Summary
Aquí presentamos un protocolo que está diseñado para analizar la Unión de todo el genoma del oligodendrocyte del factor de transcripción 2 (Olig2) en células de cerebro agudo purificada oligodendrocyte precursoras (OPC) por la realización de inmunoprecipitación de cromatina baja-celular (ChIP) , preparación de biblioteca, alto rendimiento secuenciación y análisis Bioinformático de los datos.
Abstract
En células de mamífero, transcripción genética está regulado de una forma específica de tipo celular por las interacciones de los factores transcripcionales con DNA genómico. Factores de transcripción específicos del linaje se consideran que desempeñan un papel esencial en la diferenciación durante el desarrollo y especificación de la célula. ChIP, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) es ampliamente utilizado para analizar los sitios de unión de todo el genoma de los factores de transcripción (o su complejo asociado) para extracción de ADN genómico. Sin embargo, un gran número de células se requiere para una reacción estándar de ChIP, que dificulta el estudio del número limitado de células primarias aisladas o poblaciones celulares raros. Para entender el mecanismo de regulación de transcripción específicos del linaje de oligodendrocyte factor Olig2 en el ratón agudo purificado OPC, un método detallado usando ChIP-seq para identificar los sitios de unión de todo el genoma de Olig2 (o Olig2 complejo) se muestra. En primer lugar, el protocolo explica cómo purificar el alfa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPC positiva de cerebro de ratón. A continuación, Olig2 anticuerpo mediada por ChIP y se llevan a cabo la construcción de la biblioteca. La última parte describe el software de Bioinformática y procedimientos utilizados para el análisis de Olig2 ChIP-seq. En Resumen, este papel divulga un método para analizar los enlaces de todo el genoma del factor transcripcional Olig2 en cerebro agudo purificada OPC.
Introduction
Es importante para el estudio de la proteína (o complejo de la proteína) enlaces de ADN y las marcas epigenéticas para construir redes de regulación transcripcionales implicados en varios procesos biológicos. En particular, la fijación de factores de transcripción al ADN genómico puede jugar un papel importante en la regulación de los genes, la diferenciación celular y el desarrollo de tejido. Una poderosa herramienta para el estudio de la regulación transcripcional y mecanismos epigenéticos es inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Debido a los rápidos avances en la tecnología de secuenciación de última generación, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) la viruta se utiliza para el análisis de enlaces de proteínas de ADN y marcas epigenéticas1. Sin embargo, un protocolo estándar de ChIP-seq requiere unos 20 millones de células por reacción, lo que dificulta la aplicación de esta técnica cuando el número de células, como células primarias aisladas y poblaciones celulares raros.
Oligodendrocyte células de linaje como oligodendrocitos células de precursor del oligodendrocyte (OPC) se encuentran ampliamente distribuidas por todo el cerebro y son esenciales para el desarrollo y función del cerebro. Como un tipo de células precursoras, OPCs son capaces de auto renovación y diferenciación. OPC no sólo sirve como progenitores de oligodendrocitos sino también juega un papel importante en la propagación de la señalización neuronal mediante la comunicación con otros tipos de células de cerebro2. Estudios previos han sugerido que el desarrollo de oligodendrocyte está regulada por factores de transcripción específicos del linaje como Olig2 y Sox103,4. Estos factores de transcripción fueron encontrados para enlazar las regiones promotor o potenciador de algunos genes cruciales para influenciar su expresión durante la diferenciación y especificación de oligodendrocyte. Sin embargo, es difícil identificar el atascamiento de la DNA de proteína o complejo de la proteína de interés en OPC primario agudo purificada con un número muy limitado de las células.
Este protocolo describe cómo investigar sistemáticamente la immunoprecipitated de ADN genómico por Olig2 en OPCs de ratón purificado a escala del genoma utilizando la técnica de ChIP-seq. OPC de cerebro de ratón fueron purificado por immunopanning agudo y utilizado en un experimento de ChIP sin proliferación in vitro. Un número limitado de OPC puede obtenerse por immunopanning y es insuficiente para los experimentos estándar de ChIP-seq. En este documento, un protocolo de baja celular ChIP-seq con tan bajo como 20 mil células por reacción de ChIP para factores de transcripción se describe. En Resumen, reticuladas células fueron lisadas y sonicadas por un dispositivo de sonicación para esquilar la cromatina. La cromatina esquilada se incubó con anticuerpos Olig2 como proteína granos A cubierto para precipitar el ADN genómico del anticuerpo enlazado de Olig2. Después de la elución de perlas de proteína A cubierto y cross-linking inversa, se purificó ADN genómico precipitado por anticuerpos Olig2 por extracción con fenol-cloroformo. El producto resultante fue cuantificado y sometido a T-tailing, primer recocido cambio de plantilla y extensión, además de adaptadores y amplificación, selección de tamaño de la biblioteca y depuración los pasos para la construcción de la biblioteca de ChIP-seq.
Después de la secuencia, se analizó la calidad de la materia prima Lee de la muestra preparada con anticuerpo de factor de transcripción Olig2 y la muestra de control. Baja calidad de pares de bases y que contienen adaptador leen fragmentos fueron recortados. Lee a continuación, recortado fueron alineado con el genoma de referencia de ratón. Las regiones genómicas que se enriquecieron significativamente para Lee ChIP, en comparación con la muestra de control, se detectaron como picos. Picos significativos, que representan potenciales sitios de unión de factores de transcripción, se filtra y visualizados en un navegador de genoma.
En particular, el método descrito en el presente Protocolo puede ser ampliamente utilizado para ChIP-seq de otros factores de transcripción con cualquier tipo de celular de un número limitado.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales y uso animal se realizó de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por el Comité institucional de bioseguridad y el Comité de Bienestar Animal en el Universidad de Texas Health Science Center en Houston.
1. purificación de PDGFRα positivo Oligodendrocyte linaje células de cerebro de ratón (modificado de immunopanning anteriormente descrito protocolos5,6,7)
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Preparación de una placa de immunopanning para selección de PDGFRα positivo de la célula y 2 placas para agotamiento de las células endoteliales y microglia.
Nota: Tenga en cuenta que platos de Petri pero no los platos de cultivo celular funcionan para immunopanning experimento; Si va a utilizar para el cultivo de las células purificadas, immunopanning pasos deben llevarse a cabo en el gabinete de seguridad de la biotecnología- Cubrir un 10 cm placa de Petri con 30 μL cabra anti-rata IgG en 10 mL de pH 9.5, 50 mM Tris-HCl durante la noche a 4 ° C. Agitar la placa para asegurarse de que las superficies de las placas son uniformemente y completamente cubiertas por la solución de recubrimiento.
- Preparar solución de anticuerpo PDGFRα diluyendo 40 μl de anticuerpo anti-PDGFRα de rata con 12 mL de tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) que contiene 0.2% de BSA.
- Después de 3 lavados de IgG cubierta la placa con 10 mL de 1 x DPBS, incubar la placa revestida de IgG con solución de anticuerpo PDGFRα a temperatura ambiente durante 4 horas.
- Lave la placa de recubiertos de anticuerpos anti-PDGFRα rata 3 veces con 10 mL 1 x DPBS. Suavemente Agregar solución DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa y no molestan las superficies revestidas.
- Capa 2 nuevas placas de Petri de 15 cm para el agotamiento de las células endoteliales y microglia con 20 mL de DPBS que contiene 2,3 μg/mL de lectina Banderiaea simplicifolia 1 (BSL-1) por 2 h.
- Lavado de que BSL-1 cubierta placas 3 veces con 20 mL 1 x DPBS. Suavemente Agregar solución DPBS a lo largo de la pared lateral de las placas y no molestes a las superficies recubiertas.
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Células de linaje de purificación de PDGFRα positivo oligodendrocyte se modifica a partir de métodos previamente publicados6 , 7 , 8.
- Disecar los tejidos corticales de 2 postnatal día 7 (P7) ratón cerebros según previamente protocolos publicados5,6.
- Disociar los tejidos para generar una suspensión unicelular con la disociación del tejido neural Kit (P) según instrucciones del fabricante detallado.
- Brevemente, cortar los tejidos corticales disecados en trozos con un bisturí y sujetas a digestión enzimática a 37 ° C. Después de la digestión, disociar manualmente las piezas con el fuego pulido vidrio que Pipetas Pasteur en una suspensión unicelular.
- Centrifugar la suspensión unicelular a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y suspender el sedimento celulares usando 15 mL de buffer immunopanning (immunopanning buffer es DPBS con 0,02% de BSA y 5 μg/mL insulina).
- Incubar la suspensión unicelular de 2 cerebros de ratón secuencialmente en 2 placas BSL-1 cubierto durante 15 min a temperatura ambiente con agitación suave de la placa cada 5 min para asegurar un mejor agotamiento de microglia y las células endoteliales.
- Agitar suavemente la placa para recoger las células no adherente en la suspensión de células e incubar en la placa revestida de anticuerpo de rata-PDGFRα por 45 min a temperatura ambiente.
- Después de la incubación de la suspensión de células en la placa revestida de anticuerpo de rata-PDGFRα, suavemente agitar la placa para recoger la suspensión de células y lavar la placa 8 veces con DPBS para deshacerse de las células no adherentes. Suavemente Agregar solución de lavado a lo largo de la pared lateral de la placa y agitar la placa varias veces para deshacerse de las células no adherentes.
- Separar las células de la rata-PDGFRα recubiertas de anticuerpos a la placa con 4 mL de tratamiento de solución de separación celular durante 10 min a 37 ° C. Agitar la placa para desalojar las células adherentes.
- Recoger el OPC purificada por centrifugación a 300 x g a temperatura ambiente, suspender el precipitado de células con medio de cultivo 2 mL OPC celular y contar las células mediante el uso de azul tripán y un hemocitómetro (500 mL medio de cultivo celular es medio DMEM/F12 que contiene 5 mL solución de penicilina-estreptomicina (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 μg/mL insulina, 0.1% de BSA, 20 bFGF ng/mL y 10 ng/mL PDGFRα).
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Validación de la pureza de OPC después de immunopanning.
- Para evaluar el enriquecimiento de OPC después de immunopanning, utilice algunas de la OPC purificado para la extracción de RNA con una extracción del tiocianato basada guanidínicos según instrucciones del fabricante.
- Realizar qRT-PCR mediante mezcla principal colorante verde fluorescente para comprobar para el enriquecimiento de la expresión de PDGFRα en OPC purificada en comparación con las células del cerebro disociado según los materiales previamente publicados4.
- Además, la semilla algunas OPC purificada en el Poly-D-lisina recubierta 24 placas bien por immunostaining con los anticuerpos de anti-NG2 condroitín sulfato proteoglicanos (NG2) como se ha publicado materiales9.
2. bajo-celular ChIP preparación y construcción de biblioteca de ChIP para secuenciación de alto rendimiento
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Preparación de ChIP de celular de baja Olig2 con un sistema de sonicación comercialmente disponibles y un número de celda comercialmente disponible bajo ChIP kit (véase tabla de materiales) siguiendo los procedimientos estándar detallados de las instrucciones del fabricante.
- Después de separar de la rata anti-PDGFRα placa recubiertos de anticuerpos y celular con azul de tripán y un hemocitómetro ponen 20.000 OPC purificada en medio de cultivo de célula 1 mL OPC para cada reacción de ChIP.
- Añadir 27 μl de formaldehído 36.5% para fijar la suspensión celular por 10 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: Tenga en cuenta que el formaldehído debe ser utilizado en la campana de humos químicos por razones de seguridad. - Deje de ADN-proteína Cross-linking con glicina de 2,5 M de 50 μL por 5 min a temperatura ambiente.
Nota: Todas las medidas deben realizarse en hielo o en cámara fría de 4 ° C desde este punto. - Lavar el pellet celular reticulado con 1 mL de helado Hanks equilibrada sal solución (HBSS) con inhibidor de la proteasa cóctel y conseguir células peleteadas por una centrífuga previamente enfriada a 300 x g a 4 ° C.
- Lyse el precipitado de células en 25 μl completa tampón de lisis durante 5 minutos en hielo.
Nota: Agitar el tubo para suspender las células en tampón de lisis. - Suplemento el lisado con helada HBSS que contienen cizalla e inhibidor de la proteasa cóctel la cromatina de lisado de células previamente refrigerado por sistema de sonicación con 5 ciclos de 30 s ON y OFF 30 programa 75 μl de la célula. Siempre someter a ultrasonidos 6 tubos juntos y asegúrese de que los tubos de equilibrio contienen 100 μl de agua.
- Después de esquilar, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo después de la centrifugación.
- Diluir 100 μl de la cromatina esquilada con un volumen igual de helada Buffer ChIP completo con el inhibidor de proteasa.
- Guardar 20 μl de la cromatina diluida esquilada como ejemplo de control de entrada.
Nota: Ejemplo de control de entrada es también requerida como la comparación a Olig2 immunoprecipitated muestra para identificar Olig2 anticuerpo immunoprecipitated ADN. - Añadir 1 μl de anticuerpo de conejo anti-olig2 a 180 μl de la diluida esquilada cromatina e incubar el tubo de reacción en un disco giratorio a 40 rpm por 16 h a 4 ° C.
Nota: Realice este paso en una habitación fría. - Para cada reacción de ChIP, lavar 11 μl proteína magnética recubierta A granos con 55 μl tampón de lavado de los granos y ponga el talón pellets en 11 μl de tampón de lavado del grano después de 2 lavados.
Nota: Realice este paso en una habitación fría. - Para cada reacción de ChIP, añadir 10 μl de pre-lavado perlas de proteína A cubierto al tubo de reacción del ChIP. Realizar este paso en una habitación fría.
- Incubar el tubo de reacción de ChIP a 4 ° C para otro 2 h en un disco giratorio.
- Poner el tubo de reacción del ChIP sobre la rejilla magnética para 1 minuto.
Nota: Realice este paso en una habitación fría. - Quite el sobrenadante y no desalojar la pelotilla del grano.
- Lavar el sedimento de grano con 100 μl de cada uno de los 4 tampones de lavado respectivamente para 4 minutos en una rueda giratoria a 4 ° C.
- Después de lavados, añadir 200 μL de tampón de elución a la pelotilla del grano e incubar el tubo de reacción de ChIP a 65 ° C durante 4 horas revertir la reticulación de proteínas ADN.
- Además, añadir 180 μl de tampón de elución a la muestra de control de entrada de 20 μl e incubar a 65 ° C durante 4 h a reticulación proteína ADN así.
- Añadir la mezcla de 25:24:1 (v/v) de 200 μL de fenol, cloroformo, alcohol isoamílico a cada tubo de reacción del ChIP.
- Vortex vigorosamente por 1 minuto y centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir la fase superior a un tubo nuevo.
- Agregar solución de acetato de sodio de 3 M 40 de μl, 1000 μl de etanol al 100% y 2 μl de glucógeno precipitante ligado covalentemente a un tinte azul a cada tubo de reacción de la viruta durante la noche a-20 ° C.
- Centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante, lavar con etanol 70% frío a 500 μl y centrifugar a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante, mantener el aire de pellet seco durante 10 minutos y disolver el precipitado con 50 μl de agua.
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Construcción de biblioteca para secuenciación de alto rendimiento de la viruta
- Limpiar y concentrar el ChIP de ADN con un kit de limpieza según las instrucciones del fabricante.
- Cuantificar la muestra de ChIP por un pico verde según las instrucciones del fabricante.
- Utilice un kit de ChIP-seq para T-tailing, replicación y relaves, cambio de plantilla y extensión, además de adaptadores y amplificación, selección de tamaño de la biblioteca y purificación según las instrucciones del fabricante.
- Después de la desnaturalización de dsDNA, dephosphorylate el extremo 3' de ssDNA por fosfatasa alcalina camarones y añadir una cola de poli (T) a la ssDNA por la transferasa terminal del deoxynucleotidyl.
- Recueza la cartilla de ADN poli (dA) a la plantilla de ssDNA para la replicación del ADN y cambiar de plantilla.
- Después de cambiar de plantilla, ampliar la biblioteca de ChIP-seq por PCR con los iniciadores de avance y retroceso para la indexación.
- Seleccione la PCR amplifica biblioteca ChIP-seq con fragmentos que van desde 250 hasta 500 bp por perlas paramagnéticas por opción 2 para selección de tamaño doble.
- Examinar la calidad de la biblioteca de ChIP-seq seleccionada utilizando un aparato de electroforesis capilar chip microfluídico.
3. Análisis de los datos
- Preparar la estructura de directorios.
- Cree un directorio para realizar el análisis de datos del ChIP-seq. Dentro del directorio recién creado, crear seis subdirectorios con los nombres siguientes: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis e informes.
- Preparar datos y realizar análisis de control de calidad de datos de la secuencia cruda.
- El directorio "raw.files" y descargar los archivos de datos del ChIP-seq.
- Verificar los nombres de archivo. Si la secuencia era fin emparejados, habrá 4 archivos (dos para el tratamiento) y dos para la entrada con nombres similares de base: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq y PDGFRα_input.read2.fastq. Si los nombres de archivo son diferentes, cambie el nombre usando el comando "mv".
- Mueva el directorio "fastqc.output".
- Obtener métricas de control de calidad de la raw Lee utilizando un fastq archivo control de calidad software10. Utilice el comando S1A figura a ejecutar el proceso de control de calidad por separado para cada fichero fastq. El software mostrará varias métricas de control de calidad en un archivo html.
- Abra el archivo html de control de calidad y verificar el número de lecturas, leer longitud, por la calidad de la secuencia de bases, por puntuaciones de calidad de secuencia, contenido de GC de secuencia, niveles de duplicación secuencia, adaptador contenido y contenido de kmer.
- Recortar final Lee de baja calidad y contenido de adaptador.
- Observar la "por la calidad de la secuencia de bases" y "Contenido de adaptador" parcelas. Determinar la longitud de corte de la cabeza y la cola de cada lectura. Una longitud adecuada para el ajuste es donde la calidad base cae por debajo de 30 y hay pruebas de contenido de adaptador.
- Mueva el directorio "raw.files".
- Descargar e instalar un software para cortar Lee11. Utilice el comando Figura S1B para cortar el tratamiento y la entrada por separado. Parámetro 'Cultivo' indica la longitud restante leer recorte las bases del final y 'HEADCROP' especifica el número de bases que eliminarse desde el inicio de la lectura.
- El comando de recorte también incluye el mínimo leer longitud ser aceptado después de filtrar en el parámetro 'MINLEN'. Si las lecturas son por lo menos 50 bp, bp uso 35 como el umbral de longitud leer.
- Mueva el directorio "fastqc.output".
- Realizar el análisis de control de calidad de fichero fastq después de recortar la Lee. Verificar que se han resueltos los problemas de control de calidad. Utilice el comando Figura S1C para obtener las métricas de control de calidad.
- Alinee el solo extremo o extremo apareado Lee ChIP-seq para el genoma de referencia de ratón.
- Hacia el directorio "bowtie.output" para la asignación.
- Descargar el genoma de referencia GENCODE mm10 ratón. Cambie el nombre el genoma de referencia mm10 ratón "mm10.fa".
- Descargar leer mapper12 e instalar en el sistema.
- Crear un archivo de índice del genoma de referencia descargado utilizando el comando Figura S2A. Automáticamente se crean seis archivos: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 y mm10.rev.2.bt2.
- Utilice el comando Figura S2B para ejecutar la alineación y ajustar el parámetro "-p" al número de núcleos de procesamiento según la configuración del sistema. Si ejecuta el modo extremo apareado, los parámetros de "-1" y "-2" indican los nombres de los archivos recortados fastq.
Nota: El mapeo se realiza por separado para las muestras de tratamiento y la entrada y se crean los archivos de salida registro de métricas para cada muestra. - Descargar un software para manipular archivos en el formato de SAM13 e instalar en el sistema. Convertir el archivo SAM alineado en un archivo BAM mediante el comando Figura S2C.
- Obtener métricas de control de calidad de lecturas asignadas antes de pico para ambas muestras de tratamiento y el control extremo apareado.
- Una de las métricas de control de calidad más importantes para la dirección es la profundidad de la secuencia. Abra los archivos "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" y "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" en el directorio bowtie.output y verifique que el número de pares de leer únicamente asignados en cada muestra es mayor que 10 millones.
- Mueva el directorio "homer.output".
- Descargar un software para el descubrimiento de adorno y de análisis de secuenciación de próxima generación14 e instalar en el sistema.
- Crear un directorio llamado "tagDir".
- Para verificar el clonality de etiqueta, utilice el comando representado en Figura S3A. El comando "makeTagDirectory" generará cuatro files:tagAutocorrelation.txt de salida de control de calidad, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt y tagLengthDistribution.txt.
- Mueva el directorio "tagDir".
- Copie el archivo "tagCountDistribution.txt" en el directorio de "informes".
- Mueva el directorio de "informes".
- Abra el archivo tagCountDistribution.txt usando un programa de hoja de cálculo y crear una barra de parcela del número de etiquetas por posición genómica. Guarde el archivo histograma con el nombre "tag.clonality.xlsx".
- Instalar R programación lengua15 en el sistema.
- En el terminal, tipo 'R' y pulse ENTER para acceder al entorno de programación de R.
- Descargar un paquete de R para el procesamiento de datos del ChIP-seq16 e instalarlo mediante el comando representado en Figura S3B.
- Utilizar el script de R en S3C figura para representar la correlación cruzada de filamento.
- Detección de picos mediante un asignador de pico.
- Mueva el directorio "macs2.output". Descargar e instalar un pico mapper17 en su sistema.
- Utilice la función "callpeak" con el tratamiento y control de archivos BAM generados en el paso 3.4.6.
Nota: Incluyen otros parámetros "-f" para el formato de archivo de entrada, "-g" para el tamaño del genoma, "-nombre" para indicar el nombre de la base de todos los archivos de salida, y "-B" para guardar el cacharro de fragmento en formato bedgraph. Figura S4Aincluye el pico completo comando. Utilice BEDPE para las muestras finales emparejados. - Verificar que el asignador de pico generado seis archivos: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg y PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Abrir el archivo PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls para ver los picos llamados, la ubicación, longitud, posición Cumbre, cacharro y las métricas de enriquecimiento máximo:-log10(pvalue), doblez de enriquecimiento y - log10(q-value).
- Filtro y anotar llamados picos.
- Con el archivo abierto en el paso anterior, filtra los picos resultantes según el enriquecimiento de la doblez, el valor p y el valor de q. Para decidir los umbrales de filtrado adecuados, hacer un diagrama de histograma para determinar la densidad de cada métrica. Filtrar valores umbral seleccionado para obtener picos significativos.
- Descargar la lista negra de mm10 (regiones son conocidas por tener señal artificialmente alta) y filtrar el ChIP-seq picos que están dentro de alguna de esas regiones del artefacto.
- Crear un archivo de cama con los picos filtrados que contiene las siguientes columnas: cromosoma, Inicio, fin, peakID, mock y filamento. Llenar la columna falsa con un punto "." ya que no se utiliza. En la columna de hebra, establece todos los valores en "+". Guarde el archivo de la cama como "filtered.peakData2.bed".
- Copie el archivo "filtered.peakData2.bed" en el directorio de "informes".
- Mueva el directorio de "informes".
- Para anotar picos filtrados a una región del gen específico, utilice la función "annotatePeaks" con el archivo de cama creada en el paso anterior. El comando utilizado se muestra en la Figura S5A.
- Abra el archivo "filtered.annotatedPeaks.txt" utilizando un software estadístico.
- Filtro de picos resultantes en una región intergénica a una distancia mayor a 5 kb de un TSS anotado. Utilice la columna de "Distancia al SAT" en el archivo de la distancia para el filtrado. Guarde los picos filtrados en un archivo de excel llamado "5kbup.geneBody.peakData.txt".
- Tienda el resultado filtrado picos en un archivo bedGraph con columnas: cromosoma, comienzo, fin y - log10(q-value). Nombre del archivo "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
- Generar archivos de bigwig de visualización del navegador.
- Descargar e instalar un software para genoma aritmética18.
- Una herramienta para convertir bedgraph a pez gordo de descargar e instalar en el sistema. Descargue el archivo 'mm10.chrom.sizes'.
- Utilice el comando Figura S6A para generar un archivo de bigwig.
- Descargar e instalar un navegador genoma del19 en el sistema.
- Abrir el navegador de genoma y cargar el archivo "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" para visualizar los picos significativos filtrados y su ubicación con respecto a los genes conocidos.
- Búsqueda de motivos.
- Mueva el directorio "motif.analysis".
- Descargar un de novo motivo de exploración y programa de enriquecimiento de adorno y lo instala en su sistema20.
- Descargar una base de datos integral motivo que incluye motivos de Olig2.
- Obtener las secuencias genómicas de 500 regiones de bp, centradas en las cumbres de pico significativo. Almacenar las secuencias como peak.sequences.txt. Utilice el comando en la Figura S7 para buscar motivos de Olig2 dentro de cada una de las regiones de pico 500 bp.
- Los motivos resultantes usando un E-valor adecuado del filtro (por defecto = 0.05).
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Representative Results
Fue realizada bajo celular ChIP-seq y bioinformáticas de análisis se realizaron para investigar las posibles interacciones del factor transcripcional Olig2 con ADN genómico purificado agudo cerebro OPC. La figura 1 muestra un flujo de trabajo general de la experimental y los procedimientos de análisis de datos. En este protocolo, cerebros de ratones postnatales se disocian en una suspensión unicelular. Después de la disociación del tejido, immunopanning realizó para purificar OPC usando anticuerpos PDGFRα. La figura 2 muestra el enriquecimiento significativo de PDGFRα, poca expresión del marcador neuronal Tuj1 (neurona-específica clase III beta-tubulina), marcador de astrositos GFAP (proteína ácida fibrilar glial), adaptador de enlace de calcio ionizado marcador microglia molécula 1 (Iba1), myelinating maduros proteína básica oligodendrocitos marcador mielina (Mbp) y glicoproteína del oligodendrocyte myelin (Mog) de OPC purificada según lo evaluado por RT-qPCR. Además, immunostaining resultado indica que la mayoría de las células son NG2 positiva como se muestra en la figura 2. Posteriormente, 20 mil OPC purificada por reacción se fijaron por el formaldehído y cromatina fue cortada mediante un sistema de sonicación. Olig2 baja-celular ChIP fue realizada y se construyó la biblioteca. Después de la preparación de la biblioteca del ChIP, se validó la calidad del producto generado por un aparato de electroforesis capilar chip microfluídico. La figura 3 muestra un electroferograma de ejemplo de una biblioteca de ChIP de celular de baja Olig2. Un producto de la biblioteca de pico claro de Oligo2 desde 250 hasta 500 bp debe ser visible después de la selección del tamaño del producto PCR de biblioteca. Las bibliotecas de ChIP-seq de ambos la muestra preparada con anticuerpo de factor de transcripción Olig2 y la muestra de control fueron sometidas a secuenciación de alto rendimiento para producir 50 extremo apareado ciclo Lee de la secuencia. Más largos de lectura mejorará las tasas de asignación y reducir la probabilidad de asignación múltiple, a expensas de los costes de secuenciación. Con 50 bp ChIP-seq secuencia final emparejado las bibliotecas, generalmente se obtienen buenos resultados.
Después de la evaluación inicial de control de calidad de crudo Lee y ajuste de los adaptadores iniciales y finales pares de base de baja calidad, los diagramas de control de calidad se muestran en la figura 4. Lee recortado debe tener una calidad base superior a 30, no hay secuencias de adaptador y tienen una tasa de duplicación bajo (Figura 4B-D). Buena calidad ajustado Lee aumentará la tasa de alineamiento. Otros parámetros tales como contenido de GC también son importantes y deben ser considerados para el ajuste.
Una vez que las muestras de la secuencia están alineadas, es necesario verificar la profundidad de la secuencia. Se sabe que el número de picos llamados aumente con una mayor profundidad de la secuencia desde sitios débiles serán estadísticamente más significativas21. Un análisis de saturación es necesaria para determinar una profundidad suficiente de la secuencia para cada factor de transcripción específico utilizado, a costa de tiempo y presupuesto. Una profundidad de la secuencia consenso de unión del factor de transcripción ha sugerido por el consorcio ENCODE sobre muestras de mamíferos: un mínimo de 10 millones asignados únicamente lecturas para cada uno de por lo menos dos biológicos Replica22. El número de lecturas asignadas únicamente y la tasa de alineamiento se calcularon por el asignador de leer. En la figura 5Ase muestra un ejemplo de métrica buena cartografía. Lee alineada debe asignarse a distintas localizaciones genómicas, que indica una complejidad adecuada biblioteca, también conocida como clonación de la etiqueta. El consorcio ENCODE sugiere que al menos el 80% de los 10 millones de Lee alineada debe asignarse a diferentes regiones genómicas22. La figura 5B muestra una clonality de la etiqueta adecuada en el cual más del 90% de la muestra se asignan a solamente una localización genómica. Bibliotecas de baja complejidad ocurren generalmente cuando no hay suficiente ADN se obtiene, y la PCR amplifica fragmentos son secuenciados repetidamente. Una biblioteca de baja complejidad, obtendrá una tasa de detección de pico falso alto.
Cuando se utilizan datos ChIP-seq emparejado, fragmentos se unen alrededor del factor de transcripción con una cierta distancia de separación. La secuencia final emparejado permitirá una estimación más precisa de la longitud del fragmento promedio rendimiento una mejor estimación de las regiones genómicas donde se produjo el enlace de más. El diagrama de correlación de filamento representa un pico de enriquecimiento correspondiente a la longitud del fragmento predominante. Como se observa en la figura 5, la longitud del fragmento calculado es de 130 bp mientras que la longitud de lectura es 50 bp. Un conjunto de datos del ChIP-seq cuando la longitud del fragmento es más larga que la longitud leída es indicativo de alta calidad16.
La salida de llamadas de pico es una lista de regiones genómicas probables regirme por el factor de transcripción (o su complejo). La lista de regiones genómicas o picos está incluida en un archivo de "cama" que puede verse en un navegador de genoma. Para cada pico, este archivo contiene un ID de pico, la localización genómica de la Cumbre del pico y el FDR como - log10 (valor de q). Los picos significativamente enriquecidos son aquellos con mayor enriquecimiento de doblez y métricas de importancia. En la figura 6Ase muestra un ejemplo del archivo de salida pico. Después de seleccionar picos significativos utilizando umbrales personalizados, filtrado de picos dentro lista negra23 de ENCODEe identificación de picos en la región del promotor de un gen (cuerpo de aguas arriba y todo el gene de 5 kb), un archivo de "pez gordo" es útil para ver picos en un genoma Explorador. Regiones más enriquecido del pico tienen una mayor probabilidad de enlace del factor de transcripción. Es importante confirmar la presencia del pico en regiones reguladoras del factor de transcripción conocido, así como ausencia de pico en las regiones donde es probable atascamiento del factor de transcripción. Figura 6B -E muestra ejemplos de regiones del gen con y sin enriquecimiento de pico, así como su ubicación con respecto a regiones promotoras ENCODE.
In silico métodos complementarios al experimento de ChIP-seq son análisis del enriquecimiento de adorno y de nuevo la búsqueda de motivos. Puesto que el enlace de Olig2 de OPC no ha sido estudiado antes, Olig2 ChIP-seq deriva picos en células progenitoras de neuronas motoras y las células madre embrionarias fueron utilizadas para de novo motivo identificación4,24. Olig2 de novo identificadas motivos fueron agregados al ENCODE integral motivo base de datos25 y se realizó análisis de enriquecimiento de adorno. Había identificado de alto enriquecimiento de de novo OLIG2 motivos y motivos (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 y ASCL1) del factor de transcripción conocido fueron encontrados en ChIP-seq picos de PDGFRα purificado de células. Un enriquecimiento de 30 motivos de novo identificadas con un E-valor < 0.05 fue descubierto. La figura 7 muestra los motivos de de novo identificadas dos de Olig2. Estos dos motivos de Olig2 de novo identificadas fueron encontrados en > 60% de los picos de ChIP-seq Obtenido de células PDGFRα purificado, además de motivos conocidos.
Figura 1: Resumen del flujo de trabajo de protocolo. PDGFRα positivo OPC fueron aislada de cerebro de ratón postnatal y fueron sometido a Olig2 ChIP experimentar. Los fragmentos de ADN precipitados se utilizaron para la preparación de biblioteca de ChIP. Después de la evaluación de la calidad de la biblioteca, las muestras fueron utilizadas para la secuencia. Conjuntos de datos fueron analizados y picos fueron identificados, indicando posibles sitios de unión de Olig2 en OPC purificaron las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: evaluación de la pureza de immunopanned OPC por qPCR y el immunostaining. Las células de immunopanned de anticuerpos (A) PDGFRα fueron sembradas e inmunotinción se realizó utilizando OPC linaje marcador NG2 del anticuerpo. Azul: DAPI, verde: NG2. Barra de escala = 10 μm. (B) evaluaron el nivel de expresión relativa de neuronal marcador Tuj1 en OPC purificada (PDGFRα +) y en las células del cerebro disociado (mix). Tuj1 expresión en neuronas disociadas se estableció en 1. (C) el nivel de expresión relativa de astrositos marcador GFAP en OPC purificada (PDGFRα +) y en las células del cerebro disociado (mix) fue evaluada. Expresión de GFAP en células de cerebro disociado se estableció en 1. (D) el nivel de expresión relativa de OPC marcador PDGFRα en OPC purificada (PDGFRα +) y en las células del cerebro disociado (mix) fue evaluada. Expresión de PDGFRα en neuronas disociadas se estableció en 1. (E) el nivel de expresión relativa de marcadores de oligodendrocitos maduros myelinating Mog en OPC purificada (PDGFRα +) y en las células del cerebro disociado (mix) fue evaluada. Expresión de MOG en neuronas disociadas se estableció en 1. (F) el nivel de expresión relativa de marcadores de oligodendrocitos maduros myelinating Mbp en OPC purificada (PDGFRα +) y en las células del cerebro disociado (mix) fue evaluada. Expresión de la MBP en neuronas disociadas se estableció en 1. Las células (G) el nivel de expresión relativa de microglia marcador Iba1 OPC purificada (PDGFRα +) y el cerebro disociado (mix) fue evaluada. Iba1 expresión en neuronas disociadas se estableció en 1. Datos de B-G representan experimentos por triplicado y barras de error indican el error estándar. T-test análisis * P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: un electroferograma de ejemplo de una biblioteca de ChIP de celular de baja Olig2. Después de selección de tamaño doble, se analizó la calidad de la biblioteca de Olig2 ChIP por un aparato de electroforesis capilar chip microfluídico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: resultados representante de control de calidad para una muestra de ChIP-seq 50 de bp leer longitud baja celular. (A) tabla de resumen que representan el número total de lecturas, el número de lecturas de mala calidad, longitud de la secuencia y contenido general de la GC. (B) diagrama indicando la distribución de puntuaciones de calidad base en diferentes posiciones en las lecturas. (C) parcela mostrando el potencial contenido de adaptador en diferentes posiciones en las lecturas. Línea (D) diagrama que indica el porcentaje de duplica las secuencias. La mayoría de las lecturas proceden de secuencias que ocurren sólo una vez dentro de la biblioteca, por lo tanto, lo que indica una tasa de duplicación bajo o biblioteca alta complejidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: control de calidad métricas obtienen antes de llamar al pico: bowtie2 indicadores de alineamiento, correlación cruzada del filamento y etiqueta clonality. (A) mediciones de alineación obtienen desde el asignador de leer. Las métricas más importantes son el número de pares de leer únicamente asignados, indicado como "alineado unanimidad exactamente 1 vez" y el tipo de alineación total. (B) histograma mostrando la clonalidad de la etiqueta. Las barras indican el porcentaje de posiciones genómicas donde se encontraron etiquetas. (C) un ejemplo de un diagrama de correlación cruzada indicando datos de buena calidad. Líneas rojas representan la longitud leída en 50 bps y la longitud del fragmento predominante a 130 bps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: regiones de pico ChIP-seq y genoma navegador vistas de picos de ChIP-seq importantes en diversas localizaciones genómicas. (A) ejemplo de las regiones de pico identificado con la persona de pico. (B) importantes ChIP-seq picos encontraron en el cuerpo de la gen de Cspg4, un conocido gen marcador OPC. (B) ChIP-seq picos no fueron encontrados en las regiones promotoras o dentro de los órganos de la gene del gene de la Mbp, un marcador de oligodendrocitos maduros, Tubb3 (C), un marcador de células neuronales, o GFAP (D), un marcador celular de astrocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: altamente enriquecido de novo identificadas motivos de Olig2 en picos de PDGFRα Olig2 ChIP-seq. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: preparación de conjuntos de datos de ChIP-seq. (A) definición de la arquitectura de directorio. (B) cálculo crudo Lee mediciones de control de calidad. (C) corte de Lee. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S2: alineación de Lee al genoma de referencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S3: control de calidad de Lee alineada, a dirección de correlación cruzada del filamento y determinar la clonalidad de la etiqueta. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S4: llamada pico. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S5: anotación de picos importantes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S6: conversión de formato de archivo de bedGraph a pez gordo para visualización de pico en el browser del genoma. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S7: enriquecimiento de búsqueda y motivo de adorno De novo . Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S8: Organigrama describiendo los análisis bioinformáticos de ChIP-seq datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Redes de regulación genética mamíferos son muy complejas. ChIP-seq es un potente método para investigar las interacciones de la proteína del genoma-ADN. Este protocolo incluye cómo se realiza Olig2 ChIP-seq con una cantidad baja de OPC purificada de cerebro de ratón (tan bajo como 20 mil células por reacción). El primer paso clave de este protocolo es la purificación de OPC de cerebro de ratón por immunopanning con el anticuerpo PDGFRα. Para la selección positiva de OPC con placas PDGFRα revestido, atan a menudo débil OPC a la PDGFRα había revestido placas. Incluso después de varios lavados, todavía hay algunas células no adherente izquierda. Es importante comprobar que las células no adherentes después de cada D-PBS lavan bajo un microscopio. Si lavado D-PBS más no ayuda a reducir el número de células no adherente, es tiempo para recoger las celdas seleccionadas, ya que el exceso podría desalojar OPC adjunto y reducir el rendimiento de las células purificadas. Sin embargo, lavado insuficiente puede resultar en la contaminación de otros tipos de células del cerebro. Por lo tanto, cada vez después de aislamiento, es necesario evaluar la pureza de las OPCs aislados immunostaining con OPC marcador NG2 qPCR para la expresión de genes específicos del tipo de célula conocido como Tuj1 para neuronas, GFAP por astrocitos, PDGFRα para OPC, Iba1 microglia, y MOG y la MBP de oligodendrocitos maduros myelinating. Como se muestra en la figura 2, immunostaining resultado indica que la mayoría de las células purificadas es positiva para la tinción de NG2. Además, algunos marcadores específicos de tipo clásico de la célula de neuronas, astrocitos, microglía y myelinating maduran oligodendrocitos exposición indetectables o extremadamente bajos niveles de expresión en OPC purificada en comparación con la mezcla de células de cerebro. PDGFRα exhibe nivel alta expresión en OPC purificada en comparación con la mezcla de células de cerebro no purificada. Método immunopanning, microglía se reducen considerablemente en la OPC purificada en comparación con la mezcla de células de cerebro, pero existe una pequeña cantidad de contaminación. Esta observación es consistente con las publicaciones anteriores por otros7,8,26. Además, en comparación con informes previamente publicados, un kit disponible comercialmente se utiliza en el presente Protocolo para la disociación estandarizada, eficiente y conveniente de tejidos de cerebro en suspensiones celulares solo.
Después de cross-linking de OPC purificada, las células reticuladas se deben lavar con solución helada de HBSS y los pasos restantes de la viruta deben llevarse a cabo a 4 ° C, de lo contrario el anticuerpo no puede precipitar el ADN genómico correctamente.
El siguiente paso clave en este protocolo es la preparación de la biblioteca. La amplificación por PCR de material de la viruta se utilizó para la construcción de la biblioteca. El número de ciclos PCR para la preparación de biblioteca depende de la cantidad de a partir de ADN. Preparación de una buena biblioteca requiere cuantificación precisa de entrada cantidad de ADN. Demasiados o muy pocos ciclos PCR pueden influir en la concentración de la biblioteca así como la complejidad, conduce a artefactos PCR.
Es un reto para construir biblioteca ChIP-seq cuando se utiliza un número limitado de células para la inmunoprecipitación27. El protocolo estándar previamente usado de ChIP requiere 10 ng de ADN immunoprecipitated por ChIP-seq biblioteca preparación1,28. Sin embargo, el protocolo descrito aquí normalmente genera 2 ng de ADN immunoprecipitated por anticuerpo Olig2 de 20.000 OPC. ADN se utiliza para preparar la biblioteca de ChIP-seq por un método de adición solo paso adaptador, que permite mayor sensibilidad permitiendo picogramos de immunoprecipitated DNA a amplificar. Mediante la combinación de kits comerciales, este protocolo proporciona una solución práctica para realizar ChIP-seq para factores transcripcionales basados en un pequeño número de células.
Lo importante es la célula bajo protocolo de ChIP-seq descrito es aplicable para ChIP-Seq de otros factores de transcripción en células primarias o células raras poblaciones así. Anticuerpos utilizados en el presente Protocolo necesitan ser validado experimentalmente para ser específicos por experimento IP primero. Fijación no específica de anticuerpos dará lugar a pobres resultados. Además, es preferible llevar a cabo este experimento de baja celular ChIP-seq en las células con un nivel de elevada expresión del factor de transcripción de interés.
Para análisis de datos, puede ser difícil decidir qué valores utilizar como filtrado cortes después llamada pico. Dependiendo de los objetivos del análisis, pueden utilizarse parámetros estrictos o más relajados. Generalmente, se utiliza una combinación de pliegue-enriquecimiento y valor p o FDR. Si previamente se conocían algunos sitios de unión del factor de transcripción bajo estudio, esto puede ayudar en la determinación de los umbrales de filtrado. Transcripción factor vinculante sitio las bases de datos derivan de experimentos de ChIP-seq disponibles al público en diferentes líneas celulares y condiciones han sido compilados29,30. Uno podría buscar un gen y comprobar si los sitios de unión del factor de transcripción se han encontrado previamente. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los sitios de unión del factor de transcripción difieren dependiendo de las condiciones y tipos de la célula.
In silico métodos complementarios al experimento de ChIP-seq son motivo enriquecimiento análisis de novo motivo búsqueda y con MEME-ChIP20 o programas similares. La búsqueda del motivo requiere una integral conocida y de novo derivado de base de datos de adorno como el ENCODE motivos25 o el de la base de datos Hocomoco31. Hocomoco es una base de datos de los motivos descubiertos de experimentos ratón ChIP-seq y humanos disponibles al público. Si motivos para la proteína ensayada son desconocidos, la búsqueda del adorno de novo podría revelar patrones de secuencia repetitiva en una fracción importante de los picos como nuevos motivos. La potencial acción combinatoria de factores de transcripción puede ser revelado cuando también se encuentran motivos de otros factores de transcripción a enriquecerse en los picos resultantes.
Las regiones de pico enriquecido pueden validarse experimentalmente mediante el uso de la cromatina de células mutantes o knockout como controles. Realización de ChIP-seq con células que no expresan el factor de transcripción se utilizan para la identificación de picos positivos falsos, también denotado como "picos fantasmas"32. Falsos positivos deben ser filtradas.
También es interesante comparar los picos resultantes de ChIP-seq con datos transcriptómicos. Los picos de PDGFRα Olig2 ChIP-seq fueron comparados con la expresión de genes en la OPC de una anterior publicación18. Esta estrategia puede ser limitada ya que los genes expresados en OPC pueden ser controlados por mecanismos que no sea obligatorio de factor de transcripción Olig2. Además, factor de transcripción Olig2 puede obligar a la región reguladora de un gen pero el gen podría tener a nivel de expresión del gen bajo debido a posibles mecanismos inhibitorios o la falta de co factores necesarios para la transcripción del gene.
ChIP-seq es un método utilizado para la identificación de sitios de unión de ADN de genoma de factores de transcripción y otras proteínas. Sin embargo, a través del análisis de co-ocurrencia de factores de transcripción, los investigadores encontraron que los factores de transcripción tienden a asociarse con otras proteínas formando módulos correguladores33. Esto significa que algunas vinculaciones entre los factores transcripcionales y la DNA genomic reveló por ChIP-seq son indirectos y puenteado por otras proteínas. Por lo tanto, para lograr resultados más significativos los investigadores deben considerar estudiar simultáneamente más de un factor de transcripción.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD y YY fueron apoyados por becas de los institutos nacionales de salud R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; el Staman Ogilvie fondo-Memorial Hermann Foundation; la iniciativa de cerebro UTHealth y CTSA UL1 TR000371; y una beca de la Universidad de Texas sistema Neurociencia y Neurotecnología Research Institute (Grant #362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
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