Summary
이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.
Abstract
내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아2 +농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을, 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca2 + 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.
Introduction
기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.
초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화3,,45했다. 세포 신호 펩 티 드의 큰 가족 곤충 라이프 사이클6,7동안 다양 한 생리 적 행사에 참여 하 생각 된다. 이러한 펩 티이 드의 대부분 비록 특정 GPCRs 처음 전통적인 방법을 사용 하 여 식별 하기 어려운 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)에서 작동 합니다. 초파리 전체 게놈 순서8 의 간행물이 이었다 초파리 생리 활성 펩 티 드는 다른 곤충에서 발견 된에 그들의 상 동에 따라 식별을 사용 하는 획기적인. 또한, 여러 가지 펩 티 드에 대 한 수용 체는 GPCRs GPCR 리간드 바인딩 분석 셀-문화-기반을 사용 하 여 게놈에 예측에서 확인 되었다. 다음, 식 분석 예측 기관 대 기관 경로 이러한 펩 티 드와 수용 체에 의해 elicited. 특히, 상 상속 펩 티 드 수용 체의 많은 두뇌, 두뇌 펩 티 드 호르몬9의 주요 목표는 제안 표현 됩니다. 또한, 초파리 에서 유전자 고급 도구 펩 티 드 GPCR 조합의 생리 적 역할의 id에 공헌 했다. 예를 들어, GAL4 및 LexA 기반 이진 transcriptional 시스템 활성화 유전자 최저 또는 overexpression 공간 및 일시적으로 제어 방식. GAL4, 효 모에서 확인 된 녹음 방송 요인 특정 cis 규제 시퀀스 라는 상류 활성화 순서 (UAS)에 바인딩합니다. GAL4/UAS 시스템에서 드라이버 라인 제공 조직 관련 또는 단계 특정 GAL4 표현과 응답자 선 관심 또는 드라이브 shRNA 식 구조 유전자의 상류 UAS 운반. LexA/LexAop 시스템 비슷한 메커니즘을 기반으로 합니다. 조직의 특정 펩 티 드-최저와 조직 특정 GPCR 최저 동물의 phenotypic 분석 펩 티 드 GPCR 신호 모드와 행동의 사이트에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. 그러나, 유전자 데이터에 의해서만 도달 될 수 있는 결론 제한 됩니다. 다른 한편으로, 특정 펩 티 드 호르몬의 상 상속 대상 조직 또는 세포 유형으로 좁혀입니다, 일단 비보 전 칼슘 기관 explants 이미징 펩 티 드 GPCR 신호에 의해 중재 기관 대 기관 통신 명료 하 사용할 수 있습니다. Gq 결합 GPCR의 활성화, 세포내 캘리포니아2 + 농도10응급실 캘리포니아2 + 의 출시로 인해 증가 된다. 뇌, 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을 올린다. 이러한 Ca2 + 증가 칼슘 센서, GCaMP, 캘리포니아2 + 형광 방출11결과의 구조적 변화를 겪 습에 의해 감지할 수 있습니다.
이 문서에서는, 초파리 뇌를 사용 하 여 이미징 방법 explants 칼슘 설명 되어 있습니다. 특정 뉴런을 활성화 하는 펩 티 드의 능력을 테스트 하기 위해 테스트 펩 티 드 GCaMP 표현 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 confocal 현미경 검사 법에 의해 모니터링 됩니다. GPCR의 참여는 GPCR 부족 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 동일한 분석 결과 수행 하 여 다음 확인 된다. 이미징 및 유전학의이 조합은 펩 티 드에 의해 기관 대 기관 통신에 대 한 정확한 정보를 제공 합니다-GPCRs. 가능 수정 및이 프로토콜의 응용 프로그램 또한 토론 된다.
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Protocol
1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비
- 이미징 챔버를 확인 합니다.
참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca2 + 이미징 시스템에 사용 됩니다.- 집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 중앙 스크래치.
- 이쑤시개와 덴트의 양쪽에 superglue의 작은 방울을 놓고 접착제를 텅스텐 막대 (0.125 m m, 6 ~ 7 m m 길이)를 연결 합니다.
- 퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 작은 조각을 사용 하 여, 확인 (10 m m 직경에서 및 높이 3 m m) 원형 벽 주변 덴트 (그림 1).
참고: 벽 내부의 공간 나중으로 채워질 것 이다 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 0.14 M NaCl, KCl, 0.0027 M 0.01 M 포43-, 25 ℃에서 pH 7.4 ± 0.05).
- 동물 준비
참고: 칼슘 이미징, 칼슘 표시기, GCaMP6s, 표현 된다 세포 유형의 관심, 일반적으로 조직의 특정 GAL4 UAS-GCaMP6s의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 신호 후보 수용 체를 통해 중재 된다 되도록 GCaMP6s 수용 체에 결함이 있는 돌연변이 또한 표현 된다.- 다른 genotypes 야생 타입 등 돌연변이 대 한 실험 비교 필요한 경우 GCaMP6 식 수준 변화와 발달 단계에 따른 생리 적 차이 피하기 위해 일치 시험 애벌레 나이.
- 포함 하는 음식의 표면에 계란-누워 있도록 8 h에 대 한 표준 비행 거리 음식 문화 유리병에 부모의 파리 (30 파리 각 섹스에 대 한)을 유지. 25 ° C와 60-70% 상대 습도에서 12 h 빛 어두운 주기에서 질량에는 문화 애벌레
- 애벌레는 두뇌의 해 부
- (AEL) 누워 계란 후 90-120 h, 애벌레를 수집 하 고 그들에 게 부착 식품 이물질 제거를 증류수와 적어도 3 번을 씻어.
- 장소는 1.5 인치 사각 시계 유리에 유 충은 얼음 차가운 PBS 가득합니다.
참고: 다음 두 단계 해 현미경이 시계 유리에 수행 됩니다. - 집게를 사용 하 여 부드럽게 유 충의 중간 부분을 잡아. 다른 집게를 사용 하 여 입 후크를 유 충을 포함 하는 시체의 나머지 부분에서 뇌의 앞쪽 부분을 부드럽게 입 고리를 당겨.
참고: 또는, 수술가 위 사용할 수 있습니다. - 겸 자에 의해 앞쪽 끝을 누른 유 충을 안으로 밖으로 설정 합니다. 외부 조직 imaginal 디스크, 지방 기관, 링 선 등 뇌에 연결을 제거 합니다. 부드럽게는 mouthparts에서 뇌를 분리 합니다.
- PBS의 200 µ L 이미징 챔버에 퍼 티 같은 재사용 접착제의 링의 안쪽에 적용 됩니다. 부드럽게 파스퇴르 피 펫에 PBS 가진 해 부 뇌를 빨 아 하 고 이미징 챔버로 전송.
- 두뇌 이미징 챔버로 설정
- 집게를 사용 하 여 복 부 신경에서 연장 하는 근육 섬유를 잡아. 텅스텐 와이어 아래 덴트에 두뇌를 부드럽게 삽입 합니다.
- 다른 집게를 사용 하 여, 풀 텅스텐 와이어를 약간 장소 두뇌 이미징 (그림 1)에 대 한 올바른 위치에.
2. Ca2 + 형광 이미지 수집
참고: PBS에 몰입 하는 뇌 explants는 몇 군데 물 침수 렌즈 X 20을 갖춘 형광 현미경을 사용 하 여 (없음 = 0.5). PBS는 뇌에서 세포를 활성화 하지 않습니다. Z 축 이미지, 필요한 경우 활성화 압 전 렌즈 발동기로 대물 렌즈 마운트입니다. 회전 디스크 confocal 머리는 시간 분해능을 향상 하는 데 사용 됩니다. 낮은 조명 촬영에 대 한 전 하 결합 소자 카메라 멀티 전자 현미경에 장착 됩니다. GCaMP6s 형광 이미징 (여기/방출: 488/509 nm) 여기 dichroic 빔 스플리터와 방출 필터 488 nm 레이저를 요구 한다 (예., 528 ± 38 nm 대역 대역 통과 필터).
- 포함 하는 현미경 뇌 explant 이미징 챔버를 놓습니다.
- 그것은 PBS를 건드리면 때까지 대물 렌즈를 낮춥니다. 필드 밝은 조명 아래 뇌 놓고 초점으로 그것을. 형광 빛을 전환 하 고 GCaMP6s 라는 세포에 초점을 조정 합니다.
참고:는 GCaMP6s의 기저 녹색 형광 표시 되어야 합니다. - 250 ms에서 수집을 시작/냉각 모드 적절 한 수집 소프트웨어를 사용 하 여 512 × 512 픽셀의 해상도에서 프레임 (예., µManager). 16 비트 이미지 (동적 범위 0-65535) CCD 카메라의 동적 범위에서 형광 값을 1000 (임의의 단위) 보다 낮게 하지 노출 시간을 조정 합니다.
참고: 낮은 노출 시간에 GCaMP6s의 사진-표백을 최소화 하기 위해 사용 해야 합니다. 그것은 GCaMP6의 식 수준 및 탐지 시스템의 감도에 따라 노출 시간 각 실험에 최적화 되어야 합니다. 그것은 사용 하 여 우리의 실험에서 100 ms dilp2 > GCaMP6s. Z-섹션 주어진된 이미징 깊이 대 한 필요한 경우, 여러 z 섹션 이미지 노출 시간과 프레임 간격에 따라 취득 수 있습니다. 카메라 공간 해상도 충분 한 경우, 노출 시간을 줄이기 위해 범주화 크기 (하나의 디지털 픽셀으로 범주화 하는 칩에 레지스터의 수)를 증가 한다. - 이미지 매개 변수를 확인 하는 펩 티 드 관리 기준 신호 강도 (F0)를 검색 하기 전에 1 분 동안 이미지 걸릴.
- 적용 테스트 펩 티 드. 이 위해, PBS에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 녹이 고 직접 최적 농도를 애벌레 욕조에 플라스틱.
참고: 펩 티 드 솔루션 천천히 주입 되어야 한다 (예를 들어, 흐름 속도 20 µ L/s)는 피 펫을 사용 하 여 목욕 솔루션으로. 없는 합성 펩 티 드 PBS에 녹아 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. - 몇 분 동안 GCaMP6s 방출을 기록 합니다.
3. 데이터 분석
참고: 영상 데이터는 오프 라인으로 ImageJ로 분석 된다. 시간 경과 화상 진 찰 동안 pipetting 이동 애벌레 뇌를 발생 합니다. 따라서, 직렬 이미지의 위치 착오 분석 하기 전에 수정 해야 합니다. 수정 된 ImageJ 플러그인, TurboReg를 사용 하 여 다음과 같이 수행할 수 있습니다.
- 분석 소프트웨어를 열고 (펩 티 드 응용 프로그램) 전에 첫 번째 프레임 참조 이미지를 사용 합니다.
- 플러그인을 선택 | 등록 | TurboReg.
- 원본 으로 직렬 이미지 파일 및 대상으로 참조 이미지를 선택 합니다.
- 체크 리 짓 바디 (병렬 변위 및 이미지의 회전)와 정확한 ("빠른"는 빠른 분석 하지만 거친 대신) 처리 방법 및 품질, 각각.
- 일괄 이미지 처리 시작을 클릭 합니다.
- 분석을 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 여러 영역을 선택 | 도구 | 투자 수익 관리자 ImageJ에.
- 더 많은 를 클릭 하 여 픽셀 강도 측정 | 다중 측정 | 확인 ROI 관리자 창에서.
- Δ/F0 를 계산 = (F-F0) /F0, 어디 F 투자 수익 강도, 자극의 시간에서 이며 F0 특정 실험 이벤트 직전 시간대에 강도 (예를 들어, 30 프레임 앞에 자극 증상)입니다.
- 반복 실험 여러 뇌 샘플을 사용 하 여, 평균 및 각 시간 지점에서 평균 (SEM)의 표준 오차를 통계 처리를 수행 합니다.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL412 (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s13 (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다. 이 실험에서 이미지는 단일 초점 평면에서 얻은 했다. 각 IPC 클러스터 포함 약 14 셀14, 그리고 6 셀에 3에서 신호 감지 했다. GCaMP6s 신호 강도 CCHa2 행정 (그림 2영화 1) 극적으로 증가 되었다. 야생-타입 두뇌 렐 또는 Nociceptin에 대 한 확실 한 응답을 표시 하지 않았습니다 (영화 2 및 3, 각각), 초파리 homologue 없이 포유류 펩 티 드 호르몬입니다. 이 결과 CCHa2에 의해 IPCs의 관찰된 활성화 CCHa2에 대 한 특정 응답 임을 나타냅니다. CCHa2 CCHa2-R을 통해 작동 하는 여부를 명확 하 게 동일한 분석 CCHa2-R 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 실시 했다. 신호 강도에 이러한 증가 돌연변이 두뇌 (동영상 4)에서 CCHa2 관리 후 관찰 되었다. 통계 분석 보여주 야생-타입 및 CCHa2-R 돌연변이 두뇌 신호 강도 차이 CCHa2 신청 후 2 분 이내 중요 한 되었다 적어도 7 분 (그림 2B) 유지 되었다. 이 결과 나타냅니다 IPCs 특별히 CCHa2 r.를 통해 CCHa2에 의해 활성화 된다 이 연구에 사용 된 모든 펩 티 드를 10-9 M의 최종 농도 산출 하는 PBS에 의해 희석 했다.
그림 1 . 이미징 챔버
(A) 작은 덴트와 tethering 막대 접시 (35 x 10 mm) 문화. (B) 고리 모양의 벽 퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 만든. (C) 애벌레 두뇌 explant 이미징 챔버에 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 칼슘 이미징 애벌레 두뇌 explant의
야생-타입 (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) 뇌 CCHa2, Ghrelin, 및 Nociceptin에 노출 되었다. CCHa2-R 돌연변이 (dilp2-Gal4, CCHa2-R탈-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-R탈-34) 뇌 CCHa2에 노출 되었다. IPCs에 GCaMP6s 신호 250 ms/프레임에 confocal 현미경 검사 법에 의해 감지 되었다. 여전히 선택한 시간 포인트의 이미지 (A)에 표시 됩니다. 이미지 pseudocolored 더 나은 다른 신호 강렬을 시각화 했다. 각 시간 지점에서 δ/F0 (B)에 그릴 했다. Δ/F0 는 10 다른 준비에 5에서 계산 했다. ROIs 같은 초점면에서 검색 된 셀 시체에 설정 했다. 단단한 라인 5 ~ 10 샘플의 평균 나타내고 점선의 평균 표준 오차의 위와 더 낮은 한계를 표시 합니다. 음영된 지역에서 실험 신호 변화를 나타냅니다. 눈금 막대는 50 µ m을 나타냅니다. 그림은 사노 외. 에서 적응 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1입니다. 야생-타입 IPCs CCHa2에 노출15 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2입니다. 야생-타입 IPCs Ghrelin에 노출15 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 3입니다. 야생-타입 IPCs Nociceptin에 노출15 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 4. CCHa2-R 돌연변이 IPCs CCHa2에 노출 15 여기 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
캘리포니아2 + 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니다. 이 시스템에 단독으로 또는 조합에서 분자를 테스트할 수 있습니다. 펩 티 드 호르몬 이외에 천연 또는 합성 화합물을 포함 하 여 모든 수용 성 분자는 두뇌 explant에 적용할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 이미징, 뇌 explants 곁에 있이 필요가 있다. 이 위해 젤 매트릭스 낮은 녹는 포인트 agarose 또는 섬유 소 되었습니다 사용 이전16,17. 그러나이 젤 매트릭스 샘플을 안정적으로 저장할 수 있습니다, 그리고, 조직은 이상가 열에서 30 ° c. 이 온도 poikilothermic 동물 곤충 등에서 열 충격 응답을 발생합니다. 열 스트레스를 방지 하려면 두뇌 육체적으로 곁 수 있습니다. 표 피에 부착 된 뇌 곤충 핀18로 걸린다. 텅스텐 와이어를 사용 하 여 우리의 방법을 간단 하 고 안정적인 샘플의 개최를 제공 합니다. 이 시스템 준비 하기 쉽고 재사용, 이며 메서드를 포함 하는 젤에 비해 더 쉽게 대상 세포에 도달 하는 자극 수 있습니다. 따라서,이 ligand 심사에 유용할 것 이다.
형광 표시기의 선택 대상 뉴런, 신경, 그리고 생물 학적 질문 해결 되 고 표현 된 수용 체의 종류의 종류에 따라 달라 집니다. 일련의 GCaMP6 이체 다양 한 임시 캘리포니아2 + 역학을 탐지 하기 위한 최적화 된 생성 된13되었습니다. 특히, GCaMP6 이체 다 그들의 반응 속도 론: GCaMP6s (느린), GCaMP6m (중간), 그리고 GCaMP6f (빠른). GCaMP6s와 6 분에 대 한 부패 시절은 비교적 느린 (즉., 10 활동 전위 hippocampal 슬라이스 준비에서 후 τ1/2 ) GCaMP6f는 빨리 그 동안 (τ1/2 1 활동 전위 후). 다른 유형의 신경 활동에 대 한 사용 가능한 형광 표시기 등 EPAC 캠프 (캠프), Synapto-pHluorin (시 냅 스 자료), 아크 라이트 (막 잠재력)19,,2021. 이러한 유전자 인코딩된 형광 표시기 특정 셀에 표현할 수 있습니다. 따라서,는 ex vivo 이미징 시스템에서에서 검색할 수 다양 한 응답 원하는 신경.
이 프로토콜에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 외부 조직 깨끗 한 이미지를 뇌에서 제거 되어야 합니다. 날카롭게 집게와 수술가 위를 사용 하 여 섬세 한 작업 용이. 둘째, 해 부 두뇌 위치에 고정 되어야 한다. 때때로, 뇌 샘플 pipetting (범위 약 5 µ m)에서 약간 이동 합니다. 두뇌가 이동 하지 않도록 하려면 두뇌 샘플의 크기에 이미징 챔버에 텅스텐 와이어의 높이 조정 한다. 또는, 중력-피드 관류 시스템 부드러운 자극에 대 한 설치 될 수 있습니다. 셋째, 뇌 이미징의 결과 주의로 해석 해야 합니다. Ligand 두뇌에 적용 차례로 대상 뉴런을 활성화 수 예기치 않은 뉴런 자극 수 있습니다. 특정 신경 세포에 호르몬의 직접적인 영향을 감지 하는 수용 체 해야 될 절 다운은 targetneurons에. 이 경우에, 형광 표시기의 식 RNAi Gal4/UAS 시스템을 사용 하 여 수용 체의 결합 수 있습니다.
이 프로토콜의 사소한 제한 이미징의 기간 제한 뇌 샘플의 최종 피해 때문입니다. 우리의 손에서 초파리 뇌 수 수 몇 군데에 대 한이 프로토콜을 사용 하 여 약 60 분까지. Hemolymph 같은 솔루션 HL3.1 염 분22및 레이저 강도 같은 장기 이미징을 사용 수 있습니다. 또한, 현재 이미징 설치 동일한 샘플의 반복적인 자극을 위해 적당 하다. 이러한 실험에 대 한 관류 목욕을 사용 수 있습니다.
마지막으로,이 프로토콜에는 다양 한 응용 프로그램 있다. 이미징 챔버를 수정 하 여 성인 두뇌 및 다른 초파리 조직 또는 다른 동물의 조직 수 수 몇 군데. 비 모형 유기 체에서 유전 도구의 부족은 어려웠습니다 게놈에 형광 지표를 소개 하. 그러나, 최근에 개발 된 CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술을이 동물에 유전 공학에 문을 열었습니다. 따라서,이 프로토콜 간 기관 동물의 넓은 범위에서 신호를 공부 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 지원 연구비에 의해 과학적 연구에 대 한 (15 K 07147, 17 K 07419) JSP에서 (히로시 종합, 히로코 사노), (하이), 이나 모리 재단 연구 그랜트와 공동 사용/연구 센터의 프로그램 발달 의학에 분자 발생 학, 유전학, (HS)에 쿠마 모토 대학 연구소. 우리 이미징 시스템을 사용 하 여 그들의 도움에 대 한 박사 아즈사 삿포로 야마다 다 이치 씨 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
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