Summary
形質タンパク質 18 kDa (TSPO) の陽電子放射断層撮影 (PET) 画像処理開発 neuroinflammation の動的役割と脳疾患の進行を可視化する非侵襲的な手段を提供します。このプロトコルでは、虚血性脳卒中のマウスモデルで neuroinflammation を検出する TSPO ペットと体外放射線写真法について説明します。
Abstract
Neuroinflammation は虚血性脳卒中病態カスケードの中心です。非侵襲的分子イメージング法には、ダイナミクスとストロークで特定の neuroimmune の相互作用の役割に重要な洞察を提供する可能性があります。具体的には、形質タンパク質 18 kDa (TSPO) 活性化ミクログリアと周辺の骨髄系細胞のマーカーの陽電子放射断層撮影 (PET) 画像処理は、検出および neuroinflammation in vivoを追跡する手段を提供します。ここ、neuroinflammation を使用して正確に定量化する方法を提案する [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA 713)、有望な第二世代 TSPO ペットルコース、sham 群と比較して遠位の中大脳動脈閉塞 (dMCAO)。MRI は、ストロークを確認し、梗塞場所と容量を定義する実行 2 日ポスト dMCAO 手術でした。ペット/計算断層レントゲン写真撮影 (ct) は、脳卒中 TSPO レベルのピークの増加をキャプチャする 6 日間のポスト dMCAO を行った。PET 画像の定量は、[11C] の摂取量を評価するために実施した脳と炎症の中央および周辺のレベルを評価するために dMCAO と偽のマウス脾臓の DPA 713。生体内で[11C]前のヴィヴォオートラジオグラフィーを使用して DPA 713 脳の吸収が確認されました。
Introduction
ストロークは、5 番目の主要な死因と1アメリカ合衆国における障害の主要な原因です。虚血性脳卒中は、(例えば血栓や脂肪沈着物によって) 脳への血流のローカライズされた中断がある場合に発生するような場合 (~ 87%) の圧倒的多数を表します。被災地へ酸素と栄養の供給がその後減少し、周辺地域だけでなくストローク コア (梗塞) 内で神経細胞死で、その結果複雑な病理学的カスケードが開始されます。この被害、両方の居住者脳免疫細胞 (ミクログリア) に至る経路で重要なコンポーネントであり、末梢の免疫細胞 (好中球、T 細胞、B 細胞、単球/マクロファージ) を浸透させるこれに貢献すると考え Neuroinflammation破壊的なカスケード2,3。活性化ミクログリアと大食細胞が虚血性脳卒中2劇物で有益な効果のレポートでこのアミロイド応答の中心。したがって、これらのセルは、次のストロークの生体内での貢献を評価することが不可欠です。
ペットは生体内で陽電子 (β +) 11C、 13N、などの放射性核種が付いた特定の分子を使用してプロセスは強力な 3 次元分子イメージング手法を生物学の可視化15O と18f.この非侵襲的な方法は、それはそのまま被験者の生活でリアルタイムに分子情報の取得を許可し、縦断的調査を可能にex vivo法 (免疫組織化学など) に比べて多くの利点。いただけた、活性化ミクログリアと周辺の骨髄系細胞のマーカーの PET イメージング定量化し、本体内で、生得の免疫細胞の応答を追跡する手段を提供、脳卒中に対する治療後の炎症を評価するために利用することができます。介入。末梢型ベンゾジアゼピン受容体として以前知られている TSPO ニューロステロイド4の合成とコレステロールの輸送の役割を担うと考えられている 18 kDa 蛋白質であります。また、証拠は、TSPO neuroinflammation とニューロン生存5,6ストローク7を含む炎症を含む多くの神経疾患の発現の増加の報告と関与していることを示唆しています。認知症8、9パーキンソン病、多発性硬化症10。TSPO ミトコンドリア膜の外側にある、周囲、特にステロイド関連組織 (例えば腺) と心臓、腎臓、肺および10で見られる中間のレベルで高度に発現します。しかし健康な脳 TSPO レベルが低いとグリア6,11に主に制限されてです。ストロークで観察するなどの神経細胞傷害時に中枢神経系 (CNS) における TSPO レベルが大幅に増加します。この観測のアップレギュレーションいただけたは、炎症の重症度の正確な指標を提供する式レベルでイメージ neuroinflammation体内に悪用できます。それ故、このメソッドの目的は正確に neuroinflammation TSPO PET を用いた虚血性脳卒中のマウスモデルでの生体内での貢献を定量化するには
複数いただけたトレーサーを開発されている neuroinflammation のペット用。TSPO pet は [11C] DPA 71312を使用して記載されてここでは、有望な第二世代より歴史的に使われる [11C] よりも非特異的結合を上下ノイズ信号を示している TSPO トレーサー PK11195 13.たとえば、ストロークの dMCAO マウス モデルはこの方法14に選ばれました。このモデルには、側頭開頭と体性感覚皮質の局所虚血の結果、遠位の中大脳動脈の永久的な結紮が含まれます。これは、虚血性損傷とこのモデルに関連付けられている低死亡率の高い再現性によりストローク前臨床研究に有益です。これまでいただけた PET イメージング研究を dMCAO 齧歯動物モデルで報告されるようにあります。ただし、以前ペット イメージング中大脳動脈閉塞 (MCAO) モデルを使用して、マウスとラットの両方より厳しいと可変ストローク モデルが報告されて 3 日目から約 7 日後のストローク15、ピークから増加する TSPO 式 16,17,18。したがって、TSPO 発現に合わせてペット 6 日ポスト dMCAO をイメージングを行った。[11C]脳内 DPA 713 吸収 (梗塞) 同側で評価されたと対側半球。TSPO ペットは、梗塞の正確な描写と関心 (ROIs) の反対側の領域を可能にする構造の MRI と結合されました。ここでアトラス ベースと [11C] DPA 713 摂取量を計算する MRI 駆動 ROI アプローチについて述べる。脾臓のラジオト レーサー吸収もグループ間の炎症の末梢レベルを調査して検討した.このメソッドには、時空間ダイナミクスと脳卒中と他の神経疾患における特定の neuroimmune 相互作用の役割に重要な洞察を提供する可能性があります。
Protocol
管理パネルの研究室動物気 (APLAC) スタンフォード大学評価・研究室動物ケアの認定会によって認定されたプログラムに従ってすべての動物の研究を行った。この手順の前に、1 歳 3 か月 C57BL/6 雌マウスは、次の標準的な手順と滅菌条件14dMCAO 手術を受けた。
1. 構造 MRI (2 日間ポスト dMCAO 手術)
- オペレーティング ソフトウェアを開く (材料の表を参照) とセットアップ新しい試験を作成することによって取得します。パレット エクスプ ローラーでローカライザーと turborare T2 シーケンスを選択し、試験の] ウィンドウにドラッグします。
- 呼吸を確保し、柔らかいテープを使用してマウスのベッドにプローブを熱滅菌環境を作成する両方の上パディング保護吸収のストリップを配置します。
- 空気加熱器を動物のベッドに付けるし、暖かい空気がファンをオンにマウスボタンを加熱します。体の温度と呼吸の率は、スキャンの時間の適切なレベルで維持されるように自動化された監視システムを使用します。
-
1-2% (2 L/分、100% O2) で 3% を維持し、当初、イソフルランを用いた誘導室でマウスを麻酔します。下にマウスを誘導中に暖かい保つために誘導室熱パッドがオンを確認します。麻酔、一度乾燥し、角膜潰瘍の形成を避けるためにマウスに目の潤滑剤を適用されます。
- MRI スキャナーに接続されている麻酔システム (イソフルラン 1-2%、2 L/分 100 %o2) をオンにし、動物をマウスのベッドに転送します。
- マウスの頭やすい一口バーとバーの耳修正の位置、場所に、彼らはベッドの直径の外にはみ出さないようにしてください。
- マウスの頭の上の RF コイルをスライドさせ、アイソ センターの具体的配置孔にコイルとベッドをプッシュします。
- すべての 3 次元マウスの位置を表示し T2 turborare のボリュームを定義するこのイメージを使用してローカライザーを取得 (TE: 33 ms、TR: 2 分 40 秒総時間、0.083 x 0.92 mm 分解能 17 スライス 2 平均 2,500 ミリ秒) 買収。体性感覚野14; の梗塞で dMCAO 手術結果したがって、この領域は T2 強調画像で覆われているを確認します。
- スキャナーからマウスを削除し、加熱室でマウスを回復します。
2. ペット/CT の校正とワークフローのセットアップ (6 日ポスト dMCAO 手術)
- CT 減衰獲得、60 分 C-11 動的ペット取得 (350-650 keV レベル差別 3.438 ns 偶然ウィンドウ)、ヒストグラムを含むスキャナー動作ソフトウェアの画像処理ワークフローを作成 (20 フレーム: 5 x 15 秒、4 x 1 分、11 x 5 分; と死んだ時間訂正)、0.96 mm ボクセル サイズ × 0.776 × 0.776 画像 3DOSEM OP 復興 (イテレーション 2、18 のサブセット) 128 × 128 × 159 を作成します。
- インターフェイスの左上隅にある CT のキャリブレーション パネルを介してエアコン x 線源を実行します。この校正遂行されなければならない毎週またはスキャンの前に過去の 48 時間のシステムが使用されていない場合。
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ダーク/ライト (D/L) と (C/O) 校正センター オフセットを実行します。
- プレス CT 調整ボタン (X) 上では、インターフェイスの左。
- D/L を選択、C/O の CT ファイルを実行する場合で、ガントリからベッドを削除し、D/L キャリブレーションを実行します。
- 校正ツール ベッドをスキャナーにセットして、インターフェイスの選択を「70 mm パレット」ではなく「校正ツール」に切り替えるのを確かめて、係る原産地証明調整。
- 校正ツールを削除し、標準的なペット ベッド、インターフェイスの選択を「70 mm パレット」に変更することを返します。
- テープを使用してスキャナーのプラットフォームに 4 マウスのイメージングのベッドを確保し、麻酔チューブ (図 1A) を添付します。そのイソフルランは流れるチューブ、そこにそれはないねじれを確認します。
- それは、視野 (FOV) のセンターで CT ドアを閉めるし、ベッドを正しい位置に確実に CT のスカウトのビューを取得、ベッドを押してください。
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C-11 ソリューションを放射線源として知られている線量を含む社内製造されたファントムを用いた PET/CT スキャナーの「標準」キャリブレーションを実行します。
- 1 つのマウス (250 〜 350 µCi/9 - 生理食塩水で希釈した C-11 トレーサーの 13 MBq) に投与 20 mL 注射器がトレーサーの投与量と同等でいっぱいを準備します。
- 線量校正器を使用して標準のアクティビティを記録し、測定の時間に注意してください。
- (前述) に画像マウスに使用する正確な同じパラメーターを使用して標準のペット/CT スキャンを実施します。Pet イメージングのデータに適用するための補正係数を作成するこの週を行います。
3 ペット/Ct のワークスペースの設定
- 殺ウイルス剤と消毒剤を使用して無菌環境を作成 (材料の表を参照してください) すべての表面に保護吸収パッドを配置します。
- イソフルランと酸素タンクが十分に満たされることを確認します。
- 0.9% 塩化ナトリウム (食塩) で (27.5 G 針の先端が装備) 1 mL シリンジを充填し、27.5 G、24 cm 蝶カテーテルを介してフラッシュ尾静脈カテーテルを準備します。Cannulating 尾静脈のビューをブロックしていないことを確認し、スキャナーにカテーテルをずらすことがなく、マウスの移動の容易さと助ける前にカテーテルの翼を切断します。
- 目の潤滑剤、エタノール綿棒、熱ランプ、カテーテル (あらかじめ生理食塩水で満ちている)、サージカル テープ、組織接着剤、0.5 mL 用量の注射器に準備必須装備にスペア「フラッシュ」注射器 (滅菌生理食塩水で満ちている) を含むワークステーション置かれことを確認します。ハサミと尾静脈 (図 1B) に正常に配置した後カテーテルをシールするライター。
4. 動物の準備、穿刺
- 最大ボリューム (トレーサーのすなわち量と体重の 10% を超えないように、生理食塩水投与必要)、各マウスに注入されることを決定するためにマウスの重量を量る。
- 誘導の部屋に 3% を使用してマウスを麻酔イソフルランおよび 1-2% (2 L/分 100% O2) で維持します。
- それぞれのマウスに目の潤滑剤を適用し、ペダル反射 (つま先ピンチ) を介して anesthetization を確認します。必要に応じて麻酔のレベルを調整します。
- 1-2% (2 L/分 100% O2) イソフルランを提供する鼻の円錐形が装備温水ベッドの上にマウスを置きます。
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マウスを麻酔すると中、は、次のプロトコルを使用して尾静脈穿刺を行います。
- 鼻の円錐形の頭のまま、側脈のいずれかを公開する横向きにマウスを置きます。
- 熱ランプ、過熱または尾を燃やすし、アルコール ワイプで綿棒に触らないを使用して静脈を拡張し、注射部位を消毒する尾を温めます。
- ベベル針をホールド アップ、鋭い角度で静脈に合わせます。
- 軽く穿刺の皮膚と静脈に沿っているので針をレベルに圧力を適用されます。
- 数ミリの面取り過去を針が静脈に入るのでゆっくり前進します。
- カテーテルは生理食塩水のフラッシュによって小 (10-20 μ L) を投与することで、確認してください。生理食塩水はスムーズに注射器を残す必要があり、静脈をオフにする必要があります。場合任意の抵抗または背部の圧力を観察すると、カテーテルは静脈ではないと勧め再穿刺を試みているそうです。凝固が見られる場合は、カニュレーション セットアップとフラッシュのヘパリン (mL 生理食塩水あたり 1,000 単位ヘパリン) を使用します。
注: は、カニュレーションと関心のマウス緊張でヘパリンを評価しているし、生理食塩水だけを用いて深くすべての残の凝固は認められず, 以来。 - マウスをスキャナーに転送するとき、カテーテルまま動かないようにサージカル テープ、続いて組織接着剤の小さなドロップを使って尾にカテーテルを固定します。
- フラッシュの注射器をカテーテルとライター、研究者を確保する目的はイソフルランやエタノールの近くではシールの端から削除します。
- スキャンするすべての 4 匹を cannulated、準備、3 追加マウスに対して繰り返します。
- 各マウスの頭はまっすぐな鼻の円錐形内と PET/CT 慎重に位置や場所に残っているカテーテルを確保、スキャナー ベッドで発生しやすいマウスに接続された麻酔フロー (2.5% イソフルラン、2l/分 100% O2) 入れます。頭をテープし、呼吸を確保するソフトのサージカル テープでベッドに各マウスの体はテープの配置によって制限されていません。正しい場所と画像解析グループ割り当てを許可するそれぞれのマウスの位置を記録します。
- マウス (例えば、過熱することがなくマウスが保温できるように熱ランプまたは熱風ヒートポンプ システムを使用して) プロシージャ全体加熱をしてください。視覚的に開いているガントリーを使用している場合、または呼吸のパッドを使用して遠隔監視システムを通じてすべてのマウスの呼吸速度を監視し、必要に応じて、麻酔レベルを変更します。
5 CT の獲得
- 動物はベッドで安全な呼吸は安定している、一度クロス毛と移動し、彼らはすべての 4 つのマウスの脳を合わせますベッド スキャン レーザーを入れます。スキャナー ベッドをできるだけ視野の中心部に近いとしてマウスの脳で取得位置 (位置 3) 移動します。
- (200 mm FOV を使用)、その位置を確認、必要に応じてインターフェイスで FOV ボックスをドラッグして位置を調整するマウスのスカウト ビュー イメージを取得します。トレーサー注入前に PET スキャンを手動で開始することができますので、「対話型ユーザー プロンプトを表示」を選択することを確かめる、CT スキャンを開始するスキャナー ソフトウェアの「ワークフローを開始」をクリックします。
6. [11C] DPA 713 投与準備
- [11C] を合成 DPA 713 前述12白衣、手袋、指と体の個人線量計など、放射能を処理する適切な PPE (個人保護用具) を身に着けていることを確認します。定期的に放射能汚染を防ぐため手袋を変更し、可能な場合は、放射線源からの距離の増加を確認します。
- 鉗子を使用して、慎重に鉛シールドの後ろにルコース バイアルを転送します。
- 約 250-350 µCi/9-13 MBq 60 分ダイナミック ペット スキャンの適切な線量を確保するため 100-200 μ L のボリュームを含む各マウスの 0.5 mL の用量の注射器を準備 (投与された用量決定されるべき同位体とタイム ラインの半減期を考慮しました。研究と設計のマウスの重量に応じてボリューム)。
- 測定線量校正を使用して、アクティビティ C-11、カニュレーション サイトに程近い場所に設定し、測定と減衰補正を有効にする注射の回を記録します。各マウスに注入される崩壊を制限し、放射能の必要なレベルを確保する CT 終了直前に用量を描画します。
- 活動を測定し、それぞれのマウスに注入前に、の用量注射器で空気の泡がないことを確認します。
7. ペット獲得
- マウスはペットに ct 画像から自動的に進む、[11C] DPA 713 注入 (図 1C) のスキャナーの背面を設定します。棚に保護吸収パッドを配置し、はさみと軽量化は、一方を確認します。
- ハサミで密封されたカテーテル チューブを切り取る、カテーテルの行で任意の気泡の明確なカニューラは 10-20 μ L の生理食塩水フラッシュを実行することによって、静脈内に収まっていることを確認をチェックします。4 カテーテル、各マウスに与えられたどの線量の追跡の各ステップ 6.4 から測定用量注射器をロードします。
- PET スキャンを起動中に 10 秒のタイマーを同時に開始する準備ができたら、「OK」をクリックします。タイマーがゼロに達する時に同時にすべての 4 匹を挿入する手、用量注射器とスキャナーの背面にある 2 つの研究があります。生理食塩水の 50-100 μ L 各カテーテルをフラッシュ (カテーテル チューブの長さによって-すなわち、デッド ボリューム) 完全な用量尾静脈に入ることを確認し再ライターを使用してもう一度チューブをシールします。
- 線量校正器を使用して残留放射能値 (任意のトレーサーを注射器で左) を取得する用量注射器を測定します。値は、それらが記録される時間の注意してください。
- スキャンが完了したら、ホーム モーション内で水平方向の「ホーム」ボタンを使用して元の位置にペット ベッド コントロール パネルです。スキャナーからマウスを外し、カテーテルを慎重に取り外します。過度の出血を防ぐためにカニュレーション サイトを軽く押さえます。
- 前述した線量キャリブレータを使用してカテーテルの残存活性を測定します。
- マウスを回復することを確認ください暖かい環境 (例えばの下に加熱パッドまたは暖かい水で満たされた手袋を含むボックスで) でこれは、簡単に回復します。マウスを安楽死させることを計画、血流を介して安楽死の前に麻酔が保たれるように、イソフルランを含む誘導室にマウスを配置します。
- データを再構築する処理後の管理ソフトウェアを開く (参照材料表)、これは自動的に lst ファイルから生成されたヒストグラム データを使用して各スキャンを再構築します。
8. 脳放射線写真法
- 実験の前に 10-15 分のためのライトを白し、使用まで放射能がないエリアに維持するそれを公開することによってデジタル オートラジオグラフィー フィルムを消去します。
- 約 1.0 〜 1.5 mCi/37-56 放射線写真法の適切な線量を確保するため MBq を含む各マウスの 0.5 mL の用量の注射器を準備します。
- 線量校正器、アクティビティの正確な読み取りを取得する前に使用して用量の注射器で放射能を測定します。
- 上記のように cannulate し、放射能の場ですぐにマウスを注入します。
- 注射後、カテーテルを外し、残留放射能を測定します。
- 灌流および安楽死の前に麻酔が保たれるように誘導加熱チャンバー内でマウスを残します。
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マウスが深く麻酔中に安楽死を実行 (4% の継続的な吸入イソフルラン、2l/分 100% O2) PBS 灌流と両側開胸下 30 分後 [11C] DPA 713 注入を介して。
- 腹腔内を開き、心を公開するダイアフラムをカットします。
- 心臓の左心室に蝶カテーテル注入針を挿入し、右心房と下大静脈を切り取る。
- ゆっくりを PBS で灌流 (20 ~ 30 mL) 20 mL の注射器を使用して。
- 鉗子、はさみを使用して頭蓋骨から脳を慎重に取り外します。
- 凍結鋳型では、脳の場所は (OCT) 液体、最適な切削温度でいっぱい, 脳はレベルを確認し (一度脳でランドマークと方向を提供するために金型の切り込みに向かって指向嗅球と、金型内で中央揃え金型から削除)。
- 10 ドライアイス場所カビ-15 分または OCT が不透明になるまで。
- すぐに-18 ° C、クライオスタット ミクロトーム セットの各型を配置し、取り付ける前に 10 分間平衡します。
- 凍結鋳型をはがすし、「接着剤」として新鮮な 10 月の少量を使用してミクロトーム プラットフォームに脳をマウントします。
- 2 分間凍結ミクロトームでマウントされた脳を残します。
- ストローク位置が公開されている (すなわち、投資収益率) になるまでは、脳を介してスライスします。MR 画像を使用して、それぞれの動物の脳梗塞を探します。DMCAO、このする必要があります一貫して体性感覚皮質;しかし、ストロークの長さが異なる場合があります。
- 脳梗塞は、20 μ m 厚のセクションを配置する適切なマウスの番号の付いたガラス顕微鏡スライド上にまたがる地域のセクション。
- オートラジオグラフィー カセットを開き、サランラップの一枚、カセットの底を並べ。スライド セクション側を上にカセットでサランラップの上に、各スライドの位置の注意を手配します。必要に応じて、後で分析を支援するスライド配置の写真を撮る。
- 優しく (次のスライドに準拠して乾燥することができます - 最後の脳のセクションのコレクション 〜 2 分を待っている) 後の上にサランラップの別の層を配置し、慎重にスライド上にデジタル オートラジオグラフィー フィルム (白い面を下に向けて) を配置します。
- カセットをしっかりと閉じるし、適切な露出時間 (5 ~ 10 半減) のためフィルムに減衰するセクションを許可する、-20 ° C のフリーザーに残します。
- その後の分析のためのデジタル画像を生成する蛍光体の撮像素子を使用して露光時間後フィルムをスキャンします。
9. 動的 PET 画像解析
- 画像解析ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください)] (ソース) として CT 画像を読み込み「オープン データ」アイコンと (参考) として動的なペットをロードする「データを追加」アイコンをクリックします。
- ドロップ ダウン メニューで時系列オペレーター経由のデータの視覚的品質制御を実行: 参照 ("ref") と「グローバル」を選択し、適切な分とカラー スケールのマックスを適用します。動的ペット データ フレームで、放射能の吸収量を確認することを視覚化し、スキャン内で混同する任意の動きをチェックします。
- 「算術演算子」を使用して平均の PET 画像を作成します。
- 「平均を選択」を選択、"ref"選択を解除し、("Inp1") の入力 1、入力 2 ("Inp2") と入力スターを確保する (「Inp *」-スキャンでペット フレームの残りの部分にはが含まれます) ペットすべてフレーム平均を作成するが選択されています。
- 「データ マネージャー」タブ (DM) に移動し、可視化目的のため「input1」位置まで平均画像をドラッグします。「ミニマックス」ツールで自動計算をクリックしてカラー スケールを再配布します。
- 「再 orientation/登録」ドロップ ダウン メニューで「自動 3 D」関数を使用して平均のペット ファイル CT を登録します。
- "Ref"と"Inp1"を選択し、「リジッド」、「高速」、"Ref に Inp1"の登録を選択します。視覚的にすべて 3次元で登録を確認し、「翻訳」と「回転」機能を使用して、「手動 3 D」タブで必要に応じて手動で調整します。
- 登録に問題がなければ、"Inp2"と「Inp *」を選択し、チェック マークをクリックしてペットのすべてのフレームに適用します。DM の ct 像と PET ファイルを右クリックし、raw として保存します。
- ガイドとして、CT を用いた脳解析の時に 1 つのマウスの脳をトリミング: ドロップ ダウン メニューから「トリミング」を選択し、、脳幹の下マウス頭をトリミングする画像境界をドラッグします。頭蓋骨がまっすぐすべての寸法になるように上記のように「手動 3 D 向きかえ」関数を用いた PET 像と CT の画像を再オリエンテーションします。
- インターフェイスの左上に「データを追加」ボタンを使用して (dicom) のマウスの MR 画像のロード。氏の「手動 3 D 向きかえ」を使用しての移動と適合する CT 画像内でスカル (すべてのモダリティは、同じ方向を確認してください).
- 「3 D ROI ツール」を使用して MR 画像の ROI のストロークを描画します。
- ペットの可視化 (VC) ビジュアル コント ローラー] タブ内で選択を解除して切りのみ、MR と CT を使用して投資収益率を描画します。
- 新しい投資収益率を作成し、名前を「梗塞」の"投資収益率"追加ボタンをクリックします。ROI の境界線を描画し、それをクローズするを右クリックして左クリックして「スプライン ツール」を選択します。
- 頭蓋骨の境界とストロークの投資収益率の間ボクセル ギャップを残しているベスト ・ プラクティスと ROI の頭蓋骨のいずれかをキャプチャしないように作るストロークを包含するすべてのスライスを繰り返します。
- 梗塞ボリュームを使用して対側の投資収益率を生成します。
- 新しい投資収益率を作成し、ラベルを「対」。梗塞 ROI を右クリックし、「エクスポート」を選択します。投資収益率を 2 ("Inp1") の位置にドラッグします。
- 唯一の"Inp1"を選択、左右反転「方向転換/登録」メニュー内「オペレーター」関数を使用して適用されます。"ROI"ボックスをチェック、「表示のみ」を選択し、側に同一地域に新しい投資収益率を手動で移動します。「算術」演算子を選択し、2 のスカラー倍算を Roi の独立した定量化を許可、新しい投資収益率に適用します。
- 3 D の ROI ツールに戻ります。「専門家と実験」タブに移動し、「ROI をインポート」ボタンをクリックしますします。対投資収益率として新しいボリュームをロードするダイアログ ボックスから Inp1 を選択します。
- 平均の PET 画像を右クリックして、それをアンロードしてペットを入れます。3 D の ROI ツール内で [結果のエクスポート] アイコンを使用して定量的な取り込み結果を生成します。
- (すなわち、自動 Vivoquant ソフトウェアの 3 D マウスの脳アトラスのプラグイン モジュールを使用して左脳半球地域対右の ROI 世代) を希望する場合は、追加の分割脳解析を実行します。
- 登録ペット/CT 画像を再ロードします。
- 「高度なモジュール」メニューをクリックし、3 D の脳アトラス ツールを選択するには、マウス脳アトラスをインポートします。」すべての領域左/右」の「高度な設定」を選択し、3 D アトラスをインポートするには「実行」をクリックします。
- 手動でアトラスを境界線として頭蓋骨を用いた脳に収まります。
- 14 の左と右半球 Roi (延髄、小脳、中脳、橋、皮質、海馬、視床、視床下部、線条体、フトゲツツガムシ、嗅球はすべての結果のスプレッドシートを生成する「3 d ROI をインポートする」がチェックされているかどうかを確かめるアトラスを再実行脳梁と白質)。
- オペレーティング ソフトウェアのスキャナーを使用して脾臓のトレーサー摂取量の定量化 (材料の表を参照してください)。
- データベースでそれらを強調表示し、「一般的な分析」をクリックすると PET 像と CT の画像ファイルを読み込みます。
- [登録] タブをクリックし、共同「剛体登録」アイコンをクリックすると PET 像と CT 画像を登録します。
- 投資収益率の定量化のタブをクリックして、「投資収益率を作成」アイコンをクリックして、脾臓という名前を付けます。
- 脾臓・ ロワ CT ファイルを参照、使用した腎臓吸収 (PET 画像を使用し、腎臓からの波及を避けるために信号) との重複がないことを確認を描画する「球」ツールを選択します。
- 動物との間の一貫性のある投資収益率ボリュームを維持するためにロアを編集します。
- 摂取量の正規化のための標準的な補正値を計算します。
- 標準的なスキャンから PET/CT データをロードし、シリンダー 20 mL 注射器「手動 3 D ROI」ツールを使用して包括的な投資収益率を作成します。
- スプレッドシート アイコンを使用して標準に含まれる放射能のレベルを取得します。
- ペット吸収値の補正係数を作成する (すなわちnCi/cc の標準の線量校正器測定) 標準の nCi/cc 結果と元の記録された放射能を使用します。つまり、標準の PET 画像から計算される放射能による線量校正器によって記録された標準の放射能を分割します。
- (すなわち計算ペット スキャンの開始時投与量活動) のすべてのマウスの線量の活動および崩壊ペット取得時に正しい測定の時間を使用します。
- 残留値の繰り返し、崩壊修正線量計算正確なアクティビティをから受け取った各動物を減算します。
- この減衰補正を適用すると、データは、右の活動レベルを確認する標準的な補正にも適用されます。これらの修正は手動で描画の投資収益率の結果と dMCAO 場所 (すなわち皮質、海馬、線条体) の脳アトラス ROI データ関連脳領域に適用されることを確認します。
- 次の方程式を使用して僅かのため、%ID/g を計算する: %ID/g = (nCi/cc で ROI 放射能 nCi/cc で受け取られた修正された服用量の崩壊/) x 100。グラフ作成ソフトウェアを使用して各 ROI の時間活動曲線を生成する時間の関数として %ID/g をプロットします。
- スキャナー ソフトウェアを使用して、最終的な画像の可視化と図を生成します。スキャン時に各マウスが受信した崩壊修正線量に応じて画像を正規化する、同じ %ID/g のスケールではすべての画像を確保します。
注: これは別のマウスからの画像および/または別の日に実施した調査から画像の正確な比較を有効にする必要が
10. オートラジオグラフィー画像解析
- ImageJ ソフトウェアでデジタル イメージ (.gel ファイル) を開きます。輝度、コントラストを視覚的にイメージのしきい値を調整し、適切な色「参照テーブル」を適用します。
注: ロイヤルは、ペットボトルで使用されているカラー スケールを最も正確に似ています。 - 梗塞周辺対応する対側領域・ ロワを手動で描画するのに ROI マネージャーを使用します。
- メジャー関数を使用して、各投資収益率の平均ピクセル強度を定量化し、結果をエクスポートします。統計ソフトウェアを使用してプロットします。
Representative Results
マウスは成功したストロークと [11C] を確認する MRI を施行した DPA 713 ペット 4 匹を同時にスキャンすることによって実施されました。PET、CT および MR 画像から手動で脳・ ロワを描画し、同側および対側の地域 (図 2) でトレーサーの通風管を調査するため、半自動分割脳アトラス解析を実行する前に共同登録されました。
ペット/CT 画像と時間活動曲線 (時間の関数として TACs ラジオト レーサー活動) は、同側と対側半球 (図 3A) で増加 [11C] DPA 713 吸収を表示します。50-60 分の合計を使用して、動的の PET 脳画像の定量化データ明らかにトレーサーの摂取量 (%id/g) 同 (梗塞) 対側半球 dMCAO ではなく、手動で描画を使用して偽のマウスと比較して大幅に増加投資収益率のアプローチ (図 3B)。DMCAO と偽のマウスと同側の半球の増加の取り込みが認められました。アトラス ・ ロワ (通常は体性感覚野に限定) 梗塞のサイズよりも大きいため希釈の可能性が高いため、アトラスのアプローチを使用して同側および対側の半球間に有意差は認められなかった、信号。しかし、シャムと比較して dMCAO の全体的な増加の取り込みは梗塞19以外の地域でいただけた発現の増加を示す MCAO モデルマウスを使用して前のレポートは位置合わせすべて・ ロワの観察されました。両方のアプローチを使用して偽マウス対 dMCAO で同側・対側比が増加しました。しかし、この違いは、ROI アプローチにおける変動の大きいため脳アトラス アプローチを用いた皮質で重要なものだった。これは各グループのマウスの数を増やすことによって克服することがあります。脾臓の [11C] DPA 713 摂取量の定量化 (図 4) のグループ間に有意差を認めなかった.
脳 dMCAO マウス ペット画像処理の結果は、前のヴィヴォ高解像度デジタル オートラジオグラフィー (図 5) によって確認されました。増加 [11C] DPA 713 取り込みは、周囲の正常な脳組織にごくわずかな信号梗塞組織で観察されました。これらの画像の定量は同側対側比 1.4 から 2.09 dMCAO マウスに至るまで明らかにしました。
図 1:Pet とワークスペースのセットアップ。すべてのワークスペースは、無菌環境を作成する保護吸収パッドで覆われていた。(A)校正後 4 匹を同時にイメージングのための装備、3 D プリントされたマウス ベッドはスキャナーと麻酔に接続されているすべての 4 匹のノーズコーンが確保されました。(B) PET 画像診断に必要な機器は事前に生理食塩水で満たされた 27.5 G カテーテル、目潤滑油、エタノール綿棒、熱ランプ、サージカル テープ、組織接着剤、0.5 mL 用量注射器、ハサミ、ライターを含む準備されました。(C)ラジオト レーサー インジェクション生理食塩水フラッシュ注射器やスキャナーの背面にあるはさみを配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:同側・対側の投資収益率と右/左-分割半球脳アトラス PET 画像解析プロセス。画像解析ソフトウェアは、手動でを使用して興味 (ROIs) の同側および対側の地域におけるトレーサー吸収を決定に使用された描画・ ロワと半自動 3 D ブレイン アトラス アプローチ。自動 3 D ペット/CT の登録は、CT 画像で定義されている対応するマウス頭蓋骨内の脳 mri 像の手動登録に続いて実施されました。3 D の ROI ツールを使用して手動で同側 (赤) を描画と対側 (緑) ・ ロワの MRI では梗塞を参照として使用します。ブレインのアプローチでは、3 D マウスの左/右-分割脳アトラスがロードされ、CT 画像で定義された頭蓋骨内に装着。この 3 D マウスの脳アトラスの定量化に使用される脳・ ロワは、左皮質 (ダークグレー)、左の海馬 (コーンフラワー ブルー)、左線条体 (ディープ ピンク)、右皮質 (赤いトマト)、右海馬 (緑) と右 Striatium (シアン) に含まれています。[11C] の取り込み各地域の DPA 713 nCi/cc で得られた、その後それぞれのマウスのスキャンの時に減衰補正量を正規化することで %ID/g に変換されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DMCAO および偽マウスにおける DPA 713 脳吸収量の代表的な生体内で[11C]。(A)ペット/CT 画像と TACs 増加 [11C] DMCAO を受けたマウスの同側の皮質 DPA 713 吸収を示す (n = 3) と偽のわずかな増加 (n = 3) マウスで有意を示す DMCAO マウスを運営注入量を百分率で梗塞と脳 (%ID/g) の側との間のコントラスト。(B)ペットの定量化 (50-60 分の合計) は、同側の投資収益率 ROI のアプローチを使用して、皮質 (Ctx) ブレイン アトラス アプローチを使用して大幅に増加した吸収を明らかにしました。海馬 (HC) や線条体 (Str) の重要な相違点が見つかりませんでした。両方の解析を用いたアプローチしますが、のみ脳アトラスのアプローチを使用して Ctx で統計的に有意な増加対側と同側の比率が見られました。* (p < 0.05)、* * * (p < 0.001)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:DMCAO における代表的なIn Vivo [11C] DPA 713 脾臓吸収と偽マウス。(A) [11C] DPA 713 動的 PET/CT 画像の dMCAO の脾臓・ ロワを示す (n = 3) と偽 (n = 3) マウス。(B)量的な結果は dMCAO と偽のマウス脾臓吸収で重要な結果を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 代表オートラジオグラフィーの結果。デジタル放射線画像は、対側半球と比較して増加 [11C] DPA 713 取り込み側を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
提示プロトコル [11C] を使用して dMCAO と偽のマウス neuroinflammation 定量化の方法を記述する DPA-713-ペットボトルTSPO ペットは可視化・測定 neuroinflammation体内まで最も広く調査のイメージング バイオ マーカーです。TSPO 式は炎症の非侵襲的検出および定量化 neuroinflammation を許可中に脳のグリア細胞の誘導です。また、臨床および前臨床研究で貴重なツールとなって、高い翻訳技術です。このプロトコルと代表的な結果を強調 [11C] を使用しての適性 DPA 713 ペット検出およびアミロイド ストロークと他の神経疾患で体内の変化を監視します。
本研究では dMCAO の手術を行った 3 ヶ C57BL/6 雌マウスを使用しています。このモデルは、体性感覚皮質、ストローク (例えば、中大脳動脈の他のモデルと比較して変動の少ないを恒久的な虚血モデルを提供することに制限された再現性の高い梗塞を生じさせるそれとして選ばれました。咬合 (MCAO) フィラメント法)14。脳卒中モデルの PET イメージングには、対側の半球内・ ロワを使用してそれぞれの動物の脳の内部の参照領域を含むという利点があります。以来、単独での手術の結果、開頭術というの研究デザインでは、偽手術を受けたマウスを含めることが重要だし、髄膜動脈閉塞症なしの操作が行われたいくつかの炎症があります。開頭手術だけでは根本的な神経組織やストローク20の独立した免疫応答につながる病原体の導入の混乱につながります。偽手術後いくつかの炎症が期待され、手術単独による信号の可能性を除外する dMCAO を並列で評価する必要があります。DMCAO コホート分析でストロークせず手術に起因する炎症を含むように MRI 確認成功した脳卒中手術と梗塞開発実施しなければなりません。MRI は、梗塞と対側の Roi を正確に描画に必要不可欠な構造参照フレームを提供します。また、正確な画像処理画像の登録と投資収益率の定義を含む、信頼性の高い数量を確保する必要。
C-11 ペットおよびオートラジオグラフィーによる研究ラジオト レーサーをラベルを操作するとき、追加の制限事項を念頭に保たれなければなりません。研究所敷地内のサイクロトロン アクセスに一般に制限され、使用に、C-11 の半減期が短い (20.33 分) を考慮することが不可欠です。適切な放射能輸送ルート、線量管理、および買収時点必要があります事前に決定実験のワークフローの事前準備の詳細な計画でチームが迅速かつ効率的に作業することができますので。C-11 トレーサーを使用する際に得られるデータの出力を高める同時に 4 匹のイメージングに対応するデザインと本研究のセットアップに概説されています。可能であれば、cannulated すべてのマウスを持っていることをお勧めだし、時間によって、CT スキャンの途中で C-11 トレーサー注入前に最小限ルコース崩壊ようにイメージング施設に到着します。このステップ バイ ステップのプロトコルも最高を可能にするクイック カニュレーション、線量測定、トレーサー注入法、ペット スキャンおよび脳断面重要な放射性崩壊前に少なくとも 3 研究者を含むチームによって実行されます。二人ペット スキャンの開始とすべての 4 匹の注入を同時に行うことが必要です。注入直前にペット獲得を開始するため確実に体内動態と血液中のトレーサー分布のダイナミクスと関心領域が正確かつ完全にキャプチャです。多くの手順は、積極的な訓練と実践、実験の円滑な運営を確保するために必要があります。特に、このプロトコルは c57bl/6 マウスを黒髪のツインテールに存在のために困難にすることができますし、ストロークが発生した後、または複数の時点で同じマウスを画像により挑戦的になることがありますの成功の尾静脈穿刺に依存.
Pet の別の考察には、ルコース線量および残留活性の測定、測定の正確な時刻を含む慎重な記録が含まれています。これはスキャンの時に注入された線量の正確な減衰補正に欠かせない、各 ROI のトレーサーの取り込み (すなわち、 %id/g) の正確な測定を取得するために使用します。正確な分析を確保するためにスキャンの時に各マウスに存在していた放射能の正確な量を知ることが不可欠です。したがって、スキャナー コンピューター キュリーメータ C-11 など短命の同位体を使用する場合、エラーを避けるために、時計を同期することをお勧めします。
ペット画像定量の正確さは、スキャナーとセットアップの精度によって制限できます。したがってペット/CT 画像の定量の正確さを確保するため、スキャナーの ct 像と PET の両方のコンポーネントの品質管理チェックを行う重要です。CT 品質管理チェックには、x 線ソース、エアコン、光と闇、オフ設定のキャリブレーション センターが含まれて。これらの校正は、測定し、取得する前に実行するシステムの異音のする必要があります正しいスキャナー製造元の推奨どおり。校正は、PET 装置に対しても実行する必要があります。これは通常知られている放射能濃度を含む「標準/ペット ファントム」スキャンのスキャンを含みます。標準を準備しているとき、それに匹敵する線量の投与がマウスと同じ獲得の本体に似たボリュームに単一のマウスにパラメーター動物イメージングとして、研究で使用される同じ放射性同位元素を使用することをお勧めします。水で希釈したルコースでいっぱい 20 mL シリンジはこのプロトコルの標準校正検出器によって測定される実際の線量に基づいて補正係数を計算するために使用その後ペット イメージング結果で使用されます。補正率は、PET 画像における領域におけるトレーサー吸収量の定量の正確さを確保するための実験で取得した画像データに適用できます。これは、スキャンの日に現在の任意のバック グラウンド アクティビティを考慮に加えて核種陽電子範囲を占めています。線量校正器は、この補正係数の世代の不可欠な部分は、この機器は製造元のガイドラインに従って定期的に校正してもことが不可欠です。
前のヴィヴォオートラジオグラフィーを行う際、関心の領域での高い信号背景を確保するため、注射後の安楽死のための最適な時点を選択する重要です。投与 30 分後生体内で[11C] DPA 713 放射線写真法動的 pet -すなわち、中に取得したデータを使用しての選ばれた C-11 と時間の短い半減期も考慮しながら、ガイドとして動的 TACsセクションし、抽出後に脳組織を公開します。これを考慮し、[11C] DPA 713 服用と 30 分の注入を可能にするをマウスの別コホートに [11C] DPA 713 放射線写真法を行う必要があります血流と麻酔下で安楽死の時点。体内の小さな実行前のヴィヴォオートラジオグラフィーを行う前に 3-4 マウスのペット パイロット研究は、放射線写真法の最適な時点を決定するため参考になります。前のヴィヴォ放射線写真法のための追加の考慮事項は、注射後マウスを回復したり、安楽死まで麻酔に保管するかどうかです。維持麻酔しスキャンの条件を模倣、ルコース分布または排泄動態の回復により改変されないように。さらに、これは回復、その後誘導を回避することによってマウスの付加的な圧力を防ぎます。最後に前のヴィヴォのプロトコルに有用な付加は梗塞場所の高解像度画像を生成する (放射性崩壊) 染色免疫を介してオートラジオグラフィー用脳スライスにおける地域の損傷を評価するだろうとボリューム。
基づく C-11 トレーサーの使用制限があります、このプロトコルは、F-18 (109.77 分の半減期) と活用いただけたトレーサーより敷地内のサイクロトロンのない場所に適用される簡単に変更できます。さらに、このプロトコルは 4 マウス イメージング セットアップの使用について説明します。この高スループット方法は、C-11 トレーサーを使用する場合に最適ですが、このプロトコルは、これらのマウスのシングル ベッドをイメージングを使用しても修正されるかもしれません。慎重な計画とこのプロトコルで説明されている技術の一貫性のあるトレーニング [11C] を使用してデータの富の世代につながる DPA-713、病気症状 neuroinflammation の役割を調査する簡単に適用することができ、神経疾患の他の齧歯動物モデルで進行。さらに、この手法は免疫調節療法ミクログリア/マクロファージの機能を対象とする生体の応答を評価するために使用できます。
Disclosures
著者は利益相反行為を宣言しません。
Acknowledgments
著者は、Buckwalter ラボ (特に博士トッド ・ ピーターソン) マウス モデルを提供する dMCAO と偽の手術を実行するために感謝したいと思います。さらに、我々 は VivoQuant 画像解析ソフトウェア、博士ティム ・ ドイル、博士ローラ ピザーニ、スタンフォード大学で彼らのアドバイスのための施設を画像 SCi3 小動物から博士 Frezghi Habte と彼のテクニカル サポートに Invicro からトーマス · リグオーリを感謝申し上げますとこのイメージングのプロトコルや [11C] の合成に彼らの助けのための放射化学設備 (特に博士 6 月公園) の開発に援助 DPA 713。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Inveon PET/CT scanner | Siemens | Version 4.2 | |
MRI scanner | Varian | 7 Telsa | |
ParaVision software | Bruker | Version 6.0.1 | MRI operating software |
VivoQuant software | InVicro | Version 2.5 | Image analysis software |
Inveon Research Workspace software | Siemens | Version 4.2 | Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software |
Dose calibrator | Capintech | CRC-15 PET | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
Butterfly catheters | SAI Infusion Technologies | BFL-24 | 27.5 G needle |
1 mL syringes | BD | ||
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.5 mL insulin syringes with needle |
20 mL syringe | VWR | BD302831 | BD Syringe Slip Tip Graduated |
Tissue glue | Santa Cruz Animal Health | sc-361931 | 3 mL |
Heat lamp | Fluker | 27002 | 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch |
0.9% sterile saline | Pfizer | 00409-4888-10 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
Eye lubricant | Watson Rugby | PV926977 | Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz |
Chux absorbent sheets | ThermoFisher Scientific | 1420662 | Disposable absorbent padding |
Iris scissors | World Precision Instruments | 503708-12 | 11.5 cm, Straight, 12-pack |
Surgical tape | 3M Durapore | 1538-0 | 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic |
Mouse PET bed | In house | 4 mouse PET bed | |
Lighter | Bic | UDP2WMDC | |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL |
Oxygen | Praxiar | UN1072 | Compressed gas |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only |
Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 30-508-35 | MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle |
Microtome | Microm | HM 550 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Superfrost™ Plus Microscope Slides |
OCT liquid | VWR | 25608-930 | Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below |
Freezing molds | Poly sciences | 18646A-1 | Disposable paraffin molds |
Saran wrap | Saran | 25700001300 | |
Disinfectant | Virkon S |
References
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