergia predetto).
- Valutare il OD600 a 0 e 18 h per e. coli o 48 h per c. neoformans.
- Utilizzando software di foglio di calcolo, calcolare la crescita netta sottraendo il OD600 pozzi vuoti da pozzetti di controllo del veicolo. Identificare i pozzi con uno Z-score di -2,5 (segno di Z = media - 2,5 * deviazione standard). Questi pozzi contengono una potenziale piccola molecola di sinergizzante.
- Convalidare il risultato a schermo utilizzando i metodi descritti nel passaggio 3.
- Crescere cellule wild-type e cellule mutanti di predizione di sinergia in media minimi M9.
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Representative Results
Le analisi della scacchiera sono un metodo semi-quantitativo per misurare le interazioni sinergiche. Il Punteggio finale di uscita, FICI, determina se una combinazione di farmaci è considerata sinergico (FICI ≤ 0,5), non interagenti (0,5 < FICI < 4), o antagonistici (FICI ≥4.0). La figura 1 illustra come impostare i gradienti di droga in un'analisi della scacchiera. La figura 2 illustra i risultati comuni. Considerare la crescita (viola pozzi) che visualizzano meno di inibizione della crescita del 90%. Dopo aver misurato il OD600 dei pozzetti in una piastra, abbiamo tutto per il controllo della droga non normalizzare bene. Qualsiasi cosa con un valore normalizzato > 0,1 (10% del OD600 del controllo bene) è segnato come "crescita". Gol di FICI può variare a seconda di quale Beh è scelto; Selezioniamo il pozzo che dà la FICI più basso per ogni piatto. In Figura 2A, che sarebbe bene F9 (le colonne sono numerate, le righe con lettere), con un FICI = 0,07. In Figura 2B, il FICI viene calcolato da ben C3 (FICI = 1.0). Per le interazioni antagonistiche, cercare il più alto punteggio di FICI possibile. In Figura 2, la FICI viene calcolato dal pozzetto A1, che danno un FICI di 8.0.
Condizioni ottimali di screening impedirà un elevato numero di falsi positivi dallo schermo, che consente di risparmiare tempo e denaro. Quando abbiamo ottimizzato i mutanti di predizione di sinergia per il fungo Cryptococcus neoformans, abbiamo testato il farmaco input (fluconazolo), quattro droghe conosciute non sinergico (caffeina, Climbazolo, trimetoprim e brefeldina A) e cinque di fluconazolo partner sinergici (rifamicina, myriocin, Nigericina, rapamicina e FK506, tutto discusso nel Cosentino, S. et al. 18). poiché abbiamo scoperto queste molecole attraverso analisi O2M (sezioni 1 e 2), ci aspettavamo il synergizers noto per inibire selettivamente la crescita di cellule mutanti di sinergia pronostico ma non selvaggio-tipo celle. Per massimizzare la differenza di crescita prevista, abbiamo testato un intervallo di concentrazioni per ogni piccola molecola, molte delle quali erano sub.
Risultati di esempio sono mostrati nella Figura 3. Una molecola che non agiscono in sinergia con fluconazole, brefeldina A, crescita inibita del wild-type e sinergia Pronostico le mutante solo leggermente e circa la stessa quantità. Rifamicina (Figura 3B), la crescita del mutante Pronostico sinergia (cnag_03917Δ) è stata inibita, ma non la crescita delle cellule wild type. Le maggiori differenze di crescita erano tra 32 e 49 h post-inoculazione, quindi timepoint per lo screening era in questa gamma. Curve di crescita delle altre molecole sinergiche e non sinergico hanno assomigliato a quelle di rifamicina e brefeldina A, rispettivamente.
Figura 1 : Rappresentazione della scacchiera analisi dal passaggio 3. I gradienti di droga droga e ingresso di prova sono illustrati A e B, rispettivamente. La piastra finale del dosaggio dovrebbe apparire come in C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Grafico dei risultati del dosaggio Checkerboard. Illustrazioni di sinergici, nessuno, e interazioni antagonistiche sono rappresentati in A, B e C, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Dati di esempio per l'identificazione di screening tempo. (A) Wild-type (verde) e sinergia Pronostico mutante (blu) di c. neoformans sviluppate in presenza di un brefeldina A, una piccola molecola noto per non potenziare con fluconazole. Controllo di tipo selvatico (verde scuro) e droga trattata (verde chiaro) hanno una differenza simile in crescita al controllo di sinergia Pronostico mutante (blu scuro) e droga trattata (luce blu). (B) Wild-type e sinergia Pronostico mutante sviluppate in presenza di rifamicina, una piccola molecola noto a sinergizzare con fluconazole. Controllo di tipo selvatico (verde scuro) e droga trattata (verde chiaro) hanno una minore differenza di crescita rispetto al controllo di sinergia Pronostico mutante (blu scuro) e droga trattata (luce blu). La differenza più grande è osservata a 48 h per la molecola sinergica nota e la differenza è simile a quel punto di tempo per la molecola non sinergici nota. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Coppie di sinergica piccola molecola possono essere un potente strumento nel trattamento di infezioni microbiche, ancora non hanno raggiunto il loro potenziale clinico completo perché sinergiche coppie sono difficili da identificare. Questo articolo descrive un metodo per identificare sinergiche coppie molto più veloce di semplici combinazioni di coppie. Utilizzando i set di dati di chimica-genetica, O2M identifica mutanti con KO di gene che quindi può essere utilizzato come una lettura di librerie di grandi dimensioni di schermo di piccole molecole al fine di prevedere le coppie sinergiche. La capacità di predire piccole molecole consente l'elevata scalabilità degli schermi, che a sua volta rende per largescale identificazione di partner sinergici. Dopo aver identificato le coppie sinergiche, uno può delucidare le interazioni sinergiche sottostante meccanismo molecolare, quindi progettare razionalmente ulteriori coppie sinergica11.
O2M richiede un set di dati chimico-genetica e un paio di sinergico noto. Fortunatamente, i set di dati di chimica-genetica sono comuni per una varietà di microbi19,20,21. Il laboratorio marrone precedentemente dimostrato che O2M correttamente può trovare coppie sinergiche in sia c. neoformans ed e. coli11,12. Ciò dimostra che l'ampio impatto O2M ha un metodo scalabile che è ampiamente applicabile a una varietà di organismi. Tutti i passi elencati qui possono essere alterati per la crescita di un microrganismo diverso con risultati relativamente simili, rendendo così O2M uno strumento prezioso per identificazione generale di coppie sinergiche. Parecchi altri gruppi sono identificare combinazioni sinergiche di set di dati chimico-genetica con diversi metodi di analisi, anche se O2M richiede la conoscenza di programmazione almeno di uno di questi metodi. Ogni metodo identifica diversi insiemi di sinergici antibiotici o antimicotici 18,22,23,24, suggerendo che un gran numero di coppie sinergiche rimangono da scoprire. O2M e altri metodi di predizione di sinergia sono anche potenzialmente applicabili ai sistemi di mammiferi, inclusa l'identificazione di combinazioni di farmaci cancro.
In sintesi, questo metodo viene descritto un modo rapido per schermo per coppie sinergici da un dataset di chimica-genetica. Questo metodo e altri aiutare coppie sinergiche diventare un'opzione di trattamento più fattibile in cliniche. Inoltre, metodo veloce e generalizzato di O2M dimostra uno strumento prezioso quando alla ricerca di coppie sinergica piccola molecola.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di avvio dal dipartimento di patologia, Università dello Utah per J.C.S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
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