Summary
Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.
Abstract
Proteaz protein harekete geçirmek/inactivation ve gıda sindirimi de dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyonları var. Proteaz özgüllük tanımlayan proteaz işlevi ifşa için önemlidir. Bu çalışmada önerilen yöntem matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kullanarak benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçerek proteaz özgüllüğü belirler saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi. Cleaved site amino asitleri oluşur ve boşluk Ekleyici Polietilen glikol oluşur yüzeylerde iminobiotin, içerir. Cleaved substrat cleaved bir amino asit kullanarak benzersiz bir moleküler ağırlığı oluşturur. Bu yöntem yararları bu ham numuneleri kullanılarak bir tencereye yürütülen ve aynı zamanda birden fazla örnekleri değerlendirmek için uygundur biridir. Bu makalede, biz basit bir deneysel Yöntem doku çıkarma, sindirim yüzeylerde yerleşimini farklı pH koşullarında sindirim yüzeylerde arıtma örnekleri, içine dahil olmak üzere fare akciğer dokusundan elde örnekleri ile optimize tarif ve yüzeylerde moleküler ağırlık MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak ölçümü. Özet olarak, bu teknik proteaz özgüllük ham örneklerinde kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak doku özleri elde tanımlanması için izin verir.
Introduction
Proteaz proteinler fizyon tarafından fizyolojik süreçleri düzenleyen ve belirli zamanlarda ve yerlerde proteaz aktivitesinin başlangıcında düzenlenmiş1. Bu nedenle ifade ve yerel olarak düzenlenmiştir dokuların aktivite tanımlama ve proteaz algılamak için yeni bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Önerilen yöntem bu çalışma proteaz özgüllük proteaz tespit için paralel olarak tanımlamak amaçlamaktadır.
Proteaz özgüllük algılamak için bazı yöntemler vardır. Azocasein yönteminin kullanımı ile proteaz2 algılanması için iyi bilinen ama onun yetenek daha fazla bilgi almak için sınırlıdır. Zymography, proteaz3molekül ağırlığı belirlemek için kullanılan başka bir kapsamlı proteaz algılama yöntemi olmakla birlikte, substrat özgüllüğü incelemek için kullanılamaz. Proteaz özgüllük spektrometrik deneyleri, p-nitroanilide4gibi yüzeylerde kullanarak ve Fluorometrik deneyleri, coumarin yüzeylerde5 veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri6kullanarak tarafından belirlenebilir. Bu yöntemler tek bir kuyuda bulunan yüzeylerde tek-özgüllük algılanmasını etkinleştirin. Bu özler birden çok proteaz içeren çalışmanın, doku özleri proteaz özgüllük çeşitli koşullar altında incelenir. Proteaz aktivitesi pH, koenzimler, prostetik gruplar ve iyon gücü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından düzenlenmiştir. Son zamanlarda, proteomik tabanlı yöntemleri proteaz özgüllük tanımlamak için kullanılmıştır; Örneğin, Biniossek ve arktarafından bildirilen yöntemi. 7 Proteom substrat özgüllüğü bile içinde ham özleri belirlemek için kullanır ve birden çok amino asit dizileri8tanımak proteaz bölünme etkinliğinin doğru belirlenmesi sağlar. Ancak, bu yöntem çok sayıda örnekleri analiz için uygun değildir. Buna ek olarak, bizim Yöntem birden çok örneği aynı anda işleme ve kullanım Matrix-Assisted Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma sağlar saat uçuş (MALDI-TOF) örnek analiz için kütle spektrometresi i ciddi, hızlı ve kolay algılama kolaylaştırır yüzeylerde.
Bu kağıt proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçmek için MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak değerlendirmek için bir yöntem özetliyor. Onların kuramsal moleküler ağırlıkları birlikte i ciddi yüzeylerde moleküler formları Şekil 1 ve Tablo 1' de gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda polyglycine çubukları ve biotin9içeren yüzeylerde kullanılan; Ancak, polyglycine sıra glisin sıra tanımak enzimler tarafından i ciddi çünkü bu yüzeylerde hatalı. Ayrıca, yüksek afinite avidin ve biotin arasında düşük kurtarma oranı için neden olabilir. Polietilen glikol (PEG), iminobiotin ve bölünme sitesi (Şekil 1) teşhis edebilecek bir amino asit oluşan benzersiz bir substrat sentezlenmiş Bu çalışmada bu sakıncaları üzerine geliştirmek için. Benzer moleküler ağırlık amino asitler arasında ayırımcılık için D-serin PEG spacer ve amino asit cleaved sitesinde arasında eklendi.
N-terminal substrat, benzeşim arıtma ham örneklerinden sağlayan iminobiotin ile etiketli oldu. İminobiotin yerine biotin kullanımı önemlidir; biotin avidin avidin için iminobiotin'ın ilgi pH tarafından değiştirilebilir iken hangi biotin etiketli yüzeylerde avidin reçine, düşük oranda düşük kurtarma sonuçlar ile güçlü bir ilgi vardır. İminobiotin etiketli yüzeylerde pH 4 aşağıdaki koşullarda avidin bültenleri iken Iminobiotin etiketli yüzeylerde avidin pH 9, yukarıdaki koşullarda bağlayacaksınız. Bu nedenle, iminobiotin benzeşme arıtma10için kullanıldı. Özetle, biz proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde kullanarak tespit için detaylı bir protokol tanımlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneysel protokoller Nihon ilaç Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Nihon ilaç Üniversitesi kılavuzlarınıza uygun olarak yürüttü. Protokol doku özleri ICR fareler türetilmiş için ayarlandı. ICR fareler Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japonya) satın alınan
1. Iminobiotin etiketli substrat hazırlanması
9-fluorenylmethyloxycarbonyl grubu (Fmoc) kullanarak katı fazlı sentez substrat uğrar-11açıklandığı gibi amino asitler korumalı. Tablo 2 , istenen amino asit ve sentez aşamasına bağlı olarak kullanılan Fmoc bileşik belirlemek için kullanın.
- Fmoc-NH-SAL reçine 0.2 g N, N-dimethylformamide (DMF) bir sentez sütunda 10 mL ile açgözlü.
- 5 mL % 30 Piperodin DMF içinde ekleyin. Fmoc-grup ayırmak için 10 dakika için çözüm rock.
-
Kontrol Fmoc bölünme trinitrobenzenesulfonic asit (TNBS) ile test12: TNBS DMF ve diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 mm2 cam tüp sonra cam reçine az miktarda aktarmak için 10 µL eklemek 10 µL % 1'lik tüp. Fmoc i ciddi reçine turuncu renk geliştirmeniz gerekir.
- Bu sonuç olumsuz ise 1.2-1.3 adımları yineleyin.
- Reçine üç kez DMF 5 mL ile yıkayın.
-
5 mL Fmoc bahçedeki 0,3 mmol içeren DMF de tablo 2'de (Etap 1 kullanılan bileşik ile başlayan), O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0,3 mmol 0,3 mmol listelenen Ekle Hidroksi-1H-benzotriazol, monohidrat (HOBt) ve diisopropylethylamine (DIPEA) 0.6 mmol. Reçine ile çift 30 dk için çözüm rock.
- Bu adım TNBS testi ile kontrol edin. Sonuç pozitif çıkarsa, bu tepki değil yeterince ilerlemiştir ve bu adımı tekrarlanması gerekir anlamına gelir.
- Reçine üç kez DMF 5 mL ile yıkayın.
- Uzama tepki adımları yineleyerek 1.2-1.6, değiştirme Tablo 2göre 1.5 adımda kullandığınız Fmoc bileşik yineleyin.
- % 2.5 su, 1 mL ekleyin %1 triisopropylsilane (TIS) ve % 2.5 ethanedithiol (EDT) trifluoroacetic asit peptidlerin reçine ve koruma grupları ayırmak için. Rock 60 dk için çözüm.
- Filtre ve filtrate 50 mL tüp içinde toplamak.
- 40 mL soğuk dietil etanol ve mağaza gecede-20 ° C'de ekleyin
- -20 ° C'de 30 dakika süreyle santrifüj 4.000 x g Pelet toplamak.
- 3 h için bir desiccator dietil eter kaldırmak için kullanın.
- % 50 Asetonitril 1 mL su ekleyin ve ham peptidler geçiyoruz. Trifluoroacetic asit kaldırmak için çözüm lyophilize. Bu adımı birkaç kez yineleyin.
-
C18 kartuş sütun kullanarak peptidler arındırmak.
- 3 mL Asetonitril (ACN) kullanarak C18 kartuş sütunundaki reçine etkinleştirin.
- 5 mL %5 ACN, % 0,1 TFA H2O. ile equilibrate
- Ham sentetik peptidler C18 kartuş sütuna yerleştirin.
- 10 mL %5 ACN, % 0,1 TFA H2o yıkayın
- %60 3 mL örnekleriyle elute ACN, % 0,1 TFA H2O.
-
Peptidler MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanarak kendi moleküler ağırlığı ölçerek kontrol edin.
- Eluent bir hedef plaka üzerinde 1 µL pipet. Hemen % 0,1 trifluoroacetic asit % 50 Asetonitril doymuş α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm ekleyin
- Karışımı air-drying tarafından kristalize.
- Araç üreticisinin protokolüne göre örneklerin kitle spectra elde etmek.
- El ile ayarlamak için olumlu bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre modu yansıtmak.
- CHCA kullanarak kütle spektrometre kalibre, bradikinin parçası 1-7 (monoisotopic molekül ağırlığı 756.3997 Da =) ve Anjiyotensin II (monoisotopic molekül ağırlığı 1,045.5423 Da =).
- Sentetik peptidler kitle spectra alacak ve kuramsal moleküler ağırlığı ile karşılaştırarak değerlendirmek.
2. doku özleri hazırlanması
- Erkek ICR fareler bir isoflurane inhalasyon odasında anestezi ve anestezi derinliği ayak tutam ile doğrulayın. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi.
- Makas kullanarak, cilt xiphoid süreci kadar uzanan aracılığıyla bir karın ensizyon olun.
- Diyafram kesin ve tüm akciğer doku toplamak. Doku küçük parçalar halinde kesin.
- Doku buz gibi 50 mM Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (pH 7,4) ile üç kez yıkayın.
- Doku ve bir 12 x 75 mm2 cam tüp 100 mg dokuların aktarmak tartın.
- Ayıklama arabellek (50 mM Tris-arabellek, % 0,1 poli (oxyethylene) octylphenyl eter içeren pH 7.4,) 0.3 mL ekleyin.
-
Bir karıştırma homogenizer kullanarak akciğer doku örnekleri lunaparkçı.
- Buz üzerinde örnekleri ne yapıyorsun?
- Örnekleri için 30 20.000 rpm'de homojenize bir karıştırıcıda s. Tamamen homojen olduğu kadar bu adımı yineleyin.
Not: sıcaklık artışı önlemek amacıyla sürekli olarak daha fazla 1 dakikadır homojenize değil.
- Homogenate 1000 µL 1,5 mL tüp ve santrifüj 10.000 x g 4 ° C'de, 5 min için transfer
- 500 µL süpernatant ile yeni bir 1,5 mL plastik tüp aktarın.
- Örnek 10 µL protein konsantrasyonu, bicinchoninic asit (BCA) gibi yöntemler veya Coomassie parlak mavi (CBB) yöntemini kullanarak belirlemek için kullanın.
- Donma önlemek için örnekleri % 50 gliserol son bir konsantrasyon için % 80 gliserol ekleyin.
- -80 ° C'de örnekleri daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
3. sindirim yüzeylerde modeli proteaz ve doku ayıklar
-
0.1 µg/µL N-tosyl-L-Fenilalanin chloromethyl keton (TPCK) 10 µL eklemek-tripsin, 0.1 µg/µL Staphylococcus aureus V8 proteaz veya 10 µg/µL doku özler bir sindirim arabellek 890 µL içine.
- Proteaz özgüllük bağlı olarak pH farkı açıklamak için pH 3, 5, 7 ve 9 ayarlanabilir arabelleklerini kullan. Sindirim arabellek bileşimi Tablo 3' te gösterilmiştir.
- Etkin olmayan proteaz doku özleri, 10 dakikadır kuluçka kaynar su (veya ısıtma 100 ° c) tarafından hazırlanan kullanarak bir negatif kontrol yerine getirir.
- İminobiotin etiketli yüzeylerde 10 µL ekleyin (dimetil sülfoksit (DMSO), nihai toplama çözünmüş 100 pmol/10 µL =).
- 37 ° C'de iminobiotin etiketli yüzeylerde sindirmek için 3 saat kuluçkaya.
- Kuluçka sonra yüzeylerde kaynar su ile (veya ısıtma 100 ° c) sindirim 10 dakikadır durdurmak.
- Sindirilir yüzeylerde, 10.000 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
- Süpernatant yeni 1,5 mL tüp içine aktarın.
4. Iminobiotin etiketli substrat saflaştırılması
-
50 µL % 50 streptavidin sepharose boncuk 1 M Tris-tampon (pH 9) kapsayan %0,1 poly(oxyethylene) octylphenyl eter içinde ekleyin.
- Çözüm pH 9 olması için pH test kağıt kullanın. Çözüm pH düşükse, pH yaklaşık 9 1 M Tris-tampon (pH 9) kapsayan %0,1 poly(oxyethylene) octylphenyl eter ekleyerek ayarlayın. Bu adım önemlidir, iminobiotin etiketli substrat streptavidin için bağlama karıştırmak gibi.
- Gecede 4 ° C'de sürekli nazik iminobiotin etiketli yüzeyler için streptavidin bağlamak için bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile kuluçkaya. Boncuk kuluçka asılı kalması gerekir.
- 10.000 x g 4 ° C'de, 1 dk santrifüj Süpernatant kaldırın.
-
Boncuk aşağıdaki gibi beş kez yıkama:
- Bir yıkama arabellek (50 mM Tris-tampon, pH 9) 1.000 µL boncuk için ekleyin.
- 4 ° C'de sürekli nazik bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile 10 dakika yıkayın. Boncuk kuluçka asılı kalması gerekir.
- 10.000 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
-
100 µL % 0,2 trifluoroacetic asit için boncuk ekleyin.
- Çözüm pH 2 olması için pH test kağıt kullanın. Çözüm pH yüksek ise, için pH 2 aşağıda %1 trifluoroacetic asit ekleyerek ayarlayın.
- Sürekli nazik bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- 10.000 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi, sonra yeni bir 1,5 mL tüp süpernatant transfer.
5. örnek hazırlama ve matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF Kütle spektrometresi)
Not: Aşağıdaki adımlarda tüm çözümleri ile yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) hazırlanmalıdır-sınıf veya amino asit sıralama-grade su.
- Asetonitril etkinleştirmek için C18 reçine üzerine 500 µL pipet. Kullanılan Asetonitril kaldırın. Bu üç kez tekrarlayın.
- C18 reçine 100 µL % 0,1 trifluoroacetic asit ile equilibrate. Eluent kaldırın. Bu üç kez tekrarlayın.
- Örnekleri yüklemek için bir pipet kullanarak reçine örnekleri bağlayın.
- Reçine 20 µL % 0,1 trifluoroacetic asit ile yıkayın. Bu beş kez tekrarlayın.
- Örnekleri 3 µL % 60 Asetonitril %0,1 trifluoroacetic asit ile elute. Eluent MALDI-TOF Kütle spektrometresi için hedef tabakta pipette. Hemen doymuş α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm % 50 Asetonitril %0,1 trifluoroacetic asit ekleyin.
- Karışımı air-drying tarafından kristalize.
-
Araç üreticisinin protokolüne göre örneklerin kitle spectra elde etmek.
- El ile ayarlamak için olumlu bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre modu yansıtmak.
- CHCA kullanarak kütle spektrometre kalibre, bradikinin parçası 1-7 (monoisotopic molekül ağırlığı 756.3997 Da =) ve Anjiyotensin II (monoisotopic molekül ağırlığı 1,045.5423 Da =).
- Örnekleri yakın kitle spectra 700 üzerinden 900 savcıya biotin etiketli yüzeylerde cleaved form için dikkat, kitle spectra elde etmek.
- Tablo 1kullanarak algılanan doruklarına tanımlayın. Uygun moleküler ağırlık tespiti C-terminus ilgili amino asit, bölünme gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteaz özgüllük modeli proteaz tarafından tanımlanması için yöntem değerlendirilmesi
Bu sistemin verimliliği TPCK-tripsin ve V8 proteaz olan substrat özelliklerine elde edilmiştir, kullanılarak değerlendirilmiştir. TPCK-tripsin ve V8 proteaz amino asit dizisi lizin ve arginin kalıntılarının C terminalinde ve carboxy yanında aspartik asit ve glutamik asit kalıntıları eklenmesi, sırasıyla ayırmak için tahmin edilmiştir. Tablo 1 substrat kuramsal moleküler ağırlığı gösterir ve parçaları tarafından belirli proteaz i ciddi sindirilir. TPCK-tripsin kullanarak substrat sindirim i ciddi parçaları, ikisi de 839.81 Da ve 796.76 Da (Şekil 2A) tespit edilemedi üretti. Bu parçaları moleküler ağırlıkları yakından lizin ve arginin, C-terminal sırasıyla i ciddi parçaları doğrultusunda kuramsal moleküler ağırlıkları vardı. Buna ek olarak, V8 proteaz 769.78 Da ve teorik m/z glutamik asit ve aspartik asit, sırasıyla eşleşen 755.62 Da (Şekil 2B), moleküler ağırlıkları ile cleaved formlarını habercisi yüzeylerde dönüştürülür. Bu sonuçlar bu yöntem başarıyla proteaz özgüllük MALDI-TOF Kütle spektrometresi ile tanımlamak için kullanılan gösterir.
Substrat özgüllüğü fare akciğer kullanarak farklı pH seviyeleri itibariyle değerlendirilmesi ayıklar
Bu teknik avantajları çok sayıda örnekleri aynı anda işlenebilir biriydi. Bu çalışmada substrat özgüllüğü pH seviyesi (Şekil 3) göre değişiklik göstermiştir. Asidik ortamlarda (Şekil 3B; pH 5), cleaved bir parçası molekül ağırlığı 770.13 Da ve 826.66 Da oldu. Bu sonuçlar akciğer doku özü proteaz glutamik asit ve triptofan terminus C bölmek için yeteneği ile yer alan belirtti. Yavaş yavaş arttı, pH seviyesi glutamik asit tarafından i ciddi parçaları ve yavaş yavaş azaldı, arginin ve lizin tarafından yavaş yavaş i ciddi parçaları doruklarına artış ise triptofan (Şekil 3C, D; pH 7 ve 9) doruklarına olarak. Bu sonuçlar akciğer özü farklı optimum pH ve bölünme özelliklerine vardı iki veya daha fazla proteaz bulunan belirtti.
Şekil 1: şema proteaz özgüllük algılanması için. (A) iminobiotin etiketli substrat proteaz özgüllük yapısını. (B) iminobiotin, Polietilen glikol ayırıcı ve bir yarilabilir amino asit site yüzeylerde vardı. (C) iminobiotin etiketli yüzeylerde spectra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: saf bir enzim kullanarak proteaz özgüllük belirlemek için değerlendirme yöntemi. (A)spectra iminobiotin etiketli yüzeyler için tedavi TPCK-tripsin ile. 839.81 ve 796.76 doruklarına parçaları sırasıyla bölünme lizin ve arginin, C-terminal tarafında oluşturduğu kuramsal moleküler ağırlığı eşleştirdi. (B) iminobiotin etiketli yüzeyler için spectra V8 proteaz ile tedavi. 769.78 ve 755.62 doruklarına parçaları sırasıyla bölünme glutamik asit ve aspartik asit, C-terminal tarafında oluşturduğu kuramsal moleküler ağırlığı eşleştirdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: doku kullanarak proteaz özgüllük ayıklar belirlemek için değerlendirme yöntemi. İminobiotin etiketli yüzeylerde akciğer dokusu ile tedavi için spectra ayıklayın. Bu spectra(a)pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7 ve (D) pH 9 elde edilen doruklarına göster. (E) iminobiotin etiketli yüzeylerde non-spesifik sindirim değerlendirmek için ısıl işlem ile inaktive doku özü ile inkübe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| X | Öncü | İ ciddi formu |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Ben * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa formu | ||
Tablo 1: kuramsal moleküler ağırlığı iminobiotin etiketli yüzeylerde ve beklenen moleküler ağırlık, proteaz parçacıkları. Yıldız işareti (*) D-serin ilavesi polietilen çıta ve yarilabilir amino asit arasında gösterir.
| Xaa: Gly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, Leyi, Asp, Gln, Glu, onun, Phe, Arg, Tyr | |||
| Sahne | Fmoc-bileşik | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys, Ile, Asn, Lys, bir araya geldi, Trp | |||
| Sahne | Fmoc-bileşik | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tablo 2: Substrat sentezi için kullanılan reaktifler sıralı listesi.
| pH | kompozisyon | ||
| 9 | 50 mM 0.1 M NaCl içeren Tricine ve 10 mM CaCl2 | ||
| 7 | 50 mM Tris-HCl 0.1 M NaCl içeren ve 10 mM CaCl2 | ||
| 5 | 0,1 M NaCl ve 10 mM CaCl2 içeren 50 mM sodyum asetat | ||
| 3 | 50 mM sitrik asit 0.1 M NaCl ve 10 mM CaCl2 içeren | ||
Tablo 3: Besteleri kullanılan tampon çözeltiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı MALDI-TOF Kütle spektrometresi proteaz özgüllük doku özler elde edilen ham örneklerinde tanımlamak için kullanır ve kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli. Özellikle, pH substrat özgüllüğü bir değişiklik neden manipüle.
Yaygın Biyokimya onun bağlama özgüllüğü nedeniyle kullanılmıştır, avidin-biotin karmaşık (ABC) yöntemi, bizim iletişim kuralında kullanılmıştır. ABC güçlü yakınlığı nedeniyle, avidin biotin için bağlama neredeyse tedavi edilemez. Benzeşme arıtma ABCs için bu nedenle son derece verimli değildir. Bu nedenle, biz kurtarma oranı için biotin etiketli yüzeylerde düşük olması bekleniyor raporu. Bu çalışmada, biz sadece kullanılan düşük pH düzeyi elüsyon için; Ancak, deglycosylated avidin-reçine13 ya da monomeric avidin-reçine14 de biotin etiketli yüzeylerde arındırmak için kullanılabilir.
Bu çalışmada önerilen yöntem farklı deneysel sistemleri ve uygulamaları için ayarlanabilir; Rulman MALDI-TOF Kütle Spektrometre kantitatif analiz yapmak mümkün olduğunu unutmayın. Bir kez substrat özgüllüğü belirlendikten sonra miktar spektrometrik deneyleri, Fluorometrik deneyleri veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak gerçekleştirmek için daha iyi olabilir.
Kütle spektrometresi kalibrasyonu Bu protokol konusunda en önemli adım olduğunu. Nerede yüzeylerde benzer moleküler ağırlıkları ile tespit edilir durumda, sonuçlarının doğruluğunu öncüleri molekül ağırlığı ekleyerek geliştirilmiş.
Bu yana enzim reaksiyon zamanla gelişmiş, enzim algıladıysa tepki süresini uzatmak mümkündür. Ancak, daha 24 h devam tepki izin istenmeyen zirveleri oluşturan yan reaksiyonlar sonucu. Bu nedenle, en fazla 18 saat için tepki gerçekleştirmek için tavsiye edilir veya örnekleri test ısı kullanarak denetlemek için tedavi. Bu yordamı içinde bir kaç femtomol tripsin proteaz özgüllük belirleyebilir.
Sonuç olarak, iminobiotin etiketli yüzeylerde proteaz özgüllük değerlendirmek için kullandığı uygun bir yöntem sunar. Bu yöntem birden çok örneği aynı anda işleme için izin verir ve proteaz tarama basitleştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Nihon ilaç Üniversitesi Araştırma Bursu Nihon ilaç Üniversitesi (2016) ve MEXT KAKENHI Grant numarası JP17854179 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
