Summary
이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.
Abstract
이 프로토콜, 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질 및 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 단백질 subcellular 지 방화 변화;을 추적 하는 데는 얼룩 특히, 아래는 열 핵 전 스트레스 조건. 단백질 반응 대응에 외부 및 내부 신호. 공통 메커니즘의 subcellular 지 방화를 변경 하는. 이 문서는 항 체, 방사성 라벨 또는 confocal 현미경 요구 하지 않는 단백질 지 방화를 추적 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 문서에서는, GFP 포유류 CLIC4를 포함 하 여 염화 세포내 채널 단백질 (CLICs) 가족의 C. 선 충, 구성원에에서 대상 단백질 EXL-1 태그 데 사용 됩니다. (모터와 전체 유전자 시퀀스) 통합된 변환 exl 1::gfp 유전자 변형 라인 변환 및 γ 방사선에 의해 창조 되 고 안정적으로 유전자와 gfp를 표현 한다. 최근 연구는 열 스트레스, 아니라 산화 스트레스, 따라 EXL 1::GFP 핵에서 축적 했다. 핵 구조와는 DAPI GFP 신호 겹치는 신호 스트레스 EXL 1 subcellular 지 방화 변경 확인 합니다. 이 프로토콜 선물 DAPI 얼룩에 대 한 두 가지 다른 고정 방법: 고정은 에탄올과 아세톤 고정. 이 문서에 제공 된 DAPI 얼룩 프로토콜 신속 하 고 효율적 이며 GFP 신호 및 단백질 subcellular 지 방화 변경. 이 메서드는만 Nomarski, FITC 필터와 DAPI 필터 형광 현미경을 요구 한다. 그것은 작은 실험실 설정, 학부 학생 연구, 고 등 학생 연구 및 생명 공학 교실에 적합 합니다.
Introduction
단백질 subcellular 지 방화의 변화는 열 스트레스, 기아, 산화 스트레스, apoptosis, 단백질 인 산화 등 내부 또는 외부 신호에 응답에서 일반적인 메커니즘입니다. 예를 들어 열 스트레스는 FOXO 회원 DAF 16 핵 전 좌1,2, 및3,4신호 수신 죽음 미토 콘 드리 아에 입찰 translocates 프로 apoptotic BCL-2 단백질을 유도 합니다. 다양 한 기술을 이러한 변화를 감지할 수 있습니다. 서 부 럽 고 화학적 분리 subcellular 구조 (예, 미토 콘 드리 아 또는 핵)의 조합을 잘3목표 달성할 수 있었다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질에 대하여 특정 항 체를 요구 한다. 따라서, 잘 설립 된 항 체는 성공에 열쇠 된다. 다른 접근은 다른 subcellular 구조 또는 세포 녹색 형광 단백질 (GFP), 빨간 형광 단백질 (RFP), 노란색 형광 단백질 (YFP), mCherry, 등 다양 한 마커 라벨 한편 라벨의 단백질을 다른 표시와 관심입니다. 그런 다음 대상5,6지역화 confocal 현미경 그들을 관찰 합니다. 방사성 동위 원소는 대상 단백질 레이블 및 다음 그들의 subcellular 지 방화7감지 대안 선택 이다. 그러나,이 메서드는 적절 한 교육 및 방사성 폐기물의 처리를 해야합니다. 특정 항 체의 부족, 적절 한 마커의 부재 또는 confocal 현미경 등의 scarceness 상황 대체 접근 고려 될 필요가 있다. 단백질의 핵 전 좌를 식별 하려면 그것만 표시와 함께 대상 단백질을 분류 하 고 얼룩 핵 화학 시 약 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)이만 일반 형광 현미경을 필요로 하기 때문에 함께 매력적입니다.
Immunolabeling C. 선 충 항 체와 달걀 껍질 또는 동물을 둘러싼 collagenous 표 피에의 낮은 침투성으로 인해 도전 이다. 한편, 선 충 C. 단백질 그들의 척추 orthologs에서 크게 분기 이기 때문에, 몇몇 상업 회사 특정 제품 C. 선 충 을 제공 합니다. 자신에 대 한 C. 선 충 항 체를 생성 하는 작은 실험실 어렵습니다. 종종 지역 사회에 있는 연구원은 단백질 지역화 또는 유전자 발현을 보여 주기 위해 태그 단백질 마커로 사용 합니다. 이 문서의 예를 들어 EXL 1::GFP를 사용 하 여 열 스트레스8에서 단백질 핵 전 좌를 추적. 동물 게놈에는 통합된 변환 exl 1::gfp 는 안정적으로 gfp 융해 유전자를 표현 하는 데 사용 됩니다. 연구 exl-1 소장, 체 벽 근육, 및 다른 subcellular 구조8에 표현 했다. 이 프로토콜에서는 벌레 애벌레 4 (L4) 단계로 동기화, 열 스트레스 실험, 및 행위 DAPI 얼룩, 에탄올 고정, 아세톤 고정 및 일반 형광 현미경 이미징 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 솔루션
-
NGM 플레이트
- 2l 삼각 플라스 크에 NaCl의 3 세대, 한 천의 17 g, 펩의 2.5 g와 dH2오 커버 알루미늄 호 일로 플라스 크의 입의 975 mL를 추가 합니다. 압력솥 50 분에 대 한 플라스 크 20-30 분 동안 그것을 멋진.
- 멸 균된 솔루션 추가: 1 mL의 1 M CaCl2, 에탄올에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 및 1 M KPO4 (pH 6.0) 버퍼의 25 mL. 그들을 잘 혼합 솔루션을 소용돌이 친다.
- 액체 디스펜서를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에 NGM 솔루션 분배. 한 천의 격판덮개 2/3 전체 채우기. 나중에 사용할 4 ° C에서 밀폐 용기에 그들을 저장 합니다.
-
1 M KPO4 버퍼 (pH 6.0)
- KH2포4 10.83 g와 dH2O, K2HPO4 의 3.56 g 녹 이십시오 다음 100 ml 전체 볼륨을 조정 합니다. 압력솥 15 분에 대 한 솔루션입니다.
-
M9
- KH2포4, 나2HPO 6 g의 3 세대 분해4및 5 g dH2O, NaCl의 1 mL의 1 M MgSO4, 추가 하 고 1 L. 총 볼륨 조정
-
10 µ g/mL DAPI
- DAPI dH2오의 999 µ L에 10 mg/mL의 1 µ L을 추가
-
95% 알콜 (v/v)
- 100% 알코올의 95 mL를 측정 하 고 증류수 100ml에 볼륨 조절 추가.
-
30% 아세톤 (v/v)
- DH2O 30 mL의 아세톤을 추가 하 고 100 ml 전체 볼륨을 조정 합니다.
2. 열 스트레스
- Extrachromosomal 배열 라인과 대상 유전자9,10의 변환 구문 생성 합니다. 또는,에서 꼬마 유전학 센터 (CGC), C. 선 충 연구를 위한 공공 자원 인 또는 이전에 게시 연구 실험실에서 같은 라인을 얻을.
- Extrachromosomal 라인을 3800 Rad γ 방사선9벌레를 노출 하 여 게놈에 통합할. 그런 다음 선택 안정적으로 표현한 라인 롤러 등 GFP 마커 단백질을 표현 하는 동물.
- 방사선 중에 생성 된 돌연변이 제거 하려면 outcross 라인 적어도 2 x. 이 유전자 변형 라인을 사용 하 여 스트레스 단백질 식 패턴 변화 감지.
- 1.1 단계에서 설명한 대로 NGM 웜 접시를 준비 합니다. OP50 복제를 행진 하 고 하룻밤 액체 LB 국물에 박테리아 문화. 벌레를 위한 음식 근원으로 박테리아 잔디를 성장 씨앗 NGM 접시 액체 OP50와 문화 고 37 ° C 배양 기에서 번호판을 품 어 하룻밤. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 식혀.
- 열 스트레스 분석 결과 이전에 적어도 2 세대에 대 한 기아 없이 20 ° C에서 유전자 변형 라인을 성장.
- 새로운 벌레 플레이트, 그리고 하자 그들에 대 한 3-5 h에 대 한 알을 8-10 젊은 벗 성인 (자 궁 가득 계란)을 선택 하 고 모든 성인 판에서 제거.
- 벌레를 동기화 하려면 계란 해치 고 약 48 h에 대 한 애벌레 애벌레 (L4)의 4 단계로 성장 하자. 그들의 외 음부 구조 (반달 구조) L4 단계 (그림 1, 화살표)11를 식별 하기 위해 검사 합니다.
- 열 스트레스를 달성 하기 위해 2-5 h 35 ° C 배양 기에서 L4 애벌레와 벌레 접시를 놓습니다. 정확 하 게 온도 측정 하는 인큐베이터에 온도계를 넣습니다.
3. DAPI 얼룩
-
에탄올 고정
- 유리 슬라이드 중앙에 M9 버퍼의 10 µ L를 추가 합니다.
- 단계 2.8에서에서 열 충격 벌레를 선택 하 고 유리 슬라이드에 M9 버퍼에 넣어.
- 또는, M9와 접시를 씻어, 실내 온도에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심 고는 상쾌한 삭제 합니다. 유리 슬라이드에 벌레를 추가 합니다.
- 부드러운 휴지를 사용 하 여 모든 초과 액체를 배출 하. 조심 해 현미경이 단계.
- 벌레에 95% 알코올의 10 µ L을 추가 하 고 그들이 건조 한 공기. 해 현미경 과정을 시청 하 고 너무 건조 얻을 하는 동물을 두지 마세요. 에탄올은 동물에서 증발 하 고, 후에 바로 다음 단계로 진행 합니다.
참고: 에탄올 매우 빠르게 증발. - 두 번 반복 단계 3.1.4 벌레 고정 되도록.
참고: 그것은 어두운 하 고 왜곡을 보고 동물에 대 한 정상입니다. - DAPI의 10 µ L 추가 (10 µ g/mL) 벌레를. 즉시는 coverslip로 그들을 커버 하 고 투명 한 매니큐어 젤 슬라이드 인감.
- 형광 현미경에서 약 10 분 후 동물을 보기.
-
아세톤 고정 (대체 방법)
- 단계 2.8 m 9에서에서 열 충격 격판덮개 떨어져 세척 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심은 상쾌한 삭제. 씻어 dH2O의 1 mL와 펠 릿, 펠 릿, 수집 하 고 삭제는 상쾌한.
- 1000 x g 실 온에서 1 분에 15 분 원심 분리기에 대 한 30% 아세톤의 400 µ L을 추가 하 고 삭제는 상쾌한. DH2O의 500 µ L를 사용 하 여 씻어 동물 2 x. 폐기는 상쾌한.
- DAPI의 200 µ L 추가 (10 µ g/mL), 또는 15 분 동안 관에서 총 벌레 볼륨의 금액 x 4.
- 1 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 2 펠 릿을 세척 dH2오 500 µ L x 벌레 유리 슬라이드에, coverslips와 함께 그들을 커버, 투명 매니큐어 젤, 슬라이드 봉인 놓고 형광 현미경 동물을 관찰.
4. 현미경 이미징
- UV 광원 및 형광 현미경 켭니다. 현미경에 연결 된 컴퓨터를 켭니다.
- 형광 현미경에 슬라이드를 로드 합니다. 낮은 전력 목표 렌즈 (10 배)를 사용 하 여 벌레, 찾아서, 400 X, 확대 힘 증가 표본에 집중.
- 현미경으로 제공 하는 소프트웨어를 엽니다. 메뉴;에서 "인수" 클릭 "카메라"에 클릭 하 고 현미경;에 연결 된 카메라를 선택 소프트웨어와 통신 하기 위해 선택 된 카메라 수 있습니다.
참고: 다른 현미경 작업에서 달라질 수 있습니다. - 같은 "수집", "다차원 수집"에 클릭 합니다. 새로운 "다차원 수집" 탐색 창이 열립니다. "다중 채널" 버튼을 클릭 하 고 모든 사용할 수 있는 채널이 표시 됩니다.
- 파랑, 녹색, 및 표본 관찰 하 DIC (미분 간섭 명암)를 선택 합니다. "다차원 수집" 탐색 창에서 두고는 "블루-DAPI", "그린-GFP", 및 "회색-DIC", "Nomarski" 채널 "레드-rhodamine" 및 "백색 밝은 분야", 등의 다른 채널을 마우스 오른쪽 단추로 그들을 닫습니다.
-
첫째, 각 채널에 대 한 노출 시간 측정:
- "블루-DAPI" 채널을 선택 하 고 다음 자동된 노출 시간 DAPI 채널에서 라이브 이미지 "측정"에 클릭 왼쪽 클릭 하십시오. 라이브 이미지와 함께 새로운 창이 나타납니다.
- 라이브 이미지 창의 왼쪽에 원하는 대로 이미지를 만드는 데 필요한 경우 수동으로 노출 시간을 조정 합니다.
- 마지막으로, "확인 클릭" 라이브 이미지 창에서. 이 DAPI 채널에서 노출 시간을 설정합니다.
- 다른 채널, "그린-GFP" 및 "회색-DIC", "Nomarski", 그 채널에 대 한 노출 시간을 설정 하려면 4.6 단계를 반복 합니다.
- "다차원 수집" 탐색 창에서 "시작" 설정으로 특정 노출 시간 순서 (위 참조) 3 다른 채널에서 3 이미지를 자동으로 수집을 클릭 합니다.
- 파일을 저장 하려면 주 메뉴에, "파일" 다음 "다른 이름으로 저장"을 클릭 합니다. 파일 이름 및 폴더 이름을 입력 합니다. 나중에 참조할 수에 대 한 상세한 이미지 정보를 유지 하려면 기본 파일 형식으로 파일을 저장 합니다.
-
다른 형식으로 파일을 내보내려면:
- "파일"에 고 "내보내기"를 클릭 합니다. 이것은 수출 설정 창을 열 것 이다.
- 파일 이름 및 폴더를 설정 합니다. 데이터 구성 "프로젝트 폴더 만들기"를 선택 합니다. 소프트웨어는 또한 다른 4 옵션을 지정 하려면 사용자 수 있습니다: "생성 병합 이미지", "이미지에 대 한 색상을 사용", "사용 하 여 채널 이름" 및 "결합 된 이미지에 만".
- "TIF", "BMP", "PSD", 또는 "JPG" 및 다른 형식 예: 드롭-다운 메뉴에서 원하는 파일 형식을 선택 합니다. 다음 클릭 하십시오 "시작" 내보낼.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
염화 물 채널 세포내 단백질 (클릭)는 높은 종12에 걸쳐 보존 다기능 단백질. 많은 연구가 보여줍니다 CLICs 세포, autophagy, apoptosis, 발암, 신생, 긴장과는 포유류 시스템13,,1415,16 대 식 세포 타고 난 면역 반응 조절 ,17. C. 선 충에 있는 두 개의 클릭 homologs: exl 1 과 실-4. 우리의 최근 연구가 보여주었다 exl 1 조절 동물 스트레스 관리8. 우리는 변환 exl 1::gfp 구조는 동물 게놈으로 통합 하 고 안정적으로 유전자 exl-1 는 GFP 마커 (그림 2A 와 2B)로 표현 하는 유전자 변형 라인을 만들었습니다. 열 스트레스, 강한 GFP 신호 (그림 2 C-E) 핵 구조와 겹치는 이후 EXL 1::GFP 장 지역에서 핵에서 축적. 확인 하려면 subcellular 지 방화, DAPI 얼룩 사용 되었다 접근으로는 핵 얼룩. 동물의 시체 (그림 3B)에 DAPI 얼룩 쇼 명확한 핵에 대 한 에탄올 고정을 사용 하 여. 아세톤 기정은 또한 유사한 결과를 (그림 3E)을 달성 한다. 겹치는 GFP와 DAPI 신호 EXL 1::GFP 실제로 장 지역 (그림 3C, F)에 핵에서 축적 된 확인 합니다.
그림 1: 4 (L4) 애벌레의 이미지 다른 확대 능력에서 C. 선 충 무대. (A) 63 X, (B) 115 X, 및 (C) 400 X 배율 파워. 화살표 L4 웜;의 외 음부를 가리킨 참고 반달 구조입니다. 눈금 막대에 모든 이미지 100 µ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 열 스트레스, EXL 1::GFP 내장의 핵에서 축적. (A) 열 충격 전에 장 지역의 Normaski 이미지. (B) 강한 GFP 신호 열 충격 전에 instestinal 지역에서 관찰 되었다. (C) 열 충격 (장 지역의 핵에 화살표 지점) 후 장 지역의 이미지를 Normaski. (D) 열 충격 후 강한 GFP 신호 축적. (E) 겹친 GFP와 Normaski의 이미지. 모든 사진은 400 X 확대 전력으로 찍힌다. 눈금 막대 = 모든 이미지에서 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: EXL 1::GFP 핵 전 확인 DAPI 얼룩으로. (A-C) DAPI 얼룩에 대 한 에탄올 고정을 사용 하 여. (D-F) DAPI 얼룩 아세톤 고정 사용 하. A 와 D, 그린 컬러는 장 지역에 GFP 신호를 보여준다. B 와 E, 파란색 DAPI 얼룩에 의해 핵을 보여줍니다. C 와 F GFP, DAPI, 및 Normaski의 겹치는 이미지를 표시합니다. 눈금 막대 = 모든 이미지에서 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림: 아세톤 고정 표본 유지 하 고 아세톤 고정 후 60 일 이내 GFP와 DAPI 신호는 아직도 관찰. (A) 그린은 GFP. (B) 블루 DAPI 신호입니다. (C) 겹친 GFP, DAPI, 및 DIC의 이미지. 모든 이미지는 아래 400 X 확대 전력을 이동 됩니다. 눈금 막대 = 50 μ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 기사는 핵을 세포질 로부터 단백질 subcellular 변경 사항을 확인 하는 신속 하 고 효율적인 방법을 제시. 핵 구조 DAPI 얼룩 (그림 3)에 의해 확인 하는 동안 단백질 식 GFP 융해에 의하여 표시 했다. Immunostaining C. 선 충 단백질 도전 이기 때문에, 대부분 선 충 C. 단백질 subcellular 지 방화 마커 단백질 GFP, 나사로, mCherry, 등 그들을 태그 특징으로하는18,19 , 20 , 21.이 기사에서 gfp 의 단백질 세포질 지 방화를 보여 주기 위해 대상 유전자 exl-1 태그를 사용 되었다. 확인 하려면 핵 지역화, DAPI 얼룩 사용 되었다. 두 가지 대체 방법을 제시 했다 DAPI 얼룩에 대 한. 모두 효율적으로 괜찮은 근무 시간 내 (1 시간 미만) 벌레에 강한 핵을 보여주었다. 에탄올 고정은 (50 미만 웜 수집) 품질 관측 등 작은 샘플 컬렉션에 적합 합니다. 완전히 건조에서 벌레를 방지 키입니다. 일단 95% 알코올 벌레에서 증발, 다음 단계로 바로 진행 합니다. 아세톤 고정 (50 동물 수집) 정량 분석 하는 등 대규모 샘플 컬렉션에 적합 합니다. 그러나, 세척 샘플의 여러 단계 때문에 어떤 견본 손실 됩니다. 따라서, 그것은 신중 하 게 제거 하는 상쾌한 고 가능한 많은 벌레를 유지 높은 것이 좋습니다. 일단 그들이 봉인 된 아세톤 기정에서 유래 하는 슬라이드 4 ° c.에 1 주 동안 저장 될 수 있다
이 프로토콜은 다른 단백질의 subcellular 지 방화의 변경 내용을 추적 하 게 조정할 수 있습니다. 여기에 제시 된 열 스트레스 뿐만 아니라 다른 스트레스 분석 실험 수 부과, 산화 스트레스, 중 금속 스트레스, 식이 제한, 그리고 다른 사람 같은. 단백질 subcellular 지 방화 변화 또한 관심사의 단백질의 유전 배경 변경 하 여 검사 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 변형 라인 소설 유전자 상호 작용 수 있습니다 식별할 수 있도록 다른 돌연변이 배경으로 메시지를 넘어 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi) 특정 유전자를 허물고 하 고 조사 결과 단백질 subcellular 지 방화의 변경에도 적용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램은 새로운 규제 구성 요소를 식별 하 고 관심의. 알 수 없는 단백질에 대 한 다양 한 실험 조건 시험 되어야 한다, 테스트 시 약 농도 등의 스트레스 시간, 기간 및 벌레의 특정 발달 단계. 우리의 연구에서 우리는 5 h, 및 다른 열 스트레스 온도에 30 분에서 다른 기간을 했어요. 3 h 35 ° C에서 열 충격 단백질의 핵 전 좌에 명확 하 게 방법을 보여 줍니다.
DAPI 얼룩의 추가 응용 프로그램 특히 생식 세포22,23,,2425에 벌레와 수 핵의 수에 감수 분열 및 유사 분열 과정의 시험을 포함 한 유전 돌연변이 배경20,,2627.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
이 연구에 사용 된 선 충 C. 긴장 건강-사무실의 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 국가 학회에 의해 지원 되는 꼬마 유전학 센터에서 얻은 했다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다: 1R03AG048578-01 6 월 회담, 6 월 회담, 및 PSC CUNY CCRG 1501-CUNY 66184 00 44와 67248-00 45 6 월 회담을. 우리는 그녀의 실험실 공간을 공유 하는 친절 하 게 대 한 캐시 야만인-던 감사 합니다. 모든 형광 이미지는 퀸 즈 대학 핵심 시설에서 수집 되었다. 원고에 대 한 그의 의견에 감사 윌리엄 J. 쌀 하 고.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
- Mello, C., Fire, A.
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
