Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטהר exosomes פלזמה והן בסרום בטהרה שיתוף מופחתת של חלבוני דם בלתי-exosomal. פרוטוקול ממוטבת כולל אולטראפילטרציה פרוטאז לטיפול, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. טיהור משופרת של exosomes הטבות במורד הזרם ניתוחים, לרבות כימות מדויקת יותר של שלפוחית ואפיון פרוטיאומיה מבנית.
Abstract
Exosomes, סוג של nanovesicle שוחררו כל סוגי תאים, יכול להיות מבודד בכל נוזלי. התכנים של exosomes, כולל חלבונים RNAs, הן ייחודיות על התאים שמהם הם נגזרים, יכול לשמש אינדיקטורים של המחלה. מספר פרוטוקולים העשרה נפוצות, כולל ultracentrifugation, תשואות exosomes עמוסות חלבון מסיס מזהמים. באופן ספציפי, מצאנו כי החלבונים הנפוץ ביותר בתוך דם לעיתים קרובות לטהר בשיתוף עם exosomes, יכולים לבלבל מחקרים פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, שסיכל את הזיהוי של שפע נמוך סמן מועמדים. חשש נוסף הוא irreproducibility של exosome כמת חלבון עקב ייצוג לא עקבי של רמות החלבון הלא-exosomal. פרוטוקול מפורט כאן פותחה כדי להסיר חלבונים שאינם exosomal לטהר במשותף יחד עם exosomes, הוספת הקשיחות לתהליך טיהור exosome. חמש שיטות הושוו באמצעות לזווג פלזמה וסרום מתורמים חמש. ניתוח באמצעות ננו-חלקיק מעקב ניתוח ואת וזמינותו חלבון חומצה bicinchoninic מיקרו גילה כי פרוטוקול משולב ניצול כרומטוגרפיה הדרה אולטראפילטרציה וגודל הניב את שלפוחית אופטימלית העשרה והסרת חלבונים מסיסים. סופג המערבי שימש כדי לאמת החלבונים בדם שופע הצפוי, כולל אלבומין, apolipoproteins, היו דלה.
Introduction
Exosomes הם nanovesicles (החל בגודל של 30 ננומטר ל-150 ננומטר) שפורסמו על ידי כמעט כל התאים בגוף האדם כדי להקל על התקשורת לתא מעבד1,2. מעניין, ההרכב של exosomes משתנה בהתאם התאים של המקור, כמו גם מצב בריאותו של הפרט3,4,5. בנוסף, exosomes ניתן לאחזר מ נוזלים ביולוגיים כמה כגון: רוק, שתן, דם2. בשל תכונות אלה, exosomes נחשבים מקור טוב של סמנים למחלת. למרבה הצער, יש שיטה סטנדרטית עבור בידודו של exosomes. כמה מעבדות שקול צנטריפוגה רב-שלבי, בצעד מהיר הסופי ב g 100,000 x באמצעות מעברי צבע צפיפות כמו השיטה תקן הזהב exosome בידוד. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-ultracentrifugation הזה גורם צבירה של exosomes עם חלבונים מסיסים ו exosomes אחרים, בנוסף כדי להשפיע את exosome שלמות, אשר שניהם עשויים ה"בלתי יישומי הזרם6,7 . שיטות נפוצות אחרות של בידוד exosome כוללים, אך אינם מוגבלים: משקעים על ידי מסחרי פוליאתילן גליקול (PEG) מבוסס ריאגנטים אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות). ריאגנטים מסחרי באמצעות פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG) להעשיר exosomes על ידי גורם להם לזרז ויוצרים גלולה. מגבלות שימוש הפולימר הזה הם זיהום, עם פולימר פג שיורית, שפע של חלבונים מסיסים שאינם-exosomal במוצר הסופי. אולטראפילטרציה מנצל צנטריפוגה לטהר ולרכז שלפוחית באמצעות קרום תאית; exosomes נשמרים מעל המסנן, בזמן זיהומים קטנים וחלבונים אחרים עוברים הממברנה7,8. בדיוק כמו שיטות אחרות, אולטראפילטרציה צנטריפוגלי בעל קיבולת מוגבלת לטהר exosomes עקב השמירה של רמות גבוהות של חלבונים שאינם exosomal, כולל חלבון קומפלקסים אגרגטים. לבסוף, טיהור שניה משתמש שרף נקבובי כדי להפריד בין מולקולות לפי גודל. שניה הראתה תוצאות מבטיחות, להתגבר על רוב הבעיות מנוסה עם שיטות אחרות על-ידי לכידה הרוב המכריע של חלבונים מזהם של שמירה על שלמות exosomal, מאז בידוד מבוסס על כוח המשיכה או מערכות בלחץ נמוך7, 9. עם זאת, הבידוד שותף גדול יותר חלבון lipoproteins אגרגטים10 במהלך שניה משפיעה על הטוהר של הכנת exosome הסופי. בעוד כמה שיטות נבדקו לטיהור exosome supernatants התרבות תאים, פלזמה7, או רק פלזמה9,11, אין מידע על הביצועים של שיטות ישירות השוואת הדם פלזמה, סרום של אותו אדם.
כאן, אנו מתמקדים הטיהור של דם exosomes על-ידי השוואת מגוון של זרימות עבודה כדי לקבוע אם שלפוחית העשרה טכניקות לתרגום בין פלזמה לסרום. ננו-חלקיק מעקב אחר ניתוח תספיג שימשו כדי לכמת את ההבדלים בהרכב exosome, טוהר לריכוז החלבון במוצרי הקצה. שיטת הסופי, מפורט של פרוטוקול זה, מגביר את המספרים שלפוחית ומפחית רמות החלבון הלא-exosomal. חשוב, הפגינו ירידה דרסטית של חלבונים גורם משותף נפוץ כולל אלבומין, apolipoproteins. שפע גבוהה אלה שני חלבונים בדם ואת התדירות שבה הם שיתוף לטהר עם exosomes גורם חוסר עקביות בין דגימות "מזוכך", הטיית הניתוחים במורד הזרם. פרוטוקול זה כולל את השימוש שרף שניה זמינים מסחרית; השרף מורכב חרוזים נקבובי שבו חלבונים קטנים יותר 700 kDa באפשרותך להזין את החרוזים. פעם אחת בפנים, החלבונים נשמרות על-ידי ליגנד octylamine. Eluate מורכב exosomes של מולקולות גדולות יותר מ 700 kDa12. בנוסף, על מנת להפחית את אגרגטים חלבון ואת apolipoproteins אשר להתחמק חרוז השמנה, אנו כוללים צעד עיכול פרוטאז בזרימת העבודה. כיום, אין שום טכניקה יחיד מסוגל למקסם את התשואה exosome תוך צמצום שיתוף טיהור החלבונים הלא-exosomal. מחקר זה מראה כי פרוטוקול טיהור המשלב רעלני עיכול של פרוטאז עם שחזור מרובים ושיטות טיהור יכול לשמש כדי להגדיל את התשואה exosome וטוהר נסיוב הדם, פלזמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודה זו הייתה נחושה לא להיות ניסויים בבני אדם מסקירה הראשונית של המוסדיים סקירת לוח (IRB של קולורדו סטייט), כמו כל דוגמאות האנושי התקבלו כפי שזוהו מבטל את דגימות biorepository Bioreclamation IVT והיו אסף תחת IRB אושרו פרוטוקולים.
1. הכנת המדגם גולמי (פלזמה או סרום) מאת Pelleting שלפוחית גדול ופסולת הסלולר
הערה: שיקול הבטיחות: פלזמה, סרום ונוזלים ביולוגיים אחרים הם חומרים ותברואה, חייבים להיות מטופלים עם טיפול מיוחד, כשאתה לובש בסיסי ציוד מגן אישי, כולל כפפות חלוק המעבדה. מומלץ מאוד כי דגימות ביולוגיות מעובדים של אבטחה בארון; אם לא זמין, מומלץ השימוש של העין-הגנה.
- Equilibrate סרום או מדגם פלזמה על ידי הנחת הצינור בתנאים שאינם מנער במקרר 4 ° C בלילה (מ-20 או או אחסון-80 ° C).
- Aliquot µL 250 המדגם לתוך צינור microcentrifuge באמצעות פיפטה של 1,000 µL.
- Centrifuge הדגימה ב g x 18,000 למשך 30 דקות ב 4 º C.
- באמצעות פיפטה 200 µL, להסיר µL 200 של תגובת שיקוע שנוקה ולהוסיף אותו צינור microcentrifuge. הימנע כל חומר pelleted בעת העברת את תגובת שיקוע. להשליך את החומר pelleted.
- לכמת את תכולת החלבון של המדגם על ידי חומצה (BCA) bicinchoninic assay, באמצעות הפרוטוקול של היצרן. כדי לבצע את הבדיקה, לדלל את דוגמה 1:50 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לבחון כל מדגם כפילויות.
הערה: השתמש PBS x 1 לאורך כל הפרוטוקול אלא אם צוין אחרת. בממוצע, 200 µL של סרום מובהר או פלזמה (לאחר 18,000 x g) תניב 15 מ ג של חלבון הכולל. סוגי דגימה אחרים, עם תכולת החלבון נמוכה יותר או גבוהה יותר, עשוי לדרוש דילולים BCA נוספים. - Aliquot 10 מ ג של המדגם לתוך צינור microcentrifuge. להשתמש את הריכוז מתקבל בשלב 1.5 לחישוב כמות הדגימה המתאימה. Aliquot הדגימה באמצעות פיפטה 200 µL.
הערה: מומלץ לאחסן המדגם הנותרים ב-80 מעלות צלזיוס. Aliquot השתמש המדגם צינורות שונים-10 מ ג למחזור כדי להימנע ההקפאה מרובים-הפשרה מחזורים עתידיים.
2. העיכול של חלבוני דם בלתי-exosomal
הערה: הצעד עיכול נועד להפחית את החלבונים הלא-exosomal אשר יכולים לטהר בשיתוף עם exosomes. אם שימור של חלבונים משטח exosome נדרשת עבור ניתוחים במורד הזרם, יש לקחת בחשבון כי שלב זה יש פוטנציאל להפריע בניתוח זה. זיהוי exosomal CD63, חלבון tetraspanin השטח החשופים, היה משמעותי שהמועמדים אינם מושפעים תהליך זה.
- להכין proteinase פתרון K-ריכוז של µg/mL 500 ב- PBS. להוסיף את כמות proteinase K צינור חרוטי. לאחר מכן להוסיף את המאגר ואת מערבולת ב-30 s, x 3 בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 50 µL של פתרון proteinase K המדגם 10 מ ג aliquot ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 200 µL.
- דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך 30 דקות במקום הצינור במעמד צינור לצוף ולהימנע טבילה מלאה צינור באמבט מים כדי למנוע דליפה פוטנציאליים.
- להעביר את הדגימה ואת מתלה צינור צף באמבט מים 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי להשבית את proteinase ק.
3. הסרת של חלבונים קטנים, פפטידים על ידי צנטריפוגה אולטראפילטרציה
- לשטוף התקן אולטראפילטרציה המכיל מסנן ניתוק (MWCO) משקל מולקולרי kDa 100 עם PBS לפני השימוש. לעשות זאת על-ידי הוספת µL 500 ל- PBS למסנן, באמצעות פיפטה של 1,000 µL. לסובב המכשיר ב 3,700 x g עבור 5 דק להשליך כל retentate הנותרים, כמו גם את eluate.
הערה: קיבולת נפח דגימה של המכשיר אולטראפילטרציה חייב להיות 0.5 מ ל mL - 4 כדי לוודא כי הנפח הסופי מדגם מופחתת של 50 µL הוא בר השגה. - לקחת את הדוגמה מהצעד 2.4 ולהגדיל את עוצמת הקול כדי 500 µL על-ידי הוספת PBS. Pipette המדגם לתוך המכשיר אולטראפילטרציה שטופים מראש.
הערה: בממוצע, שאמצעי האחסון מדגם מהשלב 2.4 µL 185 (120 עד 150 µL מדגם ו- 50 µL של פתרון proteinase K). - למקם את המכשיר אולטראפילטרציה צנטריפוגה benchtop זווית קבועה ב g 3,700 x ב 4 ° C עד הדגימה יש להפחית את נפח של 50 µL.
התראה: בעת שימוש בהתקני אולטראפילטרציה עם עצרה נפח, יש לנקוט כדי למנוע יובש מוחלט של קרום מסנן במהלך השלבים צנטריפוגה. - להוסיף 500 µL ל- PBS ישירות לתוך ממברנה מסנן פיפטה לאורך 5 פעמים. צנטריפוגה כמו שלב 3.3. לבצע שלב זה שטיפת סך של 3 פעמים.
- להעביר את retentate הסופית µL 50 microcentrifuge צינור חדש.
- לשטוף את הקרום מסנן עם 200 הציבורית µL, pipetting לאורך 10 פעמים, ולהעביר לשטוף את הצינור מהשלב 3.5.
- המקום בעל מסנן במצב הפוך צינור חדש. הפעל החלמה ספין הפוך עבור 5 דקות ב g 2,000 x לאחזור מדגם הנותרים הקרום. בריכה הדגימה עם הדוגמה מהצעד 3.5.
4. טיהור של שלפוחית על ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות)
- הוסף µL 850 של slurry שניה, עם חרוזים שיש MWCO של kDa 700, לתוך עמודת זרימת הכבידה ריקה, רצ'ט באמצעות פיפטה של 1,000 µL. מקם את העמודות בגודל של ארון תקשורת המתאימה מצוידים עם מגש לנוזלים.
- הפקק התחתון של העמודה ולתת את ניקוז נוזלי במשך 5 דקות. ברגע רוקן, להוסיף 10 מ של PBS לשטוף השרף. לאפשר 20 דקות בשביל הכביסה לנקז מן העמודה.
- במקום מרוכז, proteinase K מטופלים הדוגמה מהצעד 3.5 לתוך צינור חרוטי 15-mL, להגדיל את נפח דגימה עד 5 מ"ל הוספת PBS עם פיפטה סרולוגית. לערבב את הצינור בעדינות במוזיקת עבור 1 דקות ולאחר מכן החל לאט את הדגימה אל העמודה מוכן בשלב 4.2 עם פיפטה סרולוגית.
הערה: לאחר הסרת הכיפה של העמודה, המדגם יזרום דרך השרף על ידי הכבידה; המדגם 5-mL יזרום לחלוטין באמצעות העמודה תוך עשר דקות. - לאסוף את הזרימה בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- בעזרת פיפטה סרולוגית, להחיל את החומר שנאסף שרף שוב כדי להסיר את כל חומר הנותר מתחת 700 kDa.
- לאסוף את הזרימה בצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את השרף פעמיים הוספת 1 מ"ל ל- PBS. לאסוף את הזרימה בצינור מהשלב 4.5; הנפח הסופי הכולל יהיה בערך 7 מ.
הערה: לאחר שלב 4.6, המדגם להיות מדולל כ- 35 פעמים מאמצעי האחסון מדגם המקורי; השלבים הבאים להפחית את נפח ולרכז את הדגימה exosome מטוהרים.
5. ריכוז של Exosomes מטוהרים, חלבון הכולל כמת
- לשטוף את התקן אולטראפילטרציה עם מסנן MWCO 3 kDa עם PBS לפני השימוש, כפי שמתואר בשלב 3.1.
- להוסיף את הדגימה מהשלב 4.6 אולטראפילטרציה ההתקן ואת צנטריפוגה ברוטור דלי החוגגת ב g x 3,700 ב 4 º C. מאגר יעבור דרך המסנן, יכול להיות מושלך. Exosomes מרוכז יישמרו מעל המסנן. Centrifuge הדגימה עד האחסון מעל המסנן (retentate) מופחתת ל- 200 µL.
- להעביר את retentate צינור microcentrifuge.
- לשטוף את הקרום מסנן עם 200 µL PBS מאת pipetting מעל הקרום 10 פעמים ולהעביר לשטוף את הצינור מהשלב 5.3. זה יאפשר האוסף של דוגמה exosome שיורית.
- להביא נפח דגימה עד 500 µL על-ידי הוספת PBS. מערבבים על-ידי pipetting באיטיות לאורך 10 פעמים.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. דוגמאות יש לאחסנו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב- 20 /-80 ° C לאחסון לטווח ארוך. - לכמת את תכולת החלבון של המדגם על ידי assay BCA, באמצעות הפרוטוקול של היצרן. לדלל את דוגמה 1:10 ו- 1:50 ב- PBS. להפעיל כל מדגם כפילויות.
הערה: החל מ- 10 מ ג של חלבון הכולל של סרום או פלזמה, התשואה הכוללת חלבון ב exosomes מטוהרים מהשלב 5.6 הוא, בממוצע, 150 µg. נוספים דילולים עשוי להיות נחוץ אם הדוגמאות סרום או פלזמה משמשים; התשואה עשוי להשתנות עם סוג הדגימה.
6. כמת ושינוי של Exosomes על ידי ננו-חלקיק מעקב ניתוח (נ)
- להוסיף 5 µg של exosomes מטוהרים (כפי לכמת ב- 5.6) 1 מ"ל של PBS ו מערבולת 15 s על מהירות נמוכה-בינונית.
- מקם את הדגימה מזרק חד פעמיות 1 מ"ל. אם הוא זמין, להגדיר את המזרק משאבת מזרק אוטומטי מוגדר להזריק את הדגימה exosome מדולל בקצב של 30 µL/min.
- לבצע מדידות נ באמצעות הגדרות לכידת וידאו: מסך רווח של 3-4 ורמת המצלמה של 12-13.
- הגדרת קובץ ה-script עבור ניתוח לרוץ שלושה טכני משכפל למשך תקופה מינימלית של 30 s שימוש שוטף עבור כל שכפול. הניתוח, להגדיר את הסף לכידת-5.
הערה: פרטים בנוגע לשימוש מזרק אוטומטי, ואת ההגדרות עבור לכידת וידאו זמינים הפניה13. הגדרות לכידת וניתוח עבור נ חייב להיות עקבי מדגמים שונים כדי להבטיח comparability.
7. קביעת הפחתת חלבון מסיס
- להוסיף 1-10 µg של exosomes מטוהרים למאגר דגימה מרחביות ולבצע לזיהוי בג'ל (עמוד) באמצעות Bis-טריס 4-12% ג'ל במרחביות x MES 1 הפעלת מאגר עבור 35 דקות ב- 200 העברה (פ') נפתרה חלבונים ניטרוצלולוזה 0.2 µm קרום על-ידי החלה של o מתח f 50 V עבור ה 1-1.5 לבצע ניתוח תספיג כדי להעריך את הנוכחות של אלבומין, apolipoproteins A, B ודה מרקר exosome CD 63 בעקבות מתודולוגיות סטנדרטי.
הערה: פרוטוקולים מלאים עבור פעולות השירות ב- 7.1 ניתן למצוא אסמכתא14; באופן ספציפי, SP007: פועלת לזיהוי ג'לים, SP011: תספיג פרוטוקול. - להפריד בין 10 µg של exosomes מטוהרים באמצעות דף כמו שלב 7.1, כתם הלהקות חלבון באמצעות צבע coomassie, המלצות התקן הבאים, כדי להמחיש חלבון וריאציה וצמצום בין דגימות.
הערה: פרטים נוספים על הגדרות הפרוטוקול עבור ספיציפית CD63 המערבי שהכלים מתוארים על ידי דיאז ואח. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים המוצגים להלן התקבלו באמצעות דגימות פלסמה וסרום לזווג מתורמים בדם בריא חמש. כדי לקבוע את ההשפעות של כל שלב העיבוד, בוצעו 5 וריאציות של פרוטוקול שהוצגו ולאחר התאוששות exosome והסרת חלבונים שאינם exosome הושוו. השיטות trialed כללו: 1) kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 3; 2) אולטראפילטרציה 100 kDa; 3) proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100; 4) שניה kDa 700 + kDa אולטראפילטרציה 100, ו-5) Proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100 + kDa שניה 700 + אולטראפילטרציה 3 kDa.
באופן קולקטיבי, כל השיטות מעורבים kDa שניה 700 (1, 4 ו-5) הפיק מספר גבוה משמעותית של שלפוחית לכל מיקרוגרם של חלבון בשני סוגי דגימת נסיוב, פלזמה (איור 1 א'-ב'). עם זאת, שיטה 5 שנוצר מספר גבוה משמעותית של שלפוחית לכל מיקרוגרם של פלזמה לעומת סרום (איור 1C). לעומת זאת, ריכוז חלבון מטוהרים exosome הדגימות היה נמוך באופן משמעותי תוך שימוש שניה 700 מבוסס-kDa השיטות (1, 4 ו-5). חד-כיווני אנובה, של Tukey בדיקות השוואות מרובות הראו כי ריכוז החלבון הסופי לאחר שיטות 2 ו 3 היו גבוהות משמעותית יותר ריכוז החלבון הסופי לאחר שיטות 1, 4 ו- 5 (p < 0.001). ההבדלים היו עקביים באמצעות פלזמה או סרום, לעומת זאת, בשיטה 1 ריכוז החלבון הסופי של מטוהרים exosomes היה גבוה באופן משמעותי (מבחן t, p < 0.05) בעת שימוש בסרום (איור 2 א). כדי להעריך את התפלגות חלבון מטוהרים exosomes על-ידי חמשת השיטות השונות, µg 10 מדגם מכל שיטה היו נפתרה בדף, מוכתם coomassie צבע. התוצאות מראים כי הרוב המכריע של החלבון נוכח "exosomes מטוהרים" שיטות 2 ו- 3 היה אלבומין המסומן באמצעות kDa הלהקה חזק ~ 65 (איור 2B).
השלב הבא היה לאשר את הגידול בטוהר exosomes מבודד המבוסס על הנוכחות של אלבומין, החלבון הנפוץ ביותר בדם. תהליך אולטראפילטרציה הראה ריכוז אלבומין מסומן השבר exosomal זה צומצם באופן חלקי על ידי טיפול מראש את הדגימה עם proteinase K (איור 3A, מסלולים S ו- P). ההכללה של 700 שניה kDa בתהליך ירידה הכמות של אלבומין (איור 3A, מסלולים P1/S1 ו- P4/S4) אבל השילוב של 700 שניה kDa proteinase K, אולטראפילטרציה הראה את הסרת היעילה ביותר של אלבומין מ מטוהרים exosomes ( איור 3 א, ליין P5/S5). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי apolipoproteins מבודדים גם נפוץ במשותף במהלך exosome טיהור10,16. באופן ספציפי, ApoB, אשר נוכח צפיפות נמוכה lipoproteins, נמצאה להיות מרוכז מאוד, מטוהרים exosomes דם אנושי10. לכן, אנו מוערכים הבידוד שיתוף של ליפופרוטאינים ApoB ו- ApoA-1. Ultracentrifugation שיטות ואת השילוב של Ultracentrifugation ו 700 שניה kDa הראתה כמות דומה של ApoB לעומת הסכום שזיהה סרום ו פלזמה תספיג חלבון (איור 3B, מסלולים P1/S1, P2/S2, P4/S4; משלים דמויות 1/2). מעניין, התוספת של proteinase K הביא השפלה מוחלטת של ApoB מדגם מטוהרים (איור 3B, מסלולים P3/S3 ו P5/S5). באופן דומה, ApoA-1, הרכיב החלבון העיקרי של צפיפות גבוהה lipoproteins בפלסמה אנושית, צומצם על ידי כל השיטות מעורבים kDa שניה 700 או proteinase K (איור 3C). למרות הרבה כמו אלבומין, אולטראפילטרציה MWCO 100 בכוחות עצמו הצליח להפחית באופן משמעותי את כמות שיתוף טיהור ApoA-1.
לבסוף, כדי לקבוע את ההשפעה של proteinase K על חלבונים נחשפים קרום חיצוני של exosomes, הערכנו את הנוכחות של tetraspanin CD63, חלבון איכותי של exosomes. ניתוח של שהכלים המערבי הראה כי החלבון לא רק לזיהוי בשיטות באמצעות proteinase K (דמות תלת-ממד, מסלולים P3/S3 ו P5/S5), אך הלהקות עבור CD63 בשיטה 5 הייתה לי קליטה יותר אינטנסיבי (דמות תלת-ממד, מסלולים P5/S5). ממצא זה מצביע על שיטה 5 התשואות ריכוז גבוה יותר של exosomes או העלייה של איגוד נוגדן CD63 עקב הירידה של אגרגטים חלבון המשויך השטח exosome.
איור 1 : Exosome התשואה פלאזמה וסרום לאחר חמש שיטות טיהור שונים. (א) ריכוז של exosomes המתקבל פלזמה (n = 5). (B) ריכוז של exosomes המתקבל סרום (n = 5). (C) השוואה בין המספרים של exosomes לכל מיקרוגרם של חלבון מ- 5 סטים מזווג של פלזמה וסרום. מספרים ציר ה-x ייצגו כל שיטת שימוש, 1 = kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 3; 2 = 100 אולטראפילטרציה kDa; 3 = proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100; 4 = kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 100, ו-5 = Proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100 + kDa שניה 700 + אולטראפילטרציה 3 kDa. ב A ו- B, ההבדלים חושבו על ידי חד-כיווני אנובה וגם Tukey של בדיקות השוואות מרובות. C, ההבדלים בין סרום פלזמה לכל שיטה חושבו על ידי t-test. p < 0.05; קווי שגיאה: 95% של הסמך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : חלבון התשואה ב exosomes מטוהרים פלזמה ו בנסיוב באמצעות בחמש שיטות שונות- (א) השוואה בין התשואה הכוללת חלבון ב exosomes מטוהרים המתקבל פלאזמה וסרום (n = 5). (B) תמונה ייצוגית של coomassie מכתים של 10 µg של exosomes מטוהרים נפתרת על-ידי מרחביות-עמוד; n = 1, לזווג פלאזמה וסרום. מספרים בתרשים מייצגים כל אחת מהשיטות, 1 = 700 שניה kDa + 3 אולטראפילטרציה kDa; 2 = 100 אולטראפילטרציה kDa; 3 = proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100; 4 = kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 100, ו-5 = Proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100 + kDa שניה 700 + אולטראפילטרציה 3 kDa. A, הבדלים בין פלזמה ואת הדוגמאות סרום-derived חושבו על ידי t-test. p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : צמצום מזהמים נורמלי של exosomes מבודד דם אנושי ויציבות של החלבון איכותי CD63. הערכת תספיג: (א) אלבומין, µg 1 לכל ליין; (B) אפוליפופרוטאין B, µg 1 לכל ליין; ו- (ג) אפוליפופרוטאין A1, µg 10 לכל ליין; (ד) CD63, µg 1 לכל ליין. L = סולם; S = סרום גולמי; P = פלזמה גולמי. Exosome מטוהרים: טיהור באמצעות 5 שיטות שונות. מספרים בתרשים מייצגים כל אחת מהשיטות, 1 = kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 3; 2 = 100 אולטראפילטרציה kDa; 3 = proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100; 4 = kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 100, ו-5 = Proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100 + kDa שניה 700 + אולטראפילטרציה 3 kDa. נציג נובעת סרום לזווג בין פלזמה של מטופל אחד; מגמות היו עקביים בין התורם דוגמאות. טעינת חלבון מגוונים חשופה; נורמליזציה התבססה על קביעת BCA המדגם ריכוז. חלבון הכולל עומס בנתיב שצוין עבור כל כתם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: המקורי uncropped המערבי לחומה של איור 3- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 2: צפיפות כימות של אלבומין, ApoB, ApoA-1, להקות CD63 איור 3; נעשה שימוש בתוכנות ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה ממוטבת כדי להגביר את הטוהר ואת התשואה של exosomes מדם תגדיל את היכולת שלי במדויק שלפוחית חוץ-תאית כמקור של סמנים ביולוגיים עבור מחלות מספר. בשיטות הרגילות, המשמשים כעת כדי לבודד exosomes, ליתר דיוק, ultracentrifugation ושיטות משקעים, יש מספר חסרונות כולל צבירת exosome, pelleting של חלבונים מסיסים7,17, 18. לחלופין, השימוש שניה הראו שיפור משמעותי בבידוד exosome, מגן על exosomes מפני צבירת ושיפור להסרת נפוצות מזהם הלא-exosomal חלבונים9,11,18 , 19. עם זאת, apolipoproteins10, שלפוחית גדול אגרגטים חלבון, כולל אלבומין, הן לעיתים קרובות מבודד בשיתוף עם exosomes, אם שניה לבד משמש. שני קריטי צעדים בתוך הסיוע שהוצגו פרוטוקול להתגבר על המגבלות שהוזכרו שתי האחרונות. ראשית, צנטריפוגה את המדגם פלזמה או סרום-18,000 x g פוחת משקעים רוב השלפוחיות המוגלתיות גדול להציג במדגם. שנית, הטיפול מראש הדוגמאות סרום או פלסמה עם proteinase K, סרין פרוטאז עם ירידה לפרטים רחב20, היא קריטית כדי להפחית את כמות אלבומין, את apolipoproteins a-1 ו- B המשויך את exosomes במהלך טיהור. שילבנו את השימוש proteinase K עם שלב אולטראפילטרציה באמצעות קרום MWCO של 100 kDa כדי חלקית elute חלבונים קטנים ו פפטידים ולאחר מכן שינינו את השימוש שרף שניה עם MWCO של 700 kDa לנקות עוד יותר קטנים פפטידים חלבונים מן exosomes. זה שרף, במקור אופטימיזציה עבור בידוד הוירוס, לוכדת הנותרים חלבונים גדולים ו/או קומפלקסים תחת 700 kDa. העיקרון של בידוד של שרף שניה זה מאפשר החלמה עדין של exosomes, כיוון הזרימה של המדגם דרך השרף הוא מונע על ידי כוח המשיכה. דבר זה מאפשר פחות צבירת ויושר יתרת exosomes, התגברות על שתי המגבלות הגדולות של שיטות מבוססות-ultracentrifugation. לבסוף, הוכח על ידי. Baranyai et al. כי הדילול של הפלזמה לפני שניה עיבוד משפר את ההחלמה exosome21. ב פרוטוקול זה, כללנו דילול שלב אחד לפני שניה כדי להאריך את זמן מגע של הדגימה עם השרף.
מגבלה חשובה של פרוטוקול הציג הוא העיכול פוטנציאלי של חלבוני ממברנה exosomal על ידי טיפול K proteinase. זה יכול לפגום לניסויים במורד הזרם אם השטח החשופים קרום חלבונים נדרשים עבור ניתוחים במורד הזרם כולל תספיג, אליסה, או לזרום cytometry. לבחון באופן חלקי את ההשפעה של proteinase K על קרום הקשורים חלבונים, ניתחנו את הדגימות שטופלו פרוטאז לנוכחות של CD63, חלבון tetraspanin, אשר בדרך כלל נוכח exosomes. התוצאות הראו כי השימוש proteinase K עם התנאים המתוארים זמן עיכול וריכוז לא הובלת כדי השפלה CD63 משמעותית. עם זאת, הערכה נוספת של חלבון ממברנה-הקשורים יציבות בהתבסס על תחומי המחקר הספציפי יידרש.
לסיכום, פרוטוקול הציג מציע מספר יתרונות על פני שיטות הקיים הנוכחי. כל שלב כולל הפרוטוקול הראו מחקרים עצמאיים להיות מועיל עבור טוהר exosomes: pelleting של גדול שלפוחית, סרום או דילול פלזמה, סעיף Additionally, כאמור לעיל, צעד עיכול proteinase נכללה להסיר apolipoproteins, אגרגטים חלבון, כמו גם ריכוז שלב בסופו של תהליך טיהור המועילה ליציבות exosome ועם תשואה. לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לבודד exosomes מדגימות נפח גדול יותר כמו שתן או תא supernatants תרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרנות פנימי של CSU (כדי kmd ב), בקרת האוויר החוזה #2016-0550-0002 (קריעת של NIAID HHSN272201600013C), ו- ביל ומלינדה גייטס (OPP1039688) (כדי kmd ב/NKG). אנו מודים החוויה מחקר ה-NSF עבור תוכנית הקיץ סטודנטים (REU) באוניברסיטת קולורדו תמיכה נוספת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M.
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
