Summary
이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.
Abstract
동안 CD133+ 조 혈 줄기 세포 (SCs) 재생 의학 분야에서 높은 잠재력을 제공 하기 위해 입증 되었습니다, 그들의 낮은 유지 비율 관찰된 대규모 세포 사망률 부상된 조직에 주입 후 매우 제한 된 치료 효과입니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 그들의 관리에 앞서 적당 한 셀 엔지니어링에 대 한 비 바이러스 성 기반된 프로토콜을 확립 하고자 했다. 인간의 CD133 수정+ 셀의 대상 잠재력 뿐만 아니라 통풍 관 효율 및 안전에 관하여 해결 SCs 예측에 관한 (미르) 로드 자석 polyplexes를 사용 하 여 표현. 우리의 프로토콜에 의존, 우리는 CD133 동안 80-90%의 높은 미르 통풍 관 비율을 달성할 수 있는+ 줄기 세포 속성을 받지 않습니다. 또한,이 수정 된 세포는 자기 대상의 옵션을 제공합니다. 우리 여기 CD133의 수정에 대 한 안전 하 고 매우 효율적인 절차 설명+ SCs. 우리는 줄기 세포 치료 효과의 최적화에 대 한 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 관리 셀 제품의 모니터링을 위한 표준 기술 제공이 접근을 기대 합니다.
Introduction
CD133+ 이종 줄기 재생 의학에 대 한 잠재력 약속 된 조상 세포 인구를 대표 하는 SCs. 그들의 조 혈, 내 피, 및 조직적 분화 잠재적인1,2,3 수는 CD133+ 세포, 예를 들어, 차별화를 통해 neovascularization 프로세스에 기여 하 으로 새로 형성 선박 및 프로-신생 paracrine 메커니즘4,5,,67에 의해 신호의 활성화.
30 개 이상의 승인 된 임상 시험 (ClinicalTrails.gov)에서 그들의 높은 잠재력에도 불구 하 고 그들의 치료 결과 중인 여전히 논쟁 적인 토론4. 실제로, SCs의 임상 응용 프로그램 낮은 보존 관심과 대규모 초기 세포 죽음5,,89의 기관에 의해 방해 된다. 추가 CD133의 엔지니어링+ SCs 사전 이식 이러한 난제를 극복 도움이 될.
효율적인 세포 치료에 대 한 전제 조건 치료 관련 셀10engraftment를 향상 시키기 위해 대규모 초기 세포 죽음의 감소 될 것 이다. 현재 연구 시연 첫 1-2 h, 이식된 세포 유형의 독립적인 동안 매우 끼얹는다 뇌와 심장 등 장기에 90-99%의 엄청난 셀 손실 또는 응용 프로그램 경로11,12,13 14,15,16,17,18,19,,2021. 관심22,23,,2425,26의 사이트에 대상 셀에 혁신적인 비-침략 적 전략을 가능 하 게 SC 마그네틱 나노 (MNPs)를 사용 하 여 라벨 고 동시에 셀 MRI27 (MPI) 이미징 자성 입자를 사용 하 여 모니터링 하는 것을 허용 한다. 가장 효율적인 vivo에서 정 맥 주입23,,2428 후 셀 지도 보다 로컬 관리 후 사용한 셀 보존 대상 적용 자성된 셀 연구 . 따라서, 우리의 그룹 superparamagnetic 산화 철 나노 입자29의 구성 된 배달 시스템을 설계. 이 기술로, CD133+ SCs와 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 대상 효율적으로 수, 여 체 외에 시도30,31.
사우스 캐롤라이나 요법에 대 한 또 다른 장애물 초기 세포 죽음32에 기여 하는 이식 후 영향을 받는 조직의 적대적인 염증 성 환경입니다. 여러 사전 컨디셔닝 연구 뿐만 아니라 치료 관련 미르의 응용 프로그램은 테스트33; 그것은 성공적으로 입증 되었습니다 안티 apoptotic 미르 생체 외에서 apoptosis를 억제 고 vivo에서세포 engraftment33을 강화. 이 작은 분자, 20-25의 뉴클레오티드로 구성 메신저 RNAs (mRNAs)의 posttranscriptional 변조기로 서 중요 한 역할을 하 고 따라서 줄기 세포 운명과 행동34를 영향을. 또한, 미르 세 도입 호스트 게놈34에 원치 않는 안정적인 통합을 하지 마십시오.
기본 SCs에 핵 산 (NAs)의 효율적인 도입에 대 한 현재 시도 주로 재조합 바이러스8,35기반으로 합니다. 높은 transfection 효율에도 불구 하 고 재조합 바이러스 조작은 벤치를 머리 맡 번역, 예를 들면, 통제 유전자 발현, pathogenicity, immunogenicity, 및 insertional mutagenesis35에 대 한 주요 장애물이 선물 ,36. 따라서, 폴리머 기반 구조 등 비 바이러스 성 전달 시스템 개발에 중요 하다. 그 중에서 polyethylenimine (페이) 저하, 세포질 통풍 관에서에서 보호 하기 위해 나 결로 등 미르에 대 한 혜택을 제공 하는 유효한 배달 차량 나타내고 endosomal 통해 세포내 릴리스 탈출37,38. 또한, 미르-페이 단지 임상 시험39높은 생체 적합성을 설명 했다. 따라서, 우리의 배달 시스템은 biotinylated의 구성 분기 25 kDa 페이는 streptavidin 입히는 MNP 코어30,,3140에 바인딩된.
이 원고에서는 CD133의 (i)는 수동 격리를 설명 하는 포괄적인 프로토콜 소개+ 사우스 캐롤라이나 사우스 캐롤라이나 제품과의 효율적이 고 부드러운 transfection 전략 (ii)의 상세한 묘사와 인간의 골 수 (BM) 기부에서 한 자석으로 비 바이러스 성 고분자 기반 배달 시스템 CD133의 유전 공학에 대 한+ SCs 미르를 사용 하 여. CD133+ SCs 격리 되며 표면 항 체 기반 자기 활성화 셀 정렬 (맥) 시스템을 사용 하 여 인간의 sternal BM aspirates에서 자석으로 농축. 이후에, 세포 생존 능력 뿐만 아니라 셀 순도 cytometry 사용 하 여 분석 된다. 그 후, 미르/PEI/MNP 단지 준비가 CD133+ SCs는 페. transfection 후 18 h, 통풍 관 효율성과 transfection SC 마커 표현과 세포 생존 능력에의 영향 분석 된다. 또한, transfection 복잡 한 화합물의 세포내 분포의 평가 4 색 레이블 및 구조화 조명 현미경 (SIM)를 사용 하 여 수행 됩니다.
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Protocol
셀 격리에 대 한 sternal 인간 BM 헬싱키 선언에 따라 연구에 대 한 그들의 샘플을 사용 하 여 그들의 서 면된 동의 준 정보 기증자 로부터 얻은 것입니다. Rostock의 대학 윤리 위원회 제시 연구 (등록 번호 A 2010 23, 2015 년에 연장)을 승인 했습니다.
1. 세포 준비
참고: BM 시험에 대 한 응고를 방지 하기 위해 헤 파 린 나트륨 (250 IU/mL BM)를 사용 합니다.
- CD133+ SC 절연
- 필요한 솔루션의 준비
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 준비/ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) EDTA (0.5 M)의 4 mL와 1 x PBS의 996 mL를 혼합 하 여 솔루션 (2 mM) 재고. 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 여과. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
- 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 5 g 2mm PBS/EDTA의 995 mL를 혼합 하 여 맥 버퍼를 준비 합니다. 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 여과. 4 ° c.에 게
- 12.5 ml PBS의 콜라 ( Clostridium histolyticum)에서 B의 500 mg을 diluting 하 여 콜라 B 재고 솔루션 (40 mg/mL)를 준비 합니다. 적극적으로 솔루션을 혼합, 350 µ L의 aliquots를 확인 하 고,-20 ° c.에 저장
- Deoxyribonuclease (DNAse) 100mg DNase diluting 하 여 솔루션 (10 mg/mL)을 재고 준비 PBS의 10 ml에서 (소 췌 장)에서 나. 적극적으로 솔루션을 혼합, 350 µ L의 aliquots를 확인 하 고,-20 ° c.에 저장
- 인간의 BM의 효소 소화
- 미리 따뜻한 인간 림프 구 매체 rt 하 고 효소 (1 약 수 각 콜라 B와 DNAse의 20 mL BM 당) 해 동.
- 50 mL 원뿔 튜브에 주사기에서는 BM을 수집 하 고 부드럽게 혼합. 모든 기존 혈전을 삭제 합니다.
참고: 이후 흐름 cytometric 분석에 대 한 1.5 mL 튜브에 undiluted BM의 200 µ L을 전송. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다. - 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 10 mL BM, DNAse의 6 mL PBS/EDTA (2mm), 인간 림프 구 매체, 콜라 b (40 mg/mL), 175 µ L 175 µ L의 20 mL의 추가 나 (10mg/mL). 부드럽게 솔루션을 혼합 하 고 통에 RT에서 30 분 동안 품 어. 나머지 BM 샘플에 대 한 반복 합니다.
- 조밀도 기온 변화도 원심 분리
- 50 mL 튜브에 매체를 분리 하는 인간 림프 톨의 15 mL를 적용 하 여 50 mL 밀도 그라데이션 원심 분리 관을 프라임. 30에 대 한 1000 x g 에서 원심 분리기 s.
- 신중 하 게 레이어 밀도 그라데이션 원심 튜브 필터와 실시간에서 35 분 445 x g 에서 원심 분리기 희석된 BM의 35 mL
참고: 원심 분리기 설정은 낮은 가속도 (3) 그리고 아무 브레이크 (1). - 조심 스럽게 흔들어 없이 원심 분리기에서 튜브를 제거. 신중 하 게 필터 위에 직접 구름 레이어를 건드리지 않고 위 명확한 솔루션에서 ~ 20 mL를 버리십시오.
- 신중 하 게 새로운 50 mL 원뿔 튜브에는 흐림 레이어 (필터 위에 직접 이며 단 세포 (MNCs) 포함)을 전송 하 고 PBS/EDTA와 50 mL의 최종 볼륨을 채우기.
참고: 하나의 새로운 튜브로 한 BM 환자 샘플에서 모든 MNCs를 결합 합니다. - 1.5 mL 튜브에 10 µ L 50ml 셀 서 스 펜 션의 전송 하 여는 MNCs를 계산 합니다. 3% 아세트산 메 틸 렌 블루의 10 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고는 세 실에 10 µ L를 적용. MNCs의 수를 계산 합니다.
- 원심 분리기 MNC 정지 300 x g 에서 10 분에 대 한 폐기는 상쾌한.
참고: 원심, 동안 진정 4 ° c에서 RT 원심 분리기
- 마그네틱 다양 CD133+ SCs 인간의 CD133 항 체에 연결 된 superparamagnetic 철 dextran 입자를 사용 하 여
참고:이 단계 동안 얼음에서 작동. 4 ° c.에서 사용 될 때까지 저장소 솔루션 맥에서 영구 자석, 분리 열, 및 4 ° c.에 사전 분리 필터 저장- 열 크기를 선택 합니다. < 108 MNCs, 열 사용 MS, x 그리고 1.2 > 1.2 x 108 MNCs LS 열 ( 재료의 표참조)을 사용.
- 1 x 108 총 셀 수에 대 한 자기 선택의 준비, 신중 하 게 300 µ L 맥 버퍼 (4 ° C)에 MNCs를 resuspend. 100 µ L FcR 차단 시 약 (4 ° C) 및 100 µ L CD133 항 체에 연결 된 superparamagnetic 철 dextran 입자 (4 ° C)를 추가 합니다.
- 부드럽게 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 부드럽게 인큐베이션 (2-3 배) 동안 세포 현 탁 액을 흔들어.
- 1 x 108 총 MNCs. 부드럽게 믹스 셀 서 스 펜 션 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 당 맥 버퍼 (4 ° C)의 2 개 mL를 추가
- 맥 자석 홀더를 설정 하 고 연결 맥 영구 자석. 맥 열을 설치 하 고 위에 사전 분리 필터를 적용 합니다.
- 맥에서 MS/LS의 첫 번째 열 및 사전 분리 필터 0.5 mL (MS) 또는 맥 버퍼 (4 ° C)의 3 mL (LS) equilibrate.
참고: 결코 평형 후 건조 맥 열 수 있습니다. - 삭제는 상쾌한 고 1 x 108 총 셀 금액 당 맥 버퍼 (4 ° C)의 500 µ L에서 얻은 펠 렛 resuspend. 사전 분리 필터에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.
- 세 번 사용 하 여, 각 세척에 대 한 0.5 mL (MS) 맥 열 및 사전 분리 필터 세척 또는 3 mL (LS) 맥의 버퍼 (4 ° C).
참고: 세 번째 세척 단계 동안 맥 영구 자석으로 두 번째 MAC 열을 설치 하 고 0.5 mL (MS) 또는 3 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C)와 두 번째 맥 MS/LS 열 equilibrate. - 사전 분리 필터를 삭제 합니다.
- 두 번째 MAC 열에 직접 셀 분수 elute: 1 mL (MS) 또는 첫 번째 MAC 열에 5 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C)에서 추가 및 제거 맥 열 맥 영구 자석. 즉시 두 번째 MAC 열 위에 첫 번째 MAC 열을 전송 하 고 제공 된 플런저를 사용 하 여 맥 열 통해 세포 현 탁 액을 밀어.
- 씻어 맥 열 세 번 각 씻어 0.5 mL (MS)에 대 한 사용 하 여 또는 3 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C).
- 1 mL (밀리초) 또는 두 번째 MAC 열에 5 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C)를 추가 하 고 맥 영구 자석에서 맥에서 열을 제거 하 여 열에서 셀 분수 elute. 즉시 1.5 mL 튜브 (MS) 또는 15 mL 원뿔 튜브 (LS) 위의 두 번째 MAC 열을 전송 하 고 제공 된 플런저를 사용 하 여 맥 열 통해 세포 현 탁 액을 밀어.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 맥 버퍼 (4 ° C)의 100 µ L에서 얻은 펠 렛 resuspend.
- 계산에서 CD133+ 셀: 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 전송 6 µ L. 6 µ L trypan 블루 솔루션 (0.4%)를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고는 세 실에 10 µ L를 적용. CD133 수 계산+ 세포.
- 저장은 CD133+ 시드까지 얼음에 세포.
- 필요한 솔루션의 준비
- 갓 격리 CD133의+ SCs
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에. 달리 명시 하지 않는 한 튜브, 버퍼, 그리고 얼음에 항 체를 유지.- 흐름 cytometric 분석을 위해 SCs의 준비
- 두 개의 샘플 (각 10 µ L) BM aliquots의 갓 격리 CD133의 하나의 샘플을 사용 하 여+ SCs (최소, 1 x 104 셀) 분석에 대 한. 1.5 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. FcR 차단 시 약의 10 µ L을 추가 하 고 33 µ L의 볼륨에 맥 버퍼 (4 ° C)를 함께 기입.
- 각각의 안쪽에 다음 항 체를 추가 ( 표 1참조) 튜브: 안티-CD34-fluorescein isothiocyanate (FITC) (클론: AC136), 안티-CD133/2-phycoerythrin (PE) (클론: 293C 3), isotype PE-마우스 IgG 2b, 제어 안티-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (복제: 2 D 1), 및 7-aminoactinomycin (AAD). 모든 항 체 추가한 후 튜브의 항 체 아래로 흔들. 부드럽게 혼합 솔루션 (최종 볼륨 50 µ L)와 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
- 1 x 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가, 부드럽게 혼합, 현 탁 액 및 얼음 10 분 4 ° c.에서 10 분 원심 분리기 300 x g 에서 서 스 펜 션에 품 어
- 삭제는 상쾌한 고 100 µ L PBS (4 ° C)에서 얻은 펠 렛 resuspend. 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 저장 합니다.
- Cytometric 분석 CD133의 흐름+ SCs
- 세포 생존 능력 및 CD133의 순도 검사를+ 사우스 캐롤라이나는 Hematotherapy의 적응된 국제 사회 및 이식 엔지니어링 (ISHAGE) 흐름 cytometry 제어 전략41 (참조 그림 1에 대표적인 묘사)를 사용 하 여. 다음과 같은 순서를 사용 하 여:
1 단계: 다양 한 세포 인구 (그림 1A)
단계 2: 선택의 CD45+ 세포 (그림 1B)
단계 3: 선택 가능한 CD45의+ 세포 (그림 1C)
4 단계: 선택 가능한 CD45의+/CD34+ 세포 (그림 1D)
5 단계: 선택 가능한 CD45의+/CD34+/CD133+ 세포 (그림 1E)
실행 흐름 cytometer ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라. - 세포 생존 능력 및 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 순도 계산.
- 세포 생존 능력 및 CD133의 순도 검사를+ 사우스 캐롤라이나는 Hematotherapy의 적응된 국제 사회 및 이식 엔지니어링 (ISHAGE) 흐름 cytometry 제어 전략41 (참조 그림 1에 대표적인 묘사)를 사용 하 여. 다음과 같은 순서를 사용 하 여:
- 흐름 cytometric 분석을 위해 SCs의 준비
공식 1
공식 2
-
세포 배양의 갓 격리 CD133+ SCs
- 재조합 인간 cytokine x aliquot 100 100 µ L aliquots에 보충 하 고-20 ° c.에 저장 중간 준비 하기 전에 해 동 한 100 x 약 수.
- 준비는 CD133+ SC 배양, 혈 청 무료 조 혈 세포 확장 중간 재조합 인간 cytokine 보충 (최종 1 x)와 1% 페니실린/스 보완.
- 씨앗 5 x 104 갓 CD133 절연+ SCs 500 µ L 문화 매체와 24-잘 접시에서 transfection에 대 한. 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 셀을 품 어.
참고: 씨앗 5 x 104 갓 절연 CD133+ SCs 제어 흐름 cytometric 분석에 대 한.
2입니다. Transfection 복합물의 준비
참고:이 단계 동안 계속 전체 작업 공간 ribonuclease (RNAse)-RNAse 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 자유롭고만 RNAse 소모품 소재를 사용 하 여.
-
미르의 준비
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
참고: 미르-표본에 대 한: 사용 Cyanine 3 염료 라는 전조 미르와 레이블이 전조 미르.- 미르 재고 솔루션 (50 µ M)를 준비 하려면 적절 한 양의 nuclease 무료 물 (예를 들어, 100 µ L 물에 미르의 희석 5 nmol)에서 미르의 원하는 금액을 희석. 부드럽게 혼합 솔루션, aliquot 미르 주식 (5 µ L), 및-20 ° c 저장
-
PEI의 준비
- 표준 프로토콜 및 참고는 페이 재고 농도31,42 페이 준비 합니다.
-
MNP의 준비
- 표준 프로토콜에 따라 MNPs를 준비 하 고 MNP 재고 농도31,42합니다.
-
미르/페이 복합물의 준비
- Diluting D-(+) 하 여 5% 포도 당 용액을 준비-nuclease 무료 물 포도 당. 부드럽게 혼합 솔루션, aliquot 주식 (1.5 mL), 및 4 ° c.에 저장
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에. - 24-잘 접시30의 당 20 pmol 미르를 사용 합니다. 미르 미르 0.25 pmol / µ L의 최종 농도에 5% 포도 당 용액에 희석.
- 페이 필요한 양의 미르 금액 (20 pmol, 단계 2.3.1)와 기반 (미르)의 인산 염 하 (PEI)의 최적 질소 (N/P) 비율은 페이 재고 농도에 따라 계산 (2.2.1; 단계 여기, 7.5의 비율 사용 되었다)30. 방정식에 따라 5% 포도 당 솔루션의 동일한 금액에서 페이 희석:
이를 다시 정렬
식 3
여기서 페이 볼륨은 µ L에 [페이]는 m m, 그리고 N/P (이 프로토콜에 대 한 최적화)는 0.75. 0.12 미르 관련 변환 요소 이다입니다. - 미리 희석된 미르와 30에 대 한 소용돌이에 미리 희석된 페이 추가 s.
- 미르/페이 실시간 30 분에 대 한 복잡 한을 품 어
- Diluting D-(+) 하 여 5% 포도 당 용액을 준비-nuclease 무료 물 포도 당. 부드럽게 혼합 솔루션, aliquot 주식 (1.5 mL), 및 4 ° c.에 저장
-
미르/PEI/MNP 복합물의 준비
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.- 잠복기 동안 미르/페이 단지 sonicating MNPs는 입자에에서는 되도록 RT에서 sonicating 물 목욕에서 35 kHz에서 20 분 및 집계 하지는 MNPs를 준비 합니다.
- MNP 재고 솔루션 (2.3.1 단계)에 따라 필요한 MNPs (3 µ g 철/mL)의 수를 계산 합니다.
- Sonicated MNPs 미르/페이 단지 및 소용돌이에 대 한 추가 30 미 품 30 분 미르/PEI/MNP 단지 실시간에
-
준비를 위한 transfection 단지의 SIM을 사용 하 여 4 색 레이블 지정
참고: 레이블이 전조 미르를 사용 합니다.- Cyanine 5 염료를 사용 하 여 Cyanine 5 염료 미르 라벨 키트 ( 재료의 표참조)와 미르 라벨 제조업체의 지침에 따라. 나열 된 분 광 광도 계를 사용 하 여 최종 미르 농도 측정 ( 재료의 표참조) 제조업체 (핵 산, RNA-40)에서 제공 하는 사전 설정에 따라에서. 약 수 미르 (5 µ L)-80 ° C에 게 빛 으로부터 보호.
- 밝은 녹색 형광 염료 사용 하 여 적절 한 단백질 라벨 키트 ( 재료의 표참조) 페이 라벨 제조업체의 지침에 따라. 마지막 페이 농도 Ninhydrin 분석 결과 (2.2.1 단계)를 사용 하 여 정의 합니다. 약 수는 페이 (볼륨에서 계산에 따라 식 3) 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장.
- 1:1,000 w/w의 비율을 사용 하 여 비타민 b 복합체에 활용 된 rhodamine 염료는 MNPs 레이블, MNP를 염색. 미르/페이 복잡 한 대형의 준비 동시 rhodamine 염료 및 MNPs를 혼합 하 고 어둠 속에서 30 분에 대 한 솔루션을 품 어. 직접 사용 MNPs를 표시 합니다.
식 33. CD133 transfection+ SCs
참고:이 단계 동안 계속 전체 작업 공간 ribonuclease (RNAse)-RNAse 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 자유롭고만 RNAse 소모품 소재 사용
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
- 직접 갓 격리 CD133 포함 된 적절 한 우물에 dropwise 준비 미르/PEI/MNP 복잡 한 추가+ SCs 문화 매체에.
- 접시와 락으로 부드럽게 혼합. 18 h 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 대 한 셀을 품 어.
4입니다. 미르 Transfection의 분석
-
미르 글귀 효율성과 transfection 단지의 세포 독성 시험
참고: 미르-표본에 대 한: 통풍 관 평가 및 비 페 CD133 전조 미르 라는 Cyanine 3 염료를 사용 하 여+ SCs 흐름 cytometry 제어 게이츠에 대 한.
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
참고: 달리 명시 하지 않는 한 튜브, 버퍼, 그리고 얼음에 항 체 유지.- 4 g PFA 100 mL PBS에에서 희석 하 고 80 ° c.에 해결책을가 열 하 여 paraformaldehyde 재고 솔루션 (PFA, 4%)를 준비 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 pH 값 7.3 조정. Aliquot는 PFA (1.5 mL)을 재고 하 고-20 ° c.에 저장
- transfection 후 18 h, 수집 각 잘 별도 1.5 ml에서 튜브. 각 잘 한 번 PBS의 500 µ L을 세척 하 고 같은 튜브에 세포 현 탁 액이 전송.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 삭제는 상쾌한 고 4 ° C 맥 버퍼의 100 µ L에서 얻은 펠 렛 resuspend.
- 라이브와 죽은 세포를 구별, 부드럽게 혼합 하는 서 스 펜 션, 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 아민 반응성 염료의 0.5 µ L을 추가 300 x g 4 ° c.에서 10 분에 1 mL PBS (4 ° C) 및 원심 분리기를 추가
- 삭제는 상쾌한 100 µ L PBS에서 얻은 펠 릿 resuspend, 33 µ PFA (4%), L을 추가 하 고 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장.
- 그림 2에 대표적인 묘사에 따르면 제어 전략을 정렬 합니다. 교류 cytometer에서 샘플을 실행 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라.
-
미르 페 CD133의+ SCs
참고: 사용 레이블 없는 전조 미르로 비 페 CD133+ SCs 흐름 cytometry 제어 게이츠.- 수집 각각 별도 1.5 mL 튜브에 잘와 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심
- 1.2 단계에서 설명한 대로 제어 전략을 사용 합니다.
-
Transfection 단지 SIM에서의 세포내 분포 시험
- 단지를 준비 하 고 제 2 및 제 3에서 설명한 대로 셀을 transfect.
- 18 h는 transfection 후, 별도 1.5 mL에 각 잘 수집 튜브. 각 잘 한 번 PBS의 500 µ L을 세척 하 고 잘의 각 관으로 세척을 전송. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기
- 삭제는 상쾌한 고 PBS에 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)의 1 mL에 얻은 펠 릿 resuspend, 부드럽게 혼합, 현 탁 액 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심
- 삭제는 상쾌한, PBS의 100 µ L에서 얻은 펠 릿을 resuspend 하 고 20 분 33 µ L PFA (4%)를 추가 합니다.
- 불 임 유리 coverslips 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기를 포함 하는 새로운 24-문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송
- 삭제는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 흔들어 접시와 PBS를 삭제.
- 현미경 슬라이드 수성 설치 매체를 사용 하 여 형광을 유지 하 고 적어도 1 시간에 대 한 실시간에 그들을 건조 하에 준비 된 coverslips를 놓습니다.
- 100 X 기름 침수 목표를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. SIM 설정: 405, 488, 561, 및 여기와 3 각, 3 단계, 4, 격자 레이저 라인 당 평균 16-비트 깊이 z-스택 633 nm 레이저 라인: 23 µ m-405, 34 µ m-488, 42 µ m-561, 51 µ m-633.
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Representative Results
수동 격리와 인간의 BM 파생 CD133의 자석 농축 제시 프로토콜 설명+ SCs 후속 바이러스 독립 셀에 체 외에서 세포 조작 및 에 대 한 비-침략 적 기술 전략, 엔지니어링 vivo 모니터링 도구.
이 3 단계 절연 기술 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 미리 소화 sternal BM에서 MNCs의 분리를 허용합니다. 이후에, CD133+ 적절 한 격리 기술을 사용 하 여 셀 분수를 자석으로 농축 될 수 있다. 이로써 CD133의 농축+ SCs cytometry (그림 1)에 의해 결정 될 수 있는 80% 이상의 높은 순도와 생존 능력. 이 하,만 SC 제품 요구 사항을 일치 하는 추가 실험을 위해 사용 되었다.
여기에 설명 된 transfection 메서드를이 미르의 매우 효과적인 도입 갓 인간의 CD133 격리 수 있습니다+ SCs 가능한의 약 80%의 통풍 관과 세포 (그림 2)30. 더하여, 있다 아무 중요 한 세포 독성 효과 분명 18 h 후 transfection 제어에 비해 세포 (그림 2)30. 또한, 충분 한 배달 및 일반적인 유통 transfection 복잡 한 화합물 (미르, 페이, 그리고 MNPs)의 SIM (그림 3)를 사용 하 여 셀의 세포질 내에서 관찰할 수 있습니다.
그림 1: 대표 부울 CD133에 대 한 전략을 게이팅+ SC 특성화. (A-E) 세포 생존 능력에 대 한 엄격한 평가의 순 결에 대 한 5-단계 선택 전략의 묘사 절연 CD133+ SC 적절 한 치료 BM 샘플을 사용 하 여 (F) CD133 isotype 컨트롤 뿐만 아니라. (A) (B) CD45의 연속 선택 뒤에 앞 으로/사이드 (FSC/SSC) 도트 점도에 그대로 세포 인구에서 파편을 제외+ 인구, (C) 가능한 CD45 셀+ 세포 인구, (D) 가능한 두 배 긍정적인 CD45+/CD34+ 세포 인구, 및 (E) 가능한 트리플 긍정적인 CD45+/CD34+/CD133+ 세포 인구. 오렌지: CD45+/CD34+/CD133+ 각 선택 단계에서 강조 하는 세포. 전설: APC-Cy7: 안티-CD45, FITC: 안티-CD34, FSC: 앞으로 분산형 채널, PE: 안티-CD133, SSC: 사이드 분산형 채널, AAD 7: 7-aminoactinomycin. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 미르 통풍 관 효율의 평가 및 복잡 한 transfection의 세포 독성에 대 한 전략을 게이팅 대표. (A, B)의 제어 전략 페 CD133+ SCs 뿐만으로 (C, D) 비-페 CD133+ SCs (A, C)의 분석에 대 한 Cyanine3 염료 선구자-미르 글귀 효율성 (표시 빨간색: 가능한 Cy3+ 세포) 및 (B, D) transfection 절차의 세포 독성 효과 라이브 하 고 죽은 세포를 구별 하는 아민 반응성 염료에 의해 표시 (파란색: 죽은 세포). 전설: SSC: 사이드 분산형 채널, 세포만: 비 페 CD133+ SCs, 미르/PEI/MNP: CD133+ SCs Cy3 표시 된 미르와 페 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 복잡 한 transfection의 세포내 시각화. CD133+ SCs 미르/PEI/MNP 복잡 한 분류와 3 색 페 했다 (미르: 20 pmol, 페이: N/P 비율 7.5, MNP: 3 µ g/mL). 대표 시각화 transfection 구조화 조명 현미경을 사용 하 여 후 18 h는 수행 했다. 미르 Cyanine5 염료 (빨간색), 밝은 녹색 형광 염료 (녹색)와 PEI와 분류 되었다 그리고 rhodamine 염료와 MNPs (노란색), 비타민 b 복합체에 활용 된 핵 DAPI (파란색)와 counterstained 했다. 눈금 막대 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 샘플 | FCR 차단 시 [µ L] | 맥에서 버퍼 [µ L] | 항 체 [µ L] | 총 [µ L] | ||||||
| 번호 | 견본 | 셀 [µ L] | CD133-PE isotype | CD133-PE | CD34-FITC | CD45-APC-Cy7 | 추가 | |||
| 1 | BM | 10 | 10 | 12.5 | 5 | - | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 2 | BM | 10 | 10 | 12.5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 3 | CD133+ | (1 x 104) | 10 | 12.5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
표 1: CD133의 특성 Pipetting 레이아웃 + SCs.
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Discussion
최근 몇 년 동안, CD133+ SCs 등장 유망한 세포 인구로 SC 기반 요법으로 입증 단계 I, II, 및 III에 대 한 임상 시험43,44,,4546, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. 여기, 우리 인간의 sternal BM에서 이러한 셀의 표준화 된 수동 정화 및 흐름 cytometric 특성에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 설명된 맥 기반 격리 절차는 매우 순수 하 고 실행 가능한 조 혈 SC 분수를 부드러운, 빠르고, 효율적인 전략을 나타냅니다. 셀 정렬에 사용 되는 공동 주입된 맥 MicroBeads의 급속 한 저하와 함께 좋은 호환성 이전 우리의 그룹55,56에 의해 증명 되었습니다.
이 격리 절차 인간 sternal BM 소스 재료로 사용 하 여 개발 되었다 고 따라서 프로토콜은 현재 비 임상 연구에서 사용 하는 조 혈 SCs의 정화 수 있습니다. 만약 CD133+ SCs는 다른 조직 (예를 들어, 장 골도 머리에서 얻은 BM) 격리 효소 조직 소화와 밀도 원심 분리 같은 프로토콜의 여러 단계 적응을 해야 할 수도 있습니다. 임상 세포 응용 프로그램에 대 한 우리의 그룹 추가 GMP 적합 현장 제조 절차 설립 사용 하는 대신 임상 추가 요구를 만족 시키기 위하여 자동 시스템 필요57.
그들의 응용 전에 SCs의 공학 SC 치료, 낮은 세포 보존 및 대규모 세포 죽음을 포함 하 여 특정 장애물을 극복 하는 새로운 전략 이다. 현재 프로토콜 구성 분기 페이 바인딩된 MNPs는 CD133에 효율적인 도입에 따라 다기능 무료 바이러스 transfection 시스템의 생산에 대 한 지침+ SCs30. 이 시스템의 응용 프로그램 수 유전 셀 수정, 자석으로 제어 셀 지도, 및 비-침략 적 셀 추적 MRI 또는 MPI30,31,40,,4258 통해 , 59 , 60.
중요 한 것은, 설명된 transfection 조건 CD133의 변이 유전자 조작에 대 한 최적화 되었습니다+ BM 파생 SCs30. 이전 작품에서이 transfection 시스템도 성공적으로 적용 되었습니다 플라스 미드 DNA의 납품과 미르에 대 한 다른 세포 유형31,40,60. 이 실험은 transfection 효율 뿐만 아니라 세포 독성 세포 종류에 따라 다릅니다는 설명 했다. 따라서, NAs, 페이, 그리고 MNPs의 최적의 구성 각 세포 유형에 대해 정의 될 필요가 있다.
그것의 고 능률 때문에 페이 비 바이러스 성 유전자 세포61엔지니어링에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 고분자 중 하나입니다. 그러나, PEI의 임상 응용 프로그램,6162 63의 일반 독성61,때문에 날짜를 매우 제한 됩니다. 흥미롭게도, 우리의 그룹은 최근 MNPs 페이 독성 transfection 시스템31,60에 포함 감소 시연. 동시에 반응성 산소 종 (선생님)의 생산에 의해 발생 하는 기반 산화 철 나노 입자의 가능한 독성 복용량 종속적 이며 여러 종류 superparamagnetic 나노 입자의 MRI64,65에 대 한 승인 . 그러나, 시스템에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 독성에 주의 지불 한다.
전반적으로, 프로토콜은 매우 복잡 한, 포함 하는 매우 신중 하 게 다루어야 하는 많은 중요 한 단계. 이 목적을 위해 우리는 노트와 프로토콜 섹션에서 이러한 점을 강조 했습니다. 특히, 우리는 완전히 RNAse 무료 환경 및 적용 된 형광 염료를 처리할 때 어떤 빛 노출 방지의 중요성을 지적 하고자 합니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 연방 교육부 및 연구 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), EU 구조 기금 (ESF/IVWM-B34-0030/10와 ESF/IVBM-B35-0010/12), 주 Mecklenburg 서쪽 Pomerania 독일과 DFG (DA1296/2-1)에 의해 지원 되었다는 독일 심장 재단 (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) 고 젖은 기초. 또한, F.H. 및 오후는 FORUN 프로그램의로 스톡 대학 의료 센터 (889001)에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
| anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
| anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
| anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
| rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
| CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
| collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
| counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
| Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
| Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
| bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
| aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
| density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
| MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
| MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
| MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
| mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
| amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
| PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
| PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
| PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
| unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
| recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
| serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
| ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |
References
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