采用改良兔骨感染模型研究万古霉素负载硫酸钙联合自体骨移植的治疗效果

摘要

本研究通过在骨髓中阻滞等量细菌，建立了一种改良的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染兔模型。采用载万古霉素的硫酸钙联合自体骨进行抗生素治疗及骨修复治疗。该方案有助于骨感染与再生的研究。

摘要

骨感染由细菌侵入引起，在临床、骨科及创伤外科中极难治疗。骨感染可能导致持续性炎症、骨髓炎以及最终的骨不连。建立一种可行且可重复的动物模型对骨感染研究和抗生素治疗至关重要。作为一种体内模型，兔模型在骨感染研究中被广泛应用。然而，既往关于兔骨感染模型的研究显示，感染状态不一致，细菌数量存在变异。本研究提出一种改良的手术方法，通过将细菌阻滞于骨髓内，以在兔体内诱导骨感染。随后可进行多层次评估，以验证该建模方法。

通常，清创坏死组织并植入载万古霉素的硫酸钙（VCS）是抗生素治疗中的主要方法。尽管VCS中的硫酸钙有利于成骨细胞爬行和新骨生成，但在清创后仍会出现大段骨缺损。自体骨（AB）是一种具有吸引力的策略，可用于修复清创坏死骨后形成的大段骨缺损。

在本研究中，我们采用尾骨作为自体骨移植材料植入骨缺损区域。动物处死后，通过显微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析评估骨修复情况。结果显示，在VCS组中， consistently 出现骨不连。相比之下，VCS-AB组的骨缺损区域显著减小。本研究所描述的建模方法提供了一种可重复、可行且稳定的骨感染模型制备方法。VCS联合自体骨治疗在抗生素治疗后显著降低了骨不连的发生率。改进的骨感染模型以及VCS与自体骨的联合治疗策略，有助于深入研究与创伤骨科相关的骨感染及骨再生机制。

引言

骨感染通常由创伤、骨折或其他骨病后细菌或其他微生物侵入引起¹。骨感染可引发严重的炎症反应和骨组织破坏。在临床实践中，Staphylococcus aureus（S. aureus）是导致骨感染的主要致病菌^2,3。骨感染具有疼痛剧烈、致残性强的特点，且常呈慢性病程，极难治疗⁴。目前，清创坏死组织并植入载万古霉素的钙盐（VCS）珠链已被证实为控制局部感染的有效策略^5,6。然而，仍有10%至15%的患者在抗感染治疗后出现骨修复过程延长、延迟愈合或不愈合⁷。大段骨缺损是骨科医生面临的最大难题。自体骨移植被认为是治疗骨不愈合的最佳骨替代方案^8,9。

迄今为止，关于骨感染和自体骨移植的研究大多在多种动物模型中进行，例如大鼠、兔子、狗、猪和绵羊^10,11

方案

本研究中使用的兔子均按照《实验动物护理与使用指南》进行处理。所有实验程序均遵循浙江中医药研究院生物伦理委员会的规定。

1. 细菌悬液的制备

1. 将0.5 mg的S. aureus冻干粉（ATCC 6538）溶于0.3 mL LB培养基中，充分混匀悬浮液。
2. 将细菌悬浮液划线接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板，于37 °C培养16小时。
3. 挑取单个细菌菌落形成单位（CFU），接种于胰蛋白胨大豆肉汤管中培养24小时。在37 °C继续传代培养约24小时，于培养16至18小时、600 nm处光密度（OD）值达到0.6时，获得对数中期生长的细菌¹⁴。
4. 取1 mL细菌悬浮液转移至离心管中，在825 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。用100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并洗涤细菌，重复此步骤3次。最后用3 mL PBS重悬细菌。
5. 采用McFarland比浊法估算细菌浓度¹⁵。
   1. 将100至500 µL细菌悬浮液加入比色管中，直至浊度与0.5 McFarland标准管相当。
   2. 通过目视与0.5 McFarland标准管比较浊度，当细菌浓度约为10⁸ CFU/mL时....

结果

骨感染模型的评价
在接种S. aureus后，兔子的病理表现与临床上慢性骨髓炎的典型症状相似。本研究中，30只兔子被感染并作为模型组，另设10只兔子作为对照组。所有模型组兔子胫骨局部均出现感染性窦道，窦道口有白色或黄色脓液溢出（图3A）。H&E染色结果显示，模型组中细菌聚集物位于死骨周围，且无法辨认出正常的骨细胞。模型组的CRP和WBC水平均高于对照组（图3B）。将坏死骨髓裂解液划线接种于琼脂平板，感染后模型组菌落数明显增多（图3C）。造模结束时，有3只兔子因严重感染死亡。其余成功感染的兔子被确认为骨感染模型，并分为3组：模型组、VCS组和VCS-AB组。

讨论

在以往的研究中，已构建了多种动物模型用于研究急性和慢性骨感染；然而，寻找理想模型的工作仍在继续^17,18。此外，理想的骨感染模型应能模拟临床骨感染的病理特征，同时建模周期短、成本低且易于操作。迄今为止，兔骨感染模型是炎症性骨病研究中最常用的模型，因为兔子来源广泛、操作可行且成本低廉。在我们之前的研究中，比较了不同体重兔子的死亡率和感染率。结果表明，兔子体重应超过3 kg；否则，术后将出现较高的死亡率，或较高的菌血症发生率及更高的死亡风险。

与早期研究不同，本研究中的兔骨感染模型及抗生素治疗方案更符合人类疾病的病理特征和外科治疗方式。在以往的研究中，注射十四烯基硫酸钠和S. aureus的动物模型其病理状态无法持续超过60天，且死亡率超过20%^12,19。已有研究证实，骨缺损处溢出的S. aureus溶液会导致感染率.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可吸收外科缝合线	Jinghuan	18S0604A
无菌注射器	Jinglong	20170501
骨蜡	ETHICON	JH5CQLM
CCD相机	Olympus	DP72
EDTA-K2抗凝血管	XINGE	20170802
电动骨钻装置	Bao Kang	BKZ-1
电动剃刀	Codos	3800
柔性硅胶模具	WRIGHT	1527745
苏木精-伊红染色试剂盒	Beyotime	20170523
LB培养基（Luria-Bertani培养基）	Baisi Biothchnology	20170306
医用级硫酸钙	WRIGHT	1527745
显微计算机断层扫描（micro-CT）	Bruker	SkyScan 1172
显微镜	Olympus	CX41
新西兰白兔	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
11号手术刀片	Yuanlikang	20170604
生理盐水	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
戊巴比妥钠	Merk	2070124
聚维酮碘溶液	Lierkang	20170114
S. aureus 冻干粉	中国普通微生物菌种保藏管理中心	ATCC 6538
羊血琼脂	HuanKai Microbial	3103210
胰蛋白胨大豆琼脂平板	HuanKai Microbial	3105697
胰蛋白胨大豆肉汤管	HuanKai Microbial	3104260
万古霉素	Lilly	C599180