Summary
في هذه المقالة، يتم توفيرها من أسلوب لعزل الخلايا اللحمية الوسيطة القلب من عينات مرضى اعتلال عضلة القلب أرهيثموجينيك بيوبتيك اندوميوكارديال. ويرد على توصيف والبروتوكول تعزيز التمايز أديبوجينيك بهم.
Abstract
قلب الكبار عادي يتكون من عدة أنواع من الخلايا المختلفة، التي تمثل القلب الخلايا اللحمية الوسيطة سكان وفيرة. عزل هذه الخلايا يوفر إمكانية دراسة مشاركتها في أمراض القلب، وعلاوة على ذلك، يوفر نموذجا مفيداً الابتدائية خلية للتحقيق في الآليات البيولوجية.
هنا، يتم وصف طريقة لعزل ج-ماجستير من عينات المرضى اعتلال عضلة القلب أرهيثموجينيك بيوبتيك. ويسترشد عينات خزعة اندوميوكارديال في المناطق المتاخمة لندبة تصور برسم الخرائط الكهربائية التشريحية البطين الأيمن. ويرد وصف هضم الخزعات في كولاجيناز و الطلاء على طبق بلاستيك في مستنبت للسماح بنمو ج-ماجستير. ويمكن توسيع الخلايا المعزولة في الثقافة لعدة مقاطع. لتأكيد على النمط الظاهري الوسيطة، يرد وصف لتوصيف المناعية الشكلية. ج-ماجستير قادرون على التفريق في العديد من أنواع الخلايا مثل adipocytes و chondrocytes وخلايا الاوستيوبلاستس: في سياق ACM، تتسم برواسب adipocyte في قلوب المرضى، والبروتوكولات من أجل التفريق بين أديبوجينيك ج-ماجستير ويرد وصف تراكم قطرات الدهن.
Introduction
خلايا mesenchymal Stromal (MSC) خلايا البالغين مع وظيفة داعمة هامة في العديد من الأنسجة1. نخاع العظام يمثل المصدر التاريخي للجنة السلامة البحرية، ولكن يمكن أن تكون معزولة من أنسجة مختلفة بما في ذلك المشيمة والأنسجة الدهنية ودم الحبل السري، والكبد والقلب1،2.
وفي عام 2006، المحدد "الجمعية الدولية" للعلاج الخلوي (إيست)، للمرة الأولى، معايير الحد الأدنى لتعريف البشرية ماجستير3. على وجه الخصوص، لجنة السلامة البحرية يجب أن يكون لديك القدرة على التمسك بالبلاستيك. يعربون عن المستضدات السطحية محددة: الإيجابية تميز علامات CD31 المكونة للدم وبطانية لعلامات mesenchymal CD44، CD105، CD29، و CD90، والسلبية ل CD14، CD45، CD34، ماجستير. بسبب الافتقار إلى التعبير عن الدكتور هلا، ماجستير غير قادر على تشغيل اللوريكتيفيتي. وعلاوة على ذلك، فخلايا مولتيبوتينت مع القدرة على تمييز تجاه أديبوجينيك وتشوندروسيتي وأوستيوبلاست الأنساب1،3.
التركيز على تكوين الخلوية القلب، القلب الخلايا اللحمية الوسيطة (ج-ماجستير) وفيرة في قلب الكبار عادي4،5. أنها تلعب دوراً حاسما في وظيفة القلب العادي والحالات المرضية على حد سواء. حين، الفيزيولوجية، ج-ماجستير توفر المكروية التي تؤيد السلامة الهيكلية والوظيفية لعضلة القلب، يتم تنشيطها في أمراض القلب في استجابة لإصابات القلب المشاركة في التئام الجروح ويعيد البناء fibrotic6 ،7.
مشاركة ج-ماجستير في أررهيثموجينيك اعتلال عضلة القلب (ACM) استبدال الدهنية في الآونة الأخيرة أظهرت8. على وجه الخصوص، ACM هو اضطراب وراثي نتج أساسا عن الطفرات في الجينات ديسموسومال التي تؤدي إلى استبدال الدهنية الليفي--احتشاء عضلة القلب، أساسا في البطين الأيمن9. ينشئ هذا الاستبدال، تمتد من ابيكارديوم إلى شغاف، ركيزة غير موصل يتسبب فشل القلب تدريجيا وتزداد سوءا عدم انتظام ضربات البطين، الذي يمكن أن يؤدي، في الحالات الشديدة، إلى الموت المفاجئ. سوماريفا et al. أثبت أصل adipocytes المسبق الوسيطة الموجودة في المقاطع ACM مرضى القلب اكسبلانتيد. وعلاوة على ذلك، ج-ماجستير المعزولة من خزعات endomyocardial ACM قلوب ديسموسومال التعبير عن الجينات ولذلك يمكن أن تتأثر بهذه الطفرات. على وجه الخصوص، في ظل الظروف أديبوجينيك، ACM ج-ماجستير تتراكم الدهون أكثر من تلك التي من قلوب التحكم. هذا الدليل يقود إلى الاستنتاج بأن ج-ماجستير سواء بدور نشط في أمراض المرض، وتمثل نموذجا خلية صالحاً لدراسة مواد تحتوي على الأسبستوس.
لتسهيل البحث في المستقبل في هذا السياق أو أمراض القلب الأخرى التي تتم الإشارة إلى عينة من القلب، ويرد بروتوكول مفصل لعزله ج-ماجستير من أجزاء صغيرة من أنسجة اندوميوكارديال، وتوسعها، وبهم phenotypical المناعية وصف، والتمايز أديبوجينيك.
Protocol
وهذا النهج يتوافق مع "إعلان هلسنكي" وتم جمع العينات البطين الأيمن موافقة لجنة الأخلاقيات "سنترو كارديولوجيكو مونزينو إيرككس" (06/07/2012).
1-الحلول
- جعل المتوسطة تميس للثقافة ج-ماجستير مع المتوسطة (إيمدم "تعديل دولبيكو" ل Iscove)، وتستكمل مع 20% مصل بقرى الجنين (FBS) وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية نانوغرام/مل 10، 10,000 يو/مليلتر البنسلين، 10,000 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 0.02 م لام الجلوتامين. تصفية المتوسطة تميس باستخدام وحدة تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- لإعداد حل كولاجيناز، ريسوسبيند هذا المزيج كولاجيناز NB4 في المتوسط إيمدم للحصول على حل نهائي مع تركيز 3 ملغ/مل. الدوامة بلطف بحل المسحوق، وتصفية كولاجيناز الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون. حجم الكوة 1 مل في أنابيب معقمة 2 مل ومخزن في-20 درجة مئوية إلى أن هناك حاجة لاستخدام.
- تعد المتوسطة "ت. أديبو"، وجعل المتوسطة أديبوجينيك مع إيمدم المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS، 0.5 مم 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (تضعف مسبقاً في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في تركيز من 0.5 متر وأبقى في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام)، الهيدروكورتيزون 1 ميكرومتر (قبل المخفف في [دمس] في 100 مم وكذلك تضعف إلى 10 ملم في تعقيم الماء المقطر وأبقى في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام) والاندوميتاسين 0.1 ملم (قبل المخفف في [دمس] في تركيز من 0.5 متر وأبقى في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام). تصفية المتوسطة "ت. أديبو" استخدام وحدة تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت الغسيل تتألف من الفوسفات مخزنة المالحة 0.0067 م ص4 (PBS)، حمض الخليك تترا الإيثيلنديامين (يدتا) ألبومين المصل البقري 5%، 5 ملم، ومخزن في 4 درجات مئوية.
- تحضير زيت أحمر يا (أورو) العامل الحل بتذويب مسحوق أورو 1% في 60% الايزوبروبانول وخلط ح 2، وتصفية باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرون لإزالة رواسب. تخزين الحل العمل في درجة حرارة الغرفة (RT).
2-عزل الخلايا اللحمية الوسيطة القلب
-
جمع خزعة قلبية وتجهيزها
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون الحل كولاجيناز والمتوسطة تميس جاهزة.- وضع خزعة endomyocardial ACM (عادة حوالي 5 ملغ أنسجة) في أنبوب عقيم مليئة تميس ونقله إلى المختبر.
ملاحظة: يتم جمع عينة ACM في غرفة العمليات الكهربية، وفقا للتقارير السابقة10. بإيجاز، دمج الخرائط الكهربائية التشريحية وتخطيط صدى القلب intracardiac في البطين الأيمن (انظر 1 فيديو) يستخدم لتوجيه خزعة اندوميوكارديال (انظر 2 فيديو، التنظير) في المراسلات إلى منطقة الحدود عضلة القلب المريضة. يتم تزويد صحية التحكم (HC) عينات أنسجة بيولوجية-مصرف، التي تم الحصول عليها من جدار البطين الأيمن الحرة المأخوذة من المانحين خلال 24 ساعة موت (الموت العرضي، مواضيع صحية). وأثناء النقل وقبل التشريح، تخزين الخزعة في تميس في 4 درجات مئوية. الحد من الوقت بين جمع خزعة وتجهيز النسيج (بحد أقصى 24 ساعة). - إعداد السلامة البيولوجية مجلس الوزراء مع الحلول المطلوبة القيام بهذا الإجراء حتى الهضم الأنزيمي.
- وضع معقم تحت غطاء محرك السيارة وقم بتشغيل الأداة 15 دقيقة قبل الاستخدام حتى ترتفع درجة حرارة 200-250 درجة مئوية.
- تعقيم المقص والملقط لجعل س. 10 متأكد من أن الأدوات معقمة الباردة قبل الاستخدام. إعداد المشارط العقيمة المتاح.
- ضع الأنابيب مع الخزعة في هود العقيمة. فتح الأنبوب ونقل الخزعة في صفيحة عقيمة.
- أغسل خزعة البطين الأيمن مرتين مع 3 مل PBS العقيمة. إذا كنت تريد التقاط صورة الخزعة في المجهر.
- نقل خزعة البطين الأيمن، استخدام ملاقط معقمة، في أنبوب عقيم 2 مل يحتوي على 1 مل الحل كولاجيناز.
- قطع العينة إلى 0.5-1 مم3 قطع مقص معقم.
- احتضانها ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية تحت التحريك التناوب المستمر.
- الطرد المركزي الحل هضمها في 400 غرام x لمدة 10 دقائق في الرايت
- إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل PBS العقيمة لغسل بيليه.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 10 دقائق في الرايت
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل متوسطة تميس.
- لوحة تعليق تحصل على لوح العقيمة زراعة الأنسجة 60 ملم تعامل وإضافة تميس المتوسطة الحجم النهائي لمل 3. احتضان اللوحة في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
ملاحظة: وحدة تخزين أعلى من المتوسط قد تمنع الالتصاق الصحيح شظايا خزعة هضمها. - بعد 24 ساعة، تجاهل المتوسط إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة والحطام.
ملاحظة: الخلايا الوسيطة منفصلان واحد يمكن أن نعلق على سطح البلاستيك وتؤدي إلى استنساخ؛ أيضا، يمكن إرفاق إلى الطبق البلاستيك شظايا خزعة صغيرة عسر الهضم والسماح لتنتشر في الخلية. - أغسل لوحة مرتين مع 5 مل PBS العقيمة، وأضف 3 مل من جديد تميس المتوسطة.
- استبدال المتوسطة تميس ثلاث مرات في أسبوع حتى يتم روافد 80% من الخلايا.
ملاحظة: عدد الخلايا المرفقة يعتمد على نوعية وكمية من الأنسجة، وعلى كفاءة الهضم.
- وضع خزعة endomyocardial ACM (عادة حوالي 5 ملغ أنسجة) في أنبوب عقيم مليئة تميس ونقله إلى المختبر.
3. توسيع الخلية
ملاحظة: قبل البدء تأكد من قد المتوسطة تميس جاهزة.
- عندما يتم نقل المتلاقية، 80% من الخلايا هضم العينات بيوبتيك الصغيرة في ثقافة الأنسجة 60 ملم معقمة جديدة تعامل اللوحة، وأضف 3 مل من جديد تميس المتوسطة.
ملاحظة: عينات بيوبتيك يمكن إعادة استخدامها لمزيد من العزلة ج-ماجستير. فمن الممكن تكرار هذا الإجراء حتى يكون هناك عدد كبير من الخلايا المعزولة. - تغسل الخلايا المرفقة مرتين مع 3 مل PBS العقيمة. إضافة حل يدتا التربسين (0.5 مل لطبق 60 ملم)، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة للسماح لمفرزة الخلية.
- عندما يتم فصل الخلايا من سطح اللوحة، إضافة 0.5 مل FBS العقيمة لإلغاء تنشيط التربسين وجمع الخلايا في أنبوب 50 مل معقمة جديدة.
- أغسل لوحة مرتين مع 5 مل PBS العقيمة لإضافة الخلايا المتبقية إلى الأنبوب نفسه.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 10 دقائق في الرايت
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل متوسطة تميس.
- تحميل 10 ميليلتر من تعليق خلية في الخلية عد الدائرة.
ملاحظة: إذا كانت الخلايا مركزة جداً، تضعف الإيقاف الأولى 01:10 في برنامج تلفزيوني وتحميل 10 ميليلتر الخلايا المخفف في الخلية عد الدائرة. - تحت المجهر، عد الخلايا في 3 مربعات كبيرة وعلى غرار اثنين من الجانبين وحساب متوسط عدد الخلايا.
ملاحظة: للحصول على عدد خلايا/مل، يتم ضرب متوسط الخلايا التي تم جردها 104، عامل إضعاف لخلية العد الدائرة. إذا كان قد تم تخفيفه الخلايا المزيد، تتكاثر لعامل إضعاف. النسبة بين عدد الخلايا البذور وتركيز الخلية (عدد خلايا/مل) يتوافق مع الحجم (في مل) تعليق أولى يكون مطلي للخطوة التالية (3.9 نقطة). - لوحة تعليق على لوحات زراعة الأنسجة 100 ملم معقمة تعامل بتركيز نهائي 5,000-10,000 الخلايا/سم2 وإضافة تميس المتوسطة الحجم النهائي لمل 8. احتضان اللوحة في حاضنة ثقافة خلية.
ملاحظة: كرر الإجراء توسيع الخلية عندما تكون روافد 70-80% من الخلايا. في كل مرور (P)، يوصي كريوبريسيرفي جزء من الخلايا ولوحة المبلغ المتبقي. توسيع نطاق الخلايا حتى P3 أو P4 واستخدامها لخلية تنشيط الفلورسنت فارز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحليل (المادة 4) والتمايز أديبوجينيك (القسم 5). - لنعد بعد انفصال، الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 10 دقائق في الرايت
- حساب عدد الخلايا كوصف (الخطوات 3.7-3.8) وريسوسبيند 1 × 106 خلايا في 900 ميليلتر من FBS العقيمة. نقل إلى قنينة البرد عقيمة وإضافة 100 ميليلتر العقيمة [دمس] ومزيج.
- بسرعة تخزين قارورة من البرد في وعاء تجميد في-80 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل ومن ثم نقل القنينات إلى النيتروجين السائل.
4-وصف القلب الخلايا اللحمية الوسيطة بالتدفق الخلوي
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يكون الكاشف تفكك الخلية، غسل العازلة، والأجسام المضادة المحددة التي أعدت.
- عندما يصل عدد الخلايا إلى مالا يقل عن 3 × 106 (عدد الخلايا كما هو موضح في 3.7-3.8)، يغسل لوحة 100 ملم مرتين مع 10 مل PBS العقيمة.
- إضافة 5 مل كاشف تفكك خلية وانتظر دقيقة 7-10 على RT للسماح لمفرزة الخلية.
- عندما يتم فصل الخلايا من سطح اللوحة، إضافة 15 مل من المخزن المؤقت للغسيل العقيمة وجمع التعليق في أنبوب 50 مل معقمة جديدة.
- أغسل لوحة مرتين مع 10 مل من الغسيل المخزن المؤقت وإضافة الخلايا المتبقية للأنبوب نفسه.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 10 دقائق في الرايت وريسوسبيند بيليه في 1 مل من الغسيل المخزن المؤقت.
- عد الخلايا كوصف (خطوات 3.7-3.8)، ونقل 3 × 106 خلايا في أنبوب عقيم جديدة وإضافة المخزن المؤقت للغسيل بحجم 1.5 مل النهائي.
ملاحظة: عدد الخلايا الإجمالي وإجمالي حجم المخزن المؤقت للغسيل يعتمد على العدد العلامات المحددة المستخدمة في التحليل (3 × 105 خلايا في 100 ميليلتر لكل أنبوبة البوليستيرين نظام مراقبة الأصول الميدانية). - توزيع 100 ميليلتر من تعليق الخلوية في أنابيب البوليستيرين 12 من مختلف الأصول، وإضافة جسم معين في تركيز المشار إليه في ورقة بيانات المنتج.
ملاحظة: الأجسام المضادة المستخدمة لتوصيف ج-ماجستير هي CD34، CD105، CD45، CD29، CD90، CD44، CD31، CD14، والدكتور هلا (الجدول 1). من المهم إعداد عينة مراقبة تتألف من 100 ميليلتر من الخلايا حراكه ملطخة بمراقبة ايستب للتحقق من الطابع الخاص للإشارة. - احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل العقيمة لكل أنبوبة التوقف عن رد فعل.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 10 دقائق في الرايت
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 250 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت.
- انتقل إلى وصف ج. ماجستير مع التدفق الخلوي.
5-أديبوجينيك التفريق بين الخلايا اللحمية الوسيطة القلب
ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أعدت المتوسطة "ت. أديبو" وحل العامل أورو.
-
الثقافة في المتوسط "أديبو ت."
- فصل ثم عد الخلايا كما هو موضح في القسم 3.
- لوحة 3 × 105 خلايا على كل بئر ثقافة الأنسجة 6-جيدا العقيمة تعامل لوحة في 2 مل متوسطة "ت. أديبو".
- واسمحوا ج-ماجستير التفريق في المتوسط "أديبو ت." ح 72 أو الأسبوع 1، تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
-
النفط تلطيخ "س الأحمر"
ملاحظة: استخدام النفط الأحمر يا (أورو) تلطيخ لاختبار تراكم الدهن في ج-ماجستير.- ضع بلاتيوندير زراعة الأنسجة 6-بئر غطاء الدخان.
- إزالة المتوسطة أديبوجينيك وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة إلى حجم ما يكفي من بارافورمالدهيد 4% (PFA) لتغطية كل جيدا. إصلاح الخلايا لمدة 5 دقائق في الرايت
- تجاهل منهاج عمل بيجين وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا الثابتة مع الحل العامل أورو ح 1 في الرايت، استخدام وحدة تخزين ما يكفي لتغطية كل جيدا.
ملاحظة: لا تبقى لوحة زراعة الأنسجة 6-البئر تحت غطاء الدخان أثناء حضانة أورو لتجنب تبخر المحلول العامل أورو. - إزالة جميع الحل العامل أورو وتغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 3-5 مرات حتى يتم تنظيف اللوحة تماما؛ تجاهل يغسل. إيقاف يغسل عندما يكون برنامج تلفزيوني المستخدمة واضحة وعندما لم تر، تحت المجهر، غير محدد تلطيخ خارج الخلايا.
- التقاط الصور 20 في 20 X التكبير لكل بئر استخدام مجهر تباين المرحلة المقلوب زراعة الأنسجة.
- افتح الصور مع برنامج معالجة الصور تحديد حجم الخلية تراكم أورو.
- فصل قنوات الألوان المختلفة من خلال وظيفة "تقسيم القنوات" بغية تحديدها كمياً فقط النصوع في القناة الحمراء 255.
- حساب عدد الخلايا لكل صورة بالعد النوى. تطبيع شدة أورو إشارة على عدد الخلايا.
- حساب متوسط النتائج المتحصل عليها لكل صورة من نفس العينة.
Representative Results
القلب stromal خلايا العزلة: ويرد في الشكل 1عزلة ج-ماجستير من إجراء خزعات endomyocardial.
القلب stromal خلايا mesenchymal الوصف: التي حددها "المجتمع الدولي" للعلاج الخلوي (إيست)، تتضمن معايير الحد الأدنى لتحديد الخلايا اللحمية الوسيطة multipotent على توصيف المناعية المظهرية3. على وجه الخصوص، لتأكيد هذه النسب الوسيطة، الخلايا المحتضنة مع الأجسام المضادة المناسبة فيتك/PE/آسيا والمحيط الهادئ-مترافق وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. يتم سرد كافة الأجسام المضادة المستخدمة في توصيف ج-ماجستير في الجدول للمواد.
كما هو مبين في الشكل 2، ج-لجنة السلامة البحرية التي تم الحصول عليها من خزعات إيجابية المستضدات السطحية الوسيطة المحددة CD29، CD44، و CD105. النسبة المئوية للخلايا CD90 الإيجابية متغير، وكما ذكرت سابقا11. غشائي (CD31، CD34)، الوحيدات/بلعم (CD14)، والمكونة للدم (CD45) علامات و histocompatibility الرئيسية المعقدة (HLA-DR) ليست أعرب (الشكل 2).
القلب الخلايا اللحمية الوسيطة أديبوجينيك المفاضلة: للمطالبة التمايز أديبوجينيك، ج-لجنة السلامة البحرية التي تم الحصول عليها من المرضى المتضررين من الأسبستوس والمفوض السامي يجب أن تكون مثقف في المتوسطة "ت. أديبو" (انظر القسم الحلول). تتم المحافظة على الخلايا في ثقافة ح 72 أو الأسبوع 1، الاستعاضة عن المتوسط مرتين في أسبوع.
ويتجلى تراكم قطرات داخل الخلايا الدهنية أورو تلطيخ (الشكل 3). ويمكن ملاحظة الاختلافات في القدرة، وكذلك في درجة التمايز، بين الخلايا التي تم الحصول عليها من الأسبستوس والمفوض السامي. كما هو موضح في الصور التمثيلية، يتراكم ACM ج-ماجستير قطرات الدهن أكثر من "المفوض السامي" ج-ماجستير بعد 72 ساعة ثقافة في أديبوجينيك المتوسط (الشكل 3). تتم المحافظة على هذه الاختلافات أيضا عندما تتعرض الخلايا لشروط المفاضلة أديبوجينيك لفترة أطول (أسبوع واحد) (الشكل 3).
الفيديو 1: تكامل الخريطة اليكترواناتوميكال وتخطيط صدى القلب intracardiac. خرائط اليكترواناتوميكال أحادي القطب للوفلر البطين الأيمن (الأيسر الأمامي المائل والحق الأمامي المائل وجهات النظر) في مريض الذي يخضع لخزعة اندوميوكارديال (أفرقة أقل). مناطق محدودة للجهد المنخفض (أحمر/أخضر) مرئية في ذروة. تجمع عينات بيوبتيك اندوميوكارديال (معلم كدائرة) في المراسلات لعضلة القلب المريضة وحاجز إينتيرفينتريكولار. تخطيط صدى القلب intracardiac في الوقت الحقيقي يسمح التحقق من الموضع الصحيح من بيوبتومي في المنطقة المستهدفة (اللوحة العلوية). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
2 الفيديو: فيديو التنظير في عرض المائل الأمامي حق. بيوبتومي إدراجها عن طريق غمد طويل ديفليكتابل ومتقدمة في طين. وبعد الاختيار دقيق اتصال بيوبتومي بعضلة القلب، فتح الفكين وثم إغلاقه بشدة لجمع العينة. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الشكل 1: مشروع الإجراء. يتم جمع العينة بيوبتيك اندوميوكارديال باستخدام قسطرة بيوبتومي، أداة قطع صغيرة على شكل كماشة. وزن خزعة تم الحصول عليه حوالي 5 ملغ (A). نموذج بيوبتيك اندوميوكارديال هو مفروم إلى 0.5-1 مم3 أجزاء، مع مقص معقم (ب)، وإضافة حل كولاجيناز. يتم وضع العينة في حاضنة 37 درجة مئوية في خلاط منصة الدورية ل 1.5 ح الهضم (ج). فصل الحل هضمها ومطلي في تميس في صحن بلاستيك (د). ج-ماجستير يتم الحصول عليها بفضل خصائصها التقيد البلاستيك أما في الخلايا المفردة أو استنساخ أو تنتشر من شظايا صغيرة بيوبتيك عسر الهضم (E). ج-ماجستير ثم تتميز بالتدفق الخلوي (F). ج-ماجستير يتم مطلي في المتوسط أديبوجينيك وتراكم قطرات الدهن يتم اختباره من قبل "س الأحمر النفط" تلطيخ (ز). الإشارة إلى أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: فلوريميتريك الخلوي الممثل الشخصية ج-لجنة السلامة البحرية- يظهر الرسم البياني كل عدد الخلية مقابل كثافة الأسفار في القناة المشار إليها (PE: فيكوريثرين؛ آسيا والمحيط الهادئ: اللوفيكوسيانين؛ فيتك: فلوريسسين-إيسوثيوسياناتي). في كل رسم بياني ايستب عنصر التحكم (أبيض) وعينه مترافق مع الخلية المحددة يتم إظهار علامة سطح جسم (أحمر). ج-ماجستير إيجابية للوسيطة سطح المستضدات CD29، CD44، CD105، وجزئياً، CD90، في حين أنها لا تعبر عن CD31، CD34، CD14، CD45، والدكتور هلا الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التفريق بين أديبوجينيك ج-ماجستير. صور الممثل ACM و "المفوض السامي" ج-ماجستير، مثقف في المتوسط أديبوجينيك ح 72 والأسبوع 1، ملطخة باورو (الصور اليسرى؛ n = 3). وأفيد في الرسوم البيانية الحق، التحديد الكمي للإنارة لتلطيخ القناة الحمراء 255: كثافة يتم التعبير عنها بوحدات التعسفي (A.U.). ACM ج-ماجستير تتراكم قطرات الدهن أكثر من عناصر التحكم. تم استخدام اختبار T للطالب، *: p < 0.05. الإشارة إلى أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ماجستير وماجستير ج: ماجستير خلايا multipotent المقيم في الكسر stromal لمختلف الأنسجة الكبار، مثل نخاع العظام والأنسجة الدهنية، الغضروف، الدماغ، والجلد، والمرفقات الجنين وقلب12. تم إجراء دراسات مختلفة لعزل وتوصيفها للتطبيقات الممكنة في مجال البحوث الأساسية ومتعدية12،13.
في ظروف صحية، لجنة السلامة البحرية هادئة، وتجديد ذاتي في انخفاض أسعار14. نظراً لأنها تتعرض لتغيرات باثولوجية البيئية، رد فعلهم تعزيز النسيج يعيد البناء عن طريق ترانسديفيرينتييشن المباشر، وترسب مصفوفة، أو تأثير paracrine14.
ماجستير أمراض القلب (ج-ماجستير) تمثل عدد سكان خلية كبيرة غير ميوسيتي القلب4. وهي تنبع من ابيكارديوم وتهاجر إلى عضلة القلب التي تمر بعملية انتقال الظهارية للوسيطة15. أنها تسهم في سلامة بنية القلب، في الفسيولوجية والحالات المرضية، عن طريق التفاعل مع كارديوميوسيتيس والمصفوفة خارج الخلية التوازن7،16الميكانيكية والكهربائية. ومع ذلك، لا يزال لا تماما المفهوم مهام واسعة النطاق من ج. ماجستير. معرفة أعمق لدورها في الظروف الفسيولوجية والمرضية على حد سواء يمكن أن تيسره في المختبر الدراسات المنجزة بعد عزلتها.
ج-ماجستير قد تم الحصول عليها من مناطق مختلفة من قلب الإنسان، مثل أطرافهم أذينية2،17 و18من البطين الأيمن.
في الآونة الأخيرة، ج-ماجستير من العينات البشرية endomyocardial البطين الأيمن بيوبتيك تم الحصول على8، مما يدل على أن مصدر الأنسجة يمكن أن يكون أقل من 3-5 ملغ.
التطبيقات الممكنة: يسمح الأسلوب المبين في هذه المخطوطات الحصول على الخلايا التي تحتوي على مقاطع بسيطة قليلة، مثل الهضم، والتحديد للتقيد بالبلاستيك من عينات صغيرة جداً من القلب.
ج-لجنة السلامة البحرية يمكن اعتبار نموذج خلية، نظراً لأنها سهلة لتضخيم والحفاظ عليها في المختبر، وهي قادرة على التمييز في خلايا نسب الوسيطة (البطانة وأوستيوسيتيس و adipocytes). وعلاوة على ذلك، إمكانية الحصول على الخلايا مباشرة من المرضى يشكل أداة عظيمة في المختبر للدراسات الميكانيكية في سياق الطب شخصية الدقة. والواقع أن هذه الخلايا تحمل الخلفية الجينية والطفرات في نهاية المطاف محددة من الجهات المانحة، وتتأثر بصفات المرضى محددة، مثل الشروط السريرية، والعمر والجنس، ونمط الحياة، والأدوية. وعلاوة على ذلك، قد تسمح إمكانية فرزها لعلامات مختلفة دراسة محددة ج-ماجستير مجموعات فرعية19.
ج-ماجستير معروفة لتكون فاعلة نشطة في أمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة، معظمها يتميز بإعادة عرض الضارة للقلب. ولذلك، فإنها تمثل أهدافا مرشحة لرواية استراتيجيات علاجية لمكافحة أمراض القلب8،20.
ج-ماجستير الخصائص الشبيهة الجذعية وعدم الاستمناع كبير يوحي بإمكانية تطبيقها في الخلية-العلاج لأمراض القلب الطب التجديدي. وفي الواقع، مثل لجنة السلامة البحرية من نخاع العظام أو من مصادر أخرى، ج-ماجستير يحتمل أن يمكن في ذاتي وفي إعدادات allogenic، دون الحاجة إلى مطابقة بين البلدان المانحة و المتلقية21.
وعلاوة على ذلك، تتميز ج-ماجستير، يجري عزل مباشرة من أنسجة القلب، ويجري إخضاع القلب الصغير-البيئة والشخصية جينية. في سياق القلب الطب التجديدي، وهذا يمكن أن يكون من أهمية خاصة للحصول على نتائج ناجحة.
وحتى الآن، حددت الدراسات السريرية للطب التجديدي إمكانات علاجية مفيدة في ج-لجنة السلامة البحرية وعلى باراكريني النشاط18،،من2223. الأهم من ذلك، أن التجارب السريرية التي هي مصدر خلية القلب جارية مع الخلايا المشتقة من كارديوسفيري أو الفئات السكانية الفرعية ج-ماجستير13،،من2425. ومع ذلك، أما بالنسبة لماجستير المشتقة من نخاع العظام، قد تكون بروتوكولات مختلفة اللازمة للحصول على الدرجة الإكلينيكية ماجستير ج26.
ج. ماجستير ACM: البروتوكول المقدم في الغالب مناسبة لدراسة الأمراض التي يشار خزعة للوفلر. ACM المرضى الخضوع لإجراءات بيوبتيك لأغراض التشخيص27. عضلة القلب التدريج محله ندبا، أنسجة خاملة كهربائياً تتألف من adipocytes والتليف. من أجل توجيه العينات بيوبتيك إلى منطقة الندبة، حيث يكون العائد التشخيصي القصوى، هو رسم الخرائط اندوميوكارديال تستخدم10،،من2829. وتؤخذ العينات المستخدمة في هذا البروتوكول في منطقة الحدود في عضلة القلب المريضة.
وعرف سوماريفا et al. مؤخرا دوراً محوريا من ج-ماجستير في أمراض ال ACM8، مما يدل على أن ج-ماجستير هي الفاعلة في ACM القلب أديبوجينيسيس، منذ برياديبوسيتيس في تلك القلوب من أصل الوسيطة. وعلاوة على ذلك، عزلت ج-ماجستير مع هذا البروتوكول من خزعات ACM المرضى أظهرت الميل أكثر إلى تراكم الدهن وأديبوجينيسيس من عناصر التحكم. ولهذا السبب، يمكن استخدام هذه الخلايا لتأكيد بعض الآليات الجزيئية الأسبستوس، تثبت صلاحيتهم كنموذج خلية للدراسات الميكانيكية9.
القيود والخطوات الحاسمة: وعلى الرغم من مزايا الحصول على ماجستير ج مباشرة من المرضى (انظر الفقرة "التطبيقات الممكنة")، يخضع هذا البروتوكول لقيود مختلفة.
أولاً وقبل كل شيء، الإجراء بيوبتيك القلب الغازية وكثيراً ما تجنبها إذا لم يكن ضروريا. وفي الواقع، أخذ عينات من أنسجة القلب إشكالية أخلاقيا وتقنياً على السواء. قد تكون أسباب إجراء خزعة القلب تحقيق تشخيص محدد في سياق القلب في تشخيص تفاضلية، رصد حالة زرع القلب، أو التحقق من وجود ورم القلب30. ولذلك، يمكن المسجلين فقط من المرضى التي يشار إلى خزعة اندوميوكارديال بتوافق الآراء بيان31 للبحث عن ج-ماجستير. وعلاوة على ذلك، القلب بيوبتيك يمكن أن يكون الإجراء المضاعفات السريرية، وقبل كل شيء في قلوب كارديوميوباثيك. ولذلك دائماً حذرون العينات اليكتروفيسيولوجيست وعينات بيوبتيك يمكن أن تكون صغيرة جداً، المساس بعزل الخلايا. التجارب المقبلة يمكن التغلب على هذه المشكلة بضبط تركيز كولاجيناز أو توقيت عملية الهضم.
ج-لجنة السلامة البحرية، كجميع خلايا الإنسان الأولية، تظهر تقلب عالية بين مواضيع مختلفة في تعمل جميع. وفي الواقع، الخلايا من مواضيع مختلفة مختلفة وراثيا، بل تعرض أيضا إلى تكييف البيئة المتغيرة. على وجه التحديد، ضمن هذه التجربة، لوحظ تقلب عالية في تمايز الخلايا العزلة، والنمو، وأديبوجينيك.
خطوات حاسمة لهذا البروتوكول قد يتعين الاعتراف بها. إذا كانت تشمل العينة بيوبتيك الشعيرات الدموية، يجب إزالة تجنب عزل موازية لخلايا بطانية، التي قد تلوث ثقافة ج-لجنة السلامة البحرية، ويمكن أن يتضح من تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية (الإيجابية ل CD31). للحصول على تمايز أديبوجينيك فعالة، يجب أن تكون الخلايا في مرحلة نمو نشط. وقد تؤثر درجة التقاء أيضا تراكم الدهن.
أهمية الأسلوب: وفيما يتعلق بالأساليب السابقة لعزل الخلايا اللحمية الوسيطة، هذه هي المرة الأولى حيث وصف ج. ماجستير الحصول مباشرة من العينات بيوبتيك البطين البشرية المقترح بالتفصيل. على الرغم من أن هذا الأسلوب المقترح لتجهيز عينات المرضى ACM، أنها يحتمل أن ينطبق على جميع المرضى الذي يتم الإشارة إلى عينة من القلب.
ويمثل هذا البروتوكول تطبيق مفيدة من الأساليب السابقة للحصول على الخلايا التي تتطلب أكبر عينات القلب32، التي غالباً ما تكون صعبة لجمع.
وعلاوة على ذلك، يشكل مصدر العينة بدعة مثيرة لاهتمام. بينما يتم إجراء خزعة البطين عادة على حاجز33، يأخذ هذا البروتوكول في الاعتبار العينات التي تم الحصول عليها من الجدار الحر البطين الأيمن. الخلايا المستمدة من منطقة البطين الأيمن المريضة قد تكون أكثر تمثيلاً لحالة مرضية من الأمراض التي تنطوي على rv.
وبالإضافة إلى ذلك، بعض الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مختلفة فيما يتعلق بالأخرى ج-ماجستير العزلة والتمييز بين أساليب32. على سبيل المثال، نوع كولاجيناز المقترحة في هذه المخطوطة مزيج من الفئة الأولى والفئة collagenases الثاني بنسبة متوازنة من أنشطة بروتيوليتيك. وعلاوة على ذلك، والحل الهضم يتألف من مزيج كولاجيناز حله في نفس القاعدية المتوسطة (إيمدم) تستخدم لإعداد ج. ماجستير الثقافة المتوسطة، مما يسمح ج. ماجستير معزولة تتكيف مع ظروف النمو في المستقبل.
وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن إجراءات الفرز يمكن توحيد الدفعية خلية، استخدام السكان ج-ماجستير كاملة، معزولة فقط من خلال الخاصية البلاستيكية الانضمام لهذه الخلايا، يشكل تبسيط دون تغيير في إيمونوفينوتيبيك خصائص ج-ماجستير. تكوين "أديبو ت" المقترحة في هذه المخطوطة قادرة على أن تؤدي إلى التفريق بين أديبوجينيك، تجنب التقلبات الأيض الناجم عن العناصر الأخرى مثل الأنسولين.
وعلاوة على ذلك، الطريقة المقترحة للمادة الدهنية التراكم الكمي، الذي يستند إلى تقييم شدة أورو اللونية، يوفر مزيد من المعلومات حول كمية الدهون المتراكمة، إذا ما قورنت بالأساليب التي تعتمد فقط على النسبة المئوية الخلايا إيجابية لتلطيخ أورو. غالباً ما تراكم الدهون هو كمياً عن طريق استخراج أورو دمج الخلايا مع الايزوبروبانول وقياس امتصاص. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب المزيد من الممرات وهي تتعرض لتقلب نتيجة التبخر الايزوبروبانول.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل بوزارة الصحة، ريشيركا كورينتي بمركز كارديولوجيكو مونزينو-إيرككس الإيطالية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
- Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
- Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
- Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
- Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
- Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
- Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
- Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745 (2016).
- Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
- Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513 (2011).
- Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
- Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
- Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512 (2014).
- Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
- Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
- Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
- Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
- Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
- From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S.
