Summary
סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS) יכול לגרום תרגיל דרוזופילה melanogaster באמצעות סיבוב בעוד בו-זמנית מדידת כמות הפעילות המבוצעת על ידי בעלי החיים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול נקודה-מאת-נקודת המפרט כיצד למדוד רמות הפעילות של חיות חווה תרגיל סיבובי טיפולים באמצעות את REQS.
Abstract
דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל חדש ללימודי ביולוגיה פעילות גופנית. עד כה, שתי מערכות התרגיל המרכזי, המגדל כוח, Treadwheel את תוארו. עם זאת, שיטה כדי למדוד את כמות פעילות בעלי חיים נוספים המושרה דרך הטיפול התרגיל יש שהיה חסר. סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS) ממלא את הצורך הזה, מתן מידת פעילות בעלי חיים חיות חווה תרגיל סיבובי. פרוטוקול זה פרטים כיצד להשתמש את REQS כדי להעריך את פעילות בעלי חיים במהלך תרגיל סיבובי, ממחיש את סוג הנתונים יכולה להפיק. . הנה, נדגים איך REQS משמש למדידת הבדלים ספציפיים מין או זן בפעילות תרגיל המושרה. REQS יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעה של אחרים ניסיוני פרמטרים שונים כגון גיל, תזונה או אוכלוסייה בגודל בפעילות תרגיל המושרה. בנוסף, זה יכול לשמש כדי להשוות את היעילות של פעילות גופנית שונה הכשרה פרוטוקולים. חשוב מכך, היא מספקת הזדמנות לתקנן את תרגיל טיפולי בין זנים, ומאפשר החוקר להשיג כמויות שוות של פעילות בין קבוצות במידת הצורך. לפיכך, REQS הוא משאב חדש הבולטים לביולוגים התרגיל עובד עם מערכת מודל דרוזופילה ומשלים תרגיל מערכות קיימות.
Introduction
לאחרונה, חוקרים החלו להשתמש זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster ללמוד תרגיל ביולוגיה. Melanogaster ד כבר מערכת מודל גנטי שנים מעל 1001,2. עם זאת, מחקר דרוזופילה הפך התרומה לא רק גנטיקה, אלא גם ממגוון של דיסציפלינות אחרות לרבות הנוירו-ביולוגיה, ביולוגיה התנהגותית פיזיולוגיה3. בשנת 2009, מגדל כוח, המכשיר התרגיל הראשון עבור דרוזופילה היה מתואר4. המגדל כוח מנצל תגובה שלילית geotaxis של החיות. כאשר דרוזופילה נוטים לעבור לחלק העליון של המתחם שלהם. תגובה זו מעוגנת היטב, הוא הבסיס של וזמינותו הפופולרי "טבעת" (מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי5) המשמש להערכת יכולת טיפוס ו/או כושר גופני ב דרוזופילה. המגדל חשמל משתמשת זרוע מכנית מחובר יחידה מוטורית להרים שוב ושוב את ערכה של חיות בתוך מתחמים שלהם על ידי מספר סנטימטרים ושחרורם חזרה לקרקע לזירוז התגובה geotaxis שליליות (Tinkerhess et al. . 20126 לספק וידאו המדגימה את השימוש המגדל כוח). טיפול ממושך על המגדל כוח ובכך מגדיל את הסכום של פעילות גופנית (ריצה או טיסה) החיות לבצע בהשוואה לבעלי שליטה שאינו מטופל ומעל הזמן מוביל ביצועים משופרים ב וזמינותו הטבעת עבור כושר גופני4. לכן, עבודה זו הפגין את הכדאיות של שימוש דרוזופילה כמודל עבור תרגיל ביולוגיה.
כדי להרחיב את הרפרטואר של כלים למחקר דרוזופילה תרגיל, 2016, מנדז ועמיתיו תיאר מכונת דרוזופילה התרגיל השני, Treadwheel7. בדומה למגדל כוח, Treadwheel מנצלת את התגובה geotaxis שלילי של דרוזופילה. עם זאת, תגובה זו הנגרמת על ידי המשך הסיבוב של מתחמים בעלי חיים, ולא על-ידי הרמת ושחרורם כמו מגדל כוח. שיטה זו אינדוקציה עדינה ומאפשרת עבור משטר התרגול מונחה סיבולת נוסף זה מונע כל טראומה פיזית שעלולים להתרחש במהלך פעילות גופנית במגדל כוח (ראה Katzenberger, אר ג'יי. ואח 20138 עבור השפעת חזר פיזית טראומה על בריאות דרוזופילה). בדומה מגדל כוח4, תרגיל היחס לבעלי חיים על Treadwheel מוביל למגוון של תגובות פיזיולוגיות, לרבות שינויים כושר גופני, רמות טריגליצרידים, משקל הגוף7. לכן, שתי שיטות משלימות זמינים עבור דרוזופילה ביולוגים ללמוד תרגיל.
מגבלה אחת של המגדל הכוח וגם את Treadwheel היא חוסר היכולת למדוד את כמות הפעילות הנגרמת על ידי טיפול פעילות גופנית. ניתוח של וידאו-הקלטות שנלקחו Treadwheel הדגים שהיו הבדלים משמעותיים בין זנים שונים דרוזופילה איך הם מגיבים הטיפול תרגיל7. באופן ספציפי, הזנים למד differed ב עד כמה פעילות נוספים שבעלי החיים לבצע כאשר גירוי7. התבוננות זו בקשה אותנו לפתח מערכת התרגיל השלישי, סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS), המאפשרת לנו למדוד רמות פעילות בעלי חיים במהלך הסיבוב-induced תרגיל9. REQS משתמשת פעילות זמינים מסחרית ניטור יחידת המותקנת על זרוע מסתובבת כדי לעורר פעילות גופנית דרך סיבוב כמו Treadwheel. עבודה ראשונית עם REQS. מאשרות את זה מבחינה גנטית זנים דרוזופילה — המינים - יכול לקבל תגובות שונות באופן משמעותי גירוי המסתובבת ואת ובכך כמות תרגיל המושרה אינו זהה בין אחרים שונים9 . לפיכך, REQS עכשיו מאפשר דרוזופילה ביולוגים למדוד את כמות תרגיל המושרה על ידי הטיפול, פתיחת מגוון של השדרות מחקר חדש במגרש האימונים.
כאן נתאר בפירוט כיצד להשתמש את REQS על כימות של תרגיל סיבובי. REQS המניע את תרגיל הסיבוב, בעת ובעונה אחת מודדת את רמות פעילות של בעלי החיים מטופלים. REQS הוא מסוגל להכיל מגוון של תוכניות פעילות גופנית, החל התם 2 h רציף תרגיל המשטר המודגמות כאן על שיטות אימון מרווח יותר מורכב כפי שתואר על ידי מנדז, עמיתים7. גירוי יכול להיות מותאם ויה מהירות סיבוב (בין כ 1-13 סיבובים כל דקות). בהתאם צג פעילות היחידה להשתמש בהם כדי לייצר את REQS, שיטה זו היא יכולת הסתגלות הניתוח של זבובים יחיד או אוכלוסיות גדולות של בעלי חיים. הודות צדדיות הזה, REQS מספקת דרוזופילה חוקרים עם מערך של הזדמנויות ללמוד, למשל, משטרים שונים פעילות גופנית, תזונה התערבויות או השפעת צפיפות אוכלוסין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REQS מורכב צג פעילות דרוזופילה יחידה (עבור מקור מידע, אנא ראה טבלה של חומרים) רכוב על זרוע מסתובבת הנשלט על ידי יחידת המנוע (איור 1). הצג פעילות קובעת כמה פעמים בפרק זמן נתון המערך של קרני לייזר לנתח אמצע הצינור assay מופרת. איורים מפורטים, אפיון מעמיק של, ראה שלנו הפרסום הקודם9. בעוד המערכת שלנו משתמשת יחידת LAM25H, REQS יכול להיות שונה כדי להתאים את יחידות צג פעילות דרוזופילה אחרות גם כן.
1. בדיקת ההגדרה של REQS
- עומס מבחן עף לתוך צינורות זכוכית הדגימה על ידי מאלחש את החיות עם CO2 או שיטה אחרת שבחרת עבור טיפול, להעביר אותם לתוך הצינורות ריק, וכיסוי עליון הצינורות.
- הכנס צינורות זכוכית רצ'ט הדגימה לתוך החריצים של יחידת הצג פעילות. לאבטח את צינורות גומי טבעות O (מד 17-18) באמצעות ו/או גומיות בשני הצדדים של היחידה להבטיח הצינורות לא זז במהלך סיבוב:
- להחליק o-ring אחד מעל הצינור הדגימה ומקם את o-ring בקרבת נקודת האמצע של הצינור. הוספת הצינור הדגימה לתוך חריץ של צג פעילות מהחזית, מרכז זה.
- להזיז את o-ring כנדרש ולהבטיח כי ברגע הצינור הדגימה ממורכזת, o-ring הוא החליקה שיותר יחידת צג פעילות ככל האפשר. לתקן את הצינור הדגימה במקום על ידי מחליקה o-ring השני מעל מבחנה מאחורה, שוב זז o-ring של קרוב צג פעילות היחידה האפשרית.
- ליזום סבב REQS על-ידי היפוך מתג ההפעלה בחלק הקדמי של היחידה. להתאים את מהירות הסיבוב עם החוגה בחזית של היחידה על המהירות הרצויה (4 rpm (סיבובים כל דקות) בדוגמה זו).
הערה: מהירות הסיבוב בדוגמה זו נבחרה כדי להתאים מחקר שפורסם בעבר7. ככל במהירויות הסיבוב שונות תגרום ברמות פעילות בעלי חיים שונים, כאשר ייזום מחקר חדש, אופטימיזציה של מהירות הסיבוב עבור הגדרת ניסיוני ספציפי (גנוטיפ, אורך לגבי פעילות גופנית, וכו ') עשוי להיות נחוץ.
הערה: חשוב לוודא כי הצינורות ממוקמות כהלכה, כך שהם לא לגרור לאורך החלק התחתון של היחידה REQS במהלך הסיבוב. - בדוק את החיבור למערכת איסוף הנתונים המסופקים עם יחידת צג פעילות דרוזופילה על ידי פתיחת התוכנה DAMSystem308 ולהבטיח כי האור חיבור נשאר ירוק עבור מספר סבבים. התוכנה תתחיל ההקלטה לתוך קובץ טקסט "monitorX" (X להיות מספר יחידה אם צגים מרובים נמצאים בשימוש) מיד באתחול. הקלטה תדירות יכול להיות מותאם בלשונית "העדפות"; אנחנו בדרך כלל להקליט במרווחי זמן של 5 דקות.
- לחקור את קובץ הטקסט שנוצר על ידי תוכנת DAMSystem308 כדי להבטיח חיבור הנתונים מתפקד כראוי. בעיות עם החיבור לגרום מגזרות, נקודות זמן שבו פעילות 0 נרשם עבור כל העמדות ב REQS (ראה נציג תוצאות , טבלה 2). אם התרחשה מגזרות, להתאים חיבורי נתונים המוביל אל שקע הטלפון מסתובב, כמו במהלך סיבוב, חיבור זה יכול להיות חופשי או מעוות. אנו מוצאים כי ייצוב הקשר עם הקלטת מסייעת למניעת בעיה זו.
2. הכנת חיות
הערה: כל בעלי החיים היו מורמות, נבדק בתנאים רגילים בתוך אינקובטור (25 ° C, לחות 60-70% 12 h/כהה מחזור) מולסה/קמח תירס מדיה10.
- שבועיים לפני הניסוי המתוכנן, להגדיר את צלוחיות עם צפיפות בעלי חיים מבוקר כדי לאסוף זבובים ניסיוני אנחנו בדרך כלל להגדיר צלוחיות עם 7 זכרים ונקבות 10. עם מלאי בריא, מבקבוקון אחד, כ 15 בתולה זכרים ונקבות 15 ניתן לאסוף יותר מיום 4 פרק זמן. לכוונן את מספר צלוחיות להגדיר מבוסס על מספר בעלי חיים לצורך וזמינותו; וזמינותו טיפוסי במעבדה שלנו כולל 10 סטים של 10 בתולה זכרים ונקבות לכל גנוטיפ (100 זכרים ונקבות 100).
הערה: זבובים לא בתולה יכול לשמש בהתאם השאלה ניסיוני ספציפיים. אם וקהילותיהם ניסויים בחיות לא בתולה, הזחלים הסריקה עלולים להפריע ניטור פעילות מדויקת. - הסר את הזבובים האב שבוע לאחר הגדרת הבקבוקונים.
- החל ביום 10 לאחר הגדרת הבקבוקונים, לאסוף זבובים בתולה הבקבוקונים ולאחסן אותם כשהם מופרדים באמצעות סקס.
- לאסוף חיות מספיק כדי להפוך את הניסוי גיל אותם כמו צורך, 3 ימים בדוגמה זו.
הערה: אנחנו בדרך כלל עזים ומתנגד החיות עם CO2 לטיפול. CO2 ידוע להשפיע על רמות פעילות בעלי חיים לתקופות ממושכות של זמן לאחר הטיפול (ראה לדוגמה, ברתולומיאו. ואח 201511). אם התוצאה2 CO מפריע מבחני במורד הזרם המתוכנן או ניתוחים, להשתמש בשיטה הרדמה שונים כגון קרח ההרדמה.
3. איסוף נתונים עם REQS
- עזים ומתנגד החיות כדי לשמש לצורך המחקר כימות תרגיל עם CO2 או שיטה הרדמה נוספת. לחלק אותם לקבוצות לפי הצורך ולטעון את הקבוצות של בעלי חיים לתוך הצינורות כוס ריקה של צג פעילות; בדוגמה זו, חיות 10 בני אותו גיל מוטענים לכל שפופרת זכוכית, משכפל 10 עבור כל סוג בעל חיים (גנוטיפ/סקס). הקפד לציין איזה סוג בעל חיים ייטענו כל שפופרת.
הערה: לניסויים יותר זמן, מזון יכולים להיכלל בתוך הצינורות הדגימה. במקרה זה, זה חיוני כי האוכל הוא מאובטח, לא הופכים יצאה ממקומה במהלך הסיבוב. - לטעון את צינורות assay זכוכית לתוך יחידת REQS ולאבטח אותם עם גומי טבעות O. אם עובדים עם אחד או יותר סקס/גנוטיפ, באמצעות עיצוב בלוק אקראי או אקראיות של העמדה של החיות REQS יבטל כל תופעות מיקום פוטנציאליים. אקראיות יכולה להיות מושגת על-ידי הקצאת כל מבחנה מספר אקראי, לדוגמה ממבוסס-אינטרנט מחולל מספרים אקראיים (למשל, https://www.randomizer.org/) או בגיליון אלקטרוני ולאחר מכן מזמין את הבקבוקונים בהתבסס על מספר אקראי.
- מניחים את REQS החממה להבטיח טמפרטורה קבועה, לחות, אור תנאים. ודא כי כבלי נתונים והן כוח מחוברים כראוי.
- לאפשר את החיות להתאושש מן ההרדמה, כדי להתרגל לסביבה חדשה עבור 1 h.
- להתחיל את הניסוי על ידי ייזום סבב REQS במהירות הרצויה.
הערה: אפשרות נוספת היא לאסוף נתוני פעילות בסיסית תחילה מן החיות לפני אתחול של סיבוב, ואחריו הקלטה רמות הפעילות בתגובה לגירוי המסתובבת. - ליזום איסוף נתונים על-ידי פתיחת התוכנה DAMsystem308 (פתיחה פשוט איסוף הנתונים יוזם תוכנה). נתונים נכתבות בקובץ טקסט במרווח קבוע (כאן, 5 דקות); במידת הצורך, לשנות את ההגדרות מרווח זמן בלשונית "העדפות" (ראה שלב 1.4).
- כדי להבטיח כי הנתונים מועברים בהצלחה אל המחשב, פתח את קובץ הטקסט שנוצר על ידי התוכנה DAMsystem308 לאחר מרווחי זמן אחד או שניים חלפו, לאשר כי נתונים נכתבים לקובץ. לסגור ולפתוח מחדש את הקובץ כדי לראות את הנתונים של כל נקודות זמן נוסף. לאסוף נתונים עבור הסכום הרצוי של זמן; בדוגמה זו, 2 h.
הערה: אל תפתח החממה במהלך תקופת assay, החיות רגישים מאוד כל הפרעה, סביר להניח יגיב עם פעילות מוגברת. - בסוף התרגיל וזמינותו, לסיים את איסוף הנתונים על-ידי סגירת התוכנה DAMsystem308, ואז לכבות את REQS. להסיר את החיות של הצינורות assay זכוכית ולנקות את הצינורות. בעלי החיים ניתן להעביר בחזרה לתוך צלוחיות אוכל אם חוזרים עליו נדרשים אמצעים בגילאים שונים.
הערה: אם מקרי מוות מתרחשים בתקופת המשטר התרגיל, זה צריך להיות הקליטה הנוכחות של זבובים מתים יכולים להשפיע פעילות ספירות. מניסיוננו עם DGRP2 קווים לטוס12,13, להתאמן סל ד 4 2 h לא לגרום ישנם מקרי מוות, אך זנים חלשים יותר יכול. להגיב בצורה שונה.
4. ניתוח נתונים
- פתח את הקובץ. txt עם התווית "Monitor1", המיוצר על ידי התוכנה DAMSystem308.
- בדוק את קובץ הנתונים על בעיות אולי התרחשו במהלך רכישת נתונים (נקודות זמן שלא נענתה, וכד' טבלה 1). במידת הצורך, לצנזר את הקובץ על-ידי הסרת נקודות נתונים ב ההתחלה ואת הסוף של ההקלטה.
- באמצעות תוכנה סטטיסטית שתבחר (למשל, R), לנתח את הנתונים שנאספו. ליצור סטטיסטיקה תיאורית, לבצע ניתוח השונות (ANOVA) לחקור תופעות כגון מין, גנוטיפ, אם הנתונים מופצים בדרך כלל. אם הנתונים אינם מופצים בדרך כלל, השתמש בשיטות שאינן פרמטרי, כגון בדיקות Kruskal-איי ווליס, כדי להשוות בין קבוצות. הניתוחים הספציפי הנדרש תלוי השאלה מדעיים ספציפיים, הנבחנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפלט הפעלה בודדים עם REQS הוא טבלת נתונים המיוצר על ידי התוכנה DAMSystem308, אשר יסומנו כסעיפים "Monitor1.txt" כברירת מחדל (עבור ראה דוגמה 1 קובץ משלים). קטע מתוך טבלה כזו מוצג בטבלה 1. כל עמודה מכילה את הנתונים טיוב assay בודדים, בעוד השורות להכיל את הפעילות נמדד בכל מרווח זמן מתחילת הניסוי (למעלה) עד הסוף (למטה). נקודות הנתונים שלוש הראשונות צריך לפקח בכל מקרה שבו יש מגזרות נתונים (כגון אלה ב בטבלה 2), שבו חייב להיות מותאם במקרה הכבל.
איור 2 מציג את תוצאות ניסוי השוואה בין ארבע שורות דרוזופילה שונות גנטית (DGRP2 קווים 371, 703, 810, ו- 89712,13). עבור כל אחד מתוך ארבעת הקווים, שכפול עשרה המידות מקבוצות של 10 זבובים בתולה של שני המינים היו נאספים המתוארות בסעיף פרוטוקול. מתוך קובץ הפלט של תוכנת DAMSystem308, "ממוצע פעילות כל 5 דקות לכל 10 זבובים" מחושב על ידי חישוב ממוצע הצעדים פעילות לאורך טווח כל הזמן 2 שעות. זה ממוצע של כל עמודה ובכך מייצרת מדד יחיד עבור כל תא וזמינותו. טבלת הערסל איור 2 המבוסס על מסופק בטבלה3.
הנתונים המוצגים בטבלה 3 נותחו על ידי ANOVA, בדיקת אפקטים של גנוטיפ, סקס, האינטראקציה בין סקס לבין גנוטיפ. רק את ההשפעה של גנוטיפ היה משמעותי (p < 2 x 10-16), שני המינים היו משולבות בגרף באיור 2. מקרה ANOVA זיהה השפעה חזקה של גנוטיפ, אשר מתבטא בגרף. רמות פעילות תרגיל מרושע בין כל ארבעת אחרים הם שונים באופן משמעותי אחד מהשני (p < 0.05; של Tukey HSD), ועל כך, איור 2 מדגים איך REQS יכול לשמש כדי לזהות את ההשפעה של גנוטיפ ברמות פעילות גופנית.
איור 1: REQS. מוצג בתצלום זה משמש את REQS בהליך זה. יחידת צג פעילות (A) מסתובב סביב צירו האופקי מונע על ידי זרוע מסתובבת (B). מהירות סיבוב מתכוונן באמצעות החוגה (C), הפעולה של המכונה נשלטת על ידי מתג הפעלה/כיבוי (D). שיבוץ (E) מראה מקרוב חיבור הנתונים בין יחידת צג פעילות לבין שקע הטלפון מסתובב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השוואה של פעילות גופנית כפי שנמדד על ידי REQS ב ארבעה זנים DGRP. ציר x: גנוטיפ בעלי חיים. ציר y: פעילות בעלי חיים הנמדדת קרן המעברים לכל חיות 10 בכל 5 דקות. ת DGRP2 קו 897; ב': קו DGRP2 810; C: קו DGRP2 703; D: DGRP2 קו 371. הגרף שמוצג כאן משלב נתונים של זכרים ונקבות, כפי שהיה אין השפעה משמעותית סקס לקווים האלה ספציפית (ANOVA; p = 0.557). עם זאת, יש אפקט חזק גנוטיפ (ANOVA; p < 2 x 10-16), כל בודדים השוואות בין ארבעה אחרים הם מאוד משמעותי (של Tukey HSD; p < 0.05). יהלום שחור: גנוטיפ אומר; שחור קו: + /-אחד SD (סטיית תקן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| זמן | Activity(1) | Activity(2) | Activity(3) | Activity(4) | Activity(5) |
| 25: 12:00 | 21 | 86 | 48 | 32 | 76 |
| 30: 12:00 | 31 | 55 | 58 | 74 | 119 |
| 35: 12:00 | 27 | 45 | 47 | 80 | 125 |
| 40: 12:00 | 28 | 55 | 34 | 83 | 91 |
| 45: 12:00 | 36 | 56 | 45 | 67 | 103 |
טבלה 1: דוגמה פלט של נתונים מדויקים בתוכנת ה-DAMSystem308. כל עמודה "Activity(#)" מייצג את בקבוקון אחד של 10 זבובים, עם פעילות הקליט במרווחים של 5 דקות.
| זמן | Activity(1) | Activity(2) | Activity(3) | Activity(4) | Activity(5) | זה הכל באשמתך |
| 12:00:00 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | כן |
| 05: 12:00 | 98 | 1 | 36 | 0 | 8 | לא |
| 10: 12:00 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | כן |
| 15: 12:00 | 88 | 24 | 44 | 1 | 9 | לא |
| 20: 12:00 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | כן |
| 25: 12:00 | 106 | 51 | 41 | 0 | 15 | לא |
בטבלה 2: דוגמה פלט של נתונים פגום עם אובדן מנות בתוכנת ה-DamSystem308. כל עמודה מייצגת בקבוקון אחד של 10 זבובים, עם פעילות הקליט במרווחים של 5 דקות. שורות 12:00:00, 10: 12:00, 12:20:00 מציגים "0" הקלטות פעילות לאורך כל העמודות, המציינת בעיה עם חיבור הנתונים (אשמתו? "כן" בעמודה האחרונה).
טבלה 3: נתוני לדוגמה המשמש ליצירת באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה קובץ 1: קובץ הפלט לא מעובד מיוצר על ידי תוכנת DAMSystem308. עמודה 1 רשומות המספר נקודת זמן. טור 2 רשומות לתאריך של הניסוי, עמודה 3 רשומות הזמן שלכל נקודת זמן נרשם. לא נעשה שימוש בעמודות 4-10, עמודים 11-42 לייצג את הקלטות החריצים 32 של הצג פעילות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמו התוצאות נציג להמחיש, REQS הוא מסוגל באופן מדויק מדידת הפעילות של פעילות גופנית דרוזופילה. REQS הוא גמיש ומאפשר לחוקרים על מגוון שאלות המחקר הקשורות תרגיל ביולוגיה או תרגיל התערבויות. ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול כדי לסמן. קודם כל, זה חיוני כדי לבדוק את ההתקנה של REQS על מנת להבטיח כי העברת נתונים מ- REQS כדי DAMSystem308 פועל כראוי. אם לא כווננה כראוי, כבל הנתונים יכול מסובך במהלך הסיבוב, לעיתים הקשר בין את REQS את DAMSystem308 מופרת על הקשר מסתובב עקב בלאי (למרות, עם שימוש כמעט מדי יום REQS, היה עלינו החלף את המחבר פעם בשנתיים). הוא זהיר לשמור על חלקי חילוף בהישג יד. שנית, מרקם של פרמטרים סביבתיים חיוני להצלחת הניסויים. דרוזופילה רגישים מאוד רעש או רטט, לכן חשוב כי הניסוי לא מופרע בעת איסוף הנתונים. לכן, באופן אידיאלי, ניסויים מנוהלים בחממה ייעודית שהגישה אליו היא לא במהלך ההפעלה הניסיונית. תשומת לב אלה שני שלבים קריטיים יבטיח כי באיכות גבוהה נתונים נאספים מן REQS.
בעוד נדגים כאן איך REQS יכול לשמש כדי למדוד פעילות בעלי חיים במהלך טיפול 2 שעות פעילות גופנית רציפה מקבוצות של בעלי חיים, REQS הוא גמיש בכך הזמן ואת עוצמת פעילות גופנית ניתן להתאים למגוון רחב של טיפולים פעילות גופנית. בנוסף, בהתאם צג פעילות היחידה בשימוש, זה יכול להיות שונה למדוד פעילות זבובים יחיד או אוכלוסיות גדולות מאוד של בעלי חיים. בנוסף, REQS יכול לשמש כדי לבדוק את העיצוב ואת אופטימיזציה של משטרים התרגיל. זה יכול לשמש גם כדי למדוד את ההשפעה של משתנים נוספים כגון זמן של יום, חיים גיל, תזונה, גודל האוכלוסייה או הטיפול בתרופה על תגובות פעילות ופעילות גופנית המושרה. בהתאם הגדרת הניסוי המדויק, קרי, אורך התרגיל המשטר ואת התזמון, REQS יכול לשמש גם להפריע דפוסי השינה הטבעית של דרוזופילה. הדוגמאות האלה ממחישות את אופי תכליתי את REQS ואת מספר שימושים פוטנציאליים במחקר דרוזופילה. קהילות קטנות מחקר בבעלי חיים אחרות ייתכן גם מעוניין בהתאמת את REQS למטרות שלהם, ובכך מרחיבה את התועלת של הכלי החדש.
כיום, מגבלה אחת של REQS הוא מספר מוגבל של דגימות ניתן לעבד בזמן נתון, אשר היא מוכתבת על ידי המוניטורים פעילות בשימוש, אשר assay מרבי של 32 דגימות. בעוד השימוש של מספר יחידות REQS הוא אפשרי לאפשר את REQS לשמש עבור מסכי גנטי בקנה מידה גדול או יישומים דומים, פיתוח של גירסה תפוקה גבוהה יותר של REQS יהיה אידיאלי.
בשל יכולתה למדוד רמות פעילות המושרה בצורה זהה Treadwheel, REQS יכול לשמש בשילוב עם Treadwheel, מה שמאפשר עבור תפוקה גבוהה יותר במקצת (דוגמאות 48 יעובד בכל פעם). ניתן למטב תרגיל פרוטוקולים באמצעות את REQS ולאחר מכן ליישם Treadwheel ללימודי. לפיכך, Treadwheel ואת REQS יכול לשמש משלימים לצורך מחקר ספציפי עיצובים.
REQS הוא צעד חשוב קדימה במחקר דרוזופילה תרגיל זה מאפשר כימות של הפעילות המושרה. יש מכונה בו זמנית יכול לגרום תרגיל ולמדוד שאת התרגיל הזה היה שברור צריך בדרוזופילה תרגיל שדה, קבוצת מדענים גרמניים באופן עצמאי שפותח מכשיר דומה מאוד, כינה "סווינג הסירה," זה גם מנצל פעילות צג למדוד פעילות במהלך תרגיל המושרה על ידי סיבוב14. "סווינג הסירה" אינו משתמש סבבים מלאה, אך במקום זאת מניף את צג פעילות יחידת בחזרה ואת ושוב כ- 30 מעלות סביב ציר הסיבוב. לפיכך, "סווינג הסירה," כמו REQS, משתמשת הסיבוב ללא הרף לגרום לתגובה שלילית geotaxis ולהגדיל את פעילות בעלי חיים. REQS, המשלים "סווינג הסירה", קיים מעקב וידאו שיטות השתמשו כדי assay דרוזופילה לאחר גירוי, כגון מערכת (DART) דרוזופילה עוררות מעקב15. הן REQS את והסירה "סווינג" לשפר את מערכות כמו החץ, אשר לעקוב אחר פעילות רק לאחר הפסקת הגירוי. כך, REQS ואת "סווינג הסירה" הם כלים חדשים חשוב לחוקרים בתחום פעילות גופנית דרוזופילה, אשר יכול לשמש בשילוב עם התקני Treadwheel ומגדל כוח הקיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי פרס מספר P30DK056336 מ נבחרת המכון של סוכרת, עיכול, מחלות כליה באמצעות מענק פיילוט תזונה, השמנת יתר מרכז מחקר ב אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם NCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | Trikinetics | LAM25H | REQS component |
| Telephone Cord Detangler | Uvital | uv20170719 | REQS component |
| Vial closures (flugs) | Genesee Scientific | 49-102 | Drosophila culture supplies |
| Vials | Genesee Scientific | 32-120 | Drosophila culture supplies |
| Drosophila culture netting | Carolina Biological Supply | 173090 | Drosophila culture supplies |
| Cornmeal | Pepsico | 43375 | Drosophila media |
| Molasses | Golden Barrel | BLA-GAL | Drosophila media |
| Agar | Apex Bioresearch | 66-103 | Drosophila media |
| Inactive Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-106 | Drosophila media |
| Tegosept | Apex Bioresearch | 20-258 | Drosophila media |
| Propionic acid | Genesee Scientific | 20-271 | Drosophila media |
References
- Rieder, L. E., Larschan, E. N.
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4 (6), e5886 (2009).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (61), (2012).
- Mendez, S., et al. The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila. PLoS One. 11 (10), e0164706 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS One. 12 (10), e0185090 (2017).
- Reed, L. K., et al. Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298 (2015).
- Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).
- Mackay, T. F., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease. Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).
- Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Sci Rep. 5, 8454 (2015).
