Summary
전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.
Abstract
Full-Length 개별 Proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함), 에이즈-1 proviruses 근처 시퀀싱 하도록 설계 된 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 넘겼습니다 셀 인구 내의 통합된 에이즈-1의 유전자 구성의 결심을 허용 한다. 반전 녹음 방송, 큰 내부 삭제, 같은 기간 동안 발생 하는 에이즈-1 proviral 시퀀스 내에서 결함 식별을 통해 해로운 정지 codons/hypermutation, frameshift 돌연변이 및 cis 요소 행동 돌연변이/삭제 필요 virion 성숙에 대 한 뒤집기 통합된 proviruses 복제의를 식별할 수 있습니다. 에이즈-1 proviruses는 이러한 결함을 부족 하 고 따라서 잠재적으로 복제 유능한 식별을 넘겼습니다 분석 결과 활용할 수 있습니다. 넘겼습니다 프로토콜 포함: 에이즈-1 감염 된 세포의 세포 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처의 PCR 중첩 (에이즈-1 5를 타겟으로 하는 뇌관을 사용 하 여 ' 3 ' LTR), DNA 정제, 정량화, 도서관 준비 위한 차세대 시퀀싱 (NGS), NGS, 드 노 보 조립 proviral contigs 및 복제 유능한 proviruses 식별에 대 한 철폐의 간단한 과정. 뒤집기 순서를 설계 하는 전통적인 방법에 비해 장점이 통합 단일 proviral 시퀀싱 등 에이즈-1 proviruses을 제공 합니다. 넘겼습니다 증폭 및 결정, 되도록 복제 능력을 사용 하는 전체 길이 proviruses 근처 시퀀스 고 또한 적은 증폭 뇌관, 뇌관 불일치의 결과 방지를 사용 합니다. 그러나 튀기기 잠재 저수지 내 특히 통합된 HIV-1 proviruses의 유전 프리를 이해 하기 위한 유용한 도구입니다, 그리고, 그것의 사용 있는 통합된 에이즈-1의 유전자 조성은 필요한 모든 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다.
Introduction
장기 투여 치료 (미술)에 개인에 속하는 잠재 HIV-1 저수지의 유전 특성 이해는 통합된 proviruses의 대부분은 결함이 있는 복제 무능1 에 중요 한 되었습니다. , 2. 반전 녹음 방송 과정에서 오류 통합된 proviral 시퀀스에 소개 된다. 결함이 proviral 시퀀스를 생성 하는 몇 가지 메커니즘 등 오류 발생 hiv-1 역전사 효소3,4및 APOBEC 유도 hypermutation5,6스위칭 템플릿. 두 개의 최근 연구 에이즈-1 proviruses 장기 예술에 개인에서 고립의 약 5% 유전자 그대로, 그리고 잠재적으로 복제 유능한, 그리고 예술의 정지시 에이즈-1 플라스마 수준에 빠른 리바운드에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 1 , 2 , 7. 이전 연구 복제 유능한 HIV-1 proviruses 순진한 및 메모리 CD4 휴식 유지 확인+ T 세포 부분 집합 (를 포함 하 여 중앙, 전환 및 효과 기 기억 T 세포)의 중요성을 나타내는 이 대상으로 미래에 박멸 전략2,,89세포.
배포, 역학 및 잠재 HIV-1 저수지의 유지 보수에 초기 통찰력 유전자 hiv-1 게놈10 의 하위 게놈 영역을 특징 짓는 단일 proviral 시퀀싱 (SPS) 방법의 활용을 통해 달성 했다 11,,1213. SPS는 단일 감염 된 세포 내에서 단일 HIV-1 provirus 시퀀싱 수 다재 다능 한 도구입니다. 그러나, SPS는 그것만 뇌관 바인딩 사이트 내의 큰 삭제를 포함 하는 하위 게놈 영역 및 누락 proviruses 시퀀스 이후 proviruses의 복제 능력을 확인할 수 없습니다. 이전 연구는 SPS에 의해 복제 유능한 저수지의 크기를과 대 평가 설명 했다 13-에 17 배 그대로 하위 게놈 영역2를 선택적으로 시퀀싱을 통해.
SPS, 호 외. 의 한계를 해결 하기 위해 4 와 브루 너 외. 1 전장 HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 분석 실험을 개발 했다. 이 결정 장기 예술에 개인 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses의 주파수를 허용. 이 분석 실험 증폭 및 시퀀싱 (통해 생어 시퀀싱) 하위 게놈 영역을 다음 순서는 그대로 (결함)의 HIV-1 provirus를 조립 했다. 이 방법의 세 가지 한계는: 1) 여러 시퀀싱 뇌관의 사용 실수로 proviral 시퀀스에 결함을 도입의 위험을 증가, 2) 뇌관 불일치 증폭 되지 않을 수 있습니다 특정 proviruses의 그리고 3) 자주는 이러한 방법 전문적으로 전체 proviral 시퀀스를 확인할 수 없습니다.
기존 전장 HIV-1 proviral 시퀀싱 분석 실험의 한계를 극복 하기 위해 우리는 F펼-Length 나ndividual P Sroviral equencing (뒤집기) 분석 결과를 개발 했다. 튀기기는 차세대 시퀀싱 (NGS)-증폭 하 고 높은 처리량 및 효율적인 방식으로 전체 길이 (그대로 또는 결함) HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 기반된 분석 결과. 넘겼습니다 활용; 뇌관의 수를 제한 하는 그것으로 이전 분석 실험, 이점을 제공 한다. 따라서, 그것은 불일치, proviruses의 인구를 제한할 수 있습니다 캡처 또는 실수로 바이러스 시퀀스에 결함을 소개 하는 뇌관의 기회를 줄인다. 군요 이전 분석 보다 적게 기술적으로 도전적인 또한 및 6 단계를 포함 한다: 1) 에이즈-1 감염의 세포 세포, 2) 증폭 중첩된 PCR 뇌관 특정 높은 보존에 대 한 사용 하 여 희석을 제한에서 수행을 통해 단일 HIV-1 proviruses HIV-1 5'과 3' U5 LTR 영역 (그림 1A), 3) 정화 및 증폭된 제품, 4의 정량화) NGS, 5에 대 한 증폭 된 proviruses의 도서관 준비) NGS, 6) 각 contigs를 시퀀스 proviruses의 드 노 보 조립 개별 provirus입니다.
튀기기에 의해 생성 된 시퀀스 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 (그림 1C)2인 그들을 식별 하는 제거의 엄격한 과정을 받을 수 있습니다. 유전자 그대로 proviruses 복제 무능 provirus의 세대에서 발생 하는 모든 알려진된 결함 부족 합니다. 이러한 결함 포함: 반전 시퀀스, 대형 내부 삭제, hypermutation/해로운 정지 codons, frameshifts, 또는 변이 5' 신호 또는 포장 결합 기증자 (MSD) 사이트.
그림 1: 전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과에 중요 한 단계. (A) 5' 그리고 3' U5 LTR 지역 중첩된 PCR 통해 전체 길이 (불완전 하 고 그대로) HIV-1 proviruses 근처 증폭 튀기기에서 사용 뇌관 바인딩 사이트와 에이즈-1 DNA 게놈. (B) 레이아웃 잘 80 샘플 웰 스 (각 희석에 대 한 20 웰 스), 4 부정적인 제어 우물, 그리고 1 긍정적인 통제를 포함 하는 96-잘 PCR 격판덮개의. (C) 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses를 식별 하는 데 사용 하는 제거의 과정. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 제도적 검토 보드 캘리포니아 대학 샌 프란 시스 코와 웨스턴 시드니 지역 건강 지구 의료 연구를 위한 웨스트 미드 연구소를 포함 하 여 승인 되었습니다.
1. 에이즈-1 감염 된 세포의 세포의 용 해
참고: 셀 주변 혈액, leukapheresis 샘플, 골 수 생 검 또는 조직 생 검에서 격리 된 수 있습니다. 세포 인구 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 정렬할 수 있습니다.
- 준비 10 mM Tris HCl, 0.5%를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼 Nonidet P-, 40 0.5% 트윈-20, 그리고 0.3 mg/mL 가수분해 공화국 셀 펠 릿을 1 x 106 셀 당 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 아래로 혼합 플라스틱. 1 시간 15 분 PCR 확대를 위한 게놈 DNA를 세포를 lyse 눌렀다가 85 ° c에 55 ° C에서 품 어.
참고: 셀 세포 확대를 위한 게놈 DNA를 얻기에 충분 하다. DNA 분리 또는 정화가 필요 합니다. 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 그리고 genomic DNA-20 ° C에 무기한으로 저장 될 수 있다.
2. 중첩 된 PCR 통해 단일 HIV-1 DNA Proviruses의 확대
- 표 1 에 나열 된 첫 번째 라운드 PCR (PCR1)에 대 한 시 약을 혼합 ( 재료의 표참조). 96-잘 PCR 플레이트 ( 그림 1B에서레이아웃에 따라)의 85 우물 (80 샘플, 4 부정적인 컨트롤, 1 긍정적인 제어)를 마스터 믹스의 38 µ L를 추가 합니다. 이 플레이트 'PCR1'를 지정 합니다.
| 시 약 | 최종 농도 | PCR1 플레이트 (µ L)에 대 한 볼륨 | PCR2 플레이트 (µ L)에 대 한 볼륨 |
| 앞으로 뇌관 | 1 Μ M | 32.3 | 23.8 |
| 반전 뇌관 | 1 Μ M | 32.3 | 23.8 |
| 버퍼 (10 배) | 1 x | 323 | 238 |
| MgSO4 (50 mM) | 2 mM | 129.2 | 95.2 |
| dNTP (10 mM) | 0.2 m m | 64.6 | 47.6 |
| Dna 중 합 효소 (5 U / µ L) | 0.025 U/Μ L | 16.2 | 11.9 |
| 초순 H2O | 2632.5 | 1939.7 |
표 1: 시 약 및 PCR 위한 볼륨 믹스 마스터.
참고: 뇌관 PCR1 사용 됩니다.
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 위치 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 위치 9662-9686)
-
마스터 믹스를 준비, 후 PCR1 플레이트 genomic DNA의 추가 대 한 지정 된 깨끗 한 지역으로 이동 합니다.
- Tris HCl (5mm, pH 8)와 함께 1:81에 1: 3에서 순차적으로 희석 게놈 DNA 45 µ L를 준비 하 고 각 희석 (각 희석에 대 한 20 웰 스에 대 한 충분 한)에 대 한. 트리 스-HCl (5 m m, pH 8) 각 부정적인 컨트롤 잘 (따라 그림 1B에서 레이아웃)의 각 샘플 잘와 2 µ L를 희석된 genomic DNA의 2 µ L를 추가 합니다. 명확한 접착제 인감 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 모든 긍정적인 제외 PCR1 격판덮개의 우물, 제어 인감.
참고: 위의 권장된 희석 끝점 희석을 결정 하기 위한 시작 가이드로만 제공 합니다. 희석 샘플 내에서 통합된 HIV-1 DNA의 농도에 따라 달라 집니다.
- Tris HCl (5mm, pH 8)와 함께 1:81에 1: 3에서 순차적으로 희석 게놈 DNA 45 µ L를 준비 하 고 각 희석 (각 희석에 대 한 20 웰 스에 대 한 충분 한)에 대 한. 트리 스-HCl (5 m m, pH 8) 각 부정적인 컨트롤 잘 (따라 그림 1B에서 레이아웃)의 각 샘플 잘와 2 µ L를 희석된 genomic DNA의 2 µ L를 추가 합니다. 명확한 접착제 인감 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 모든 긍정적인 제외 PCR1 격판덮개의 우물, 제어 인감.
- 긍정적인 통제의 추가 대 한 지정 된 영역으로 이동 합니다. PCR1 플레이트의 긍정적인 통제에 긍정적인 컨트롤 (pNL4-3 105 복사본 / µ L 희석)의 2 µ L을 추가 하 고 접시를 봉인. 짧게 PCR1 접시 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 (400 x g 10에 대 한 실 온에서 s) 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 끌어.
- thermocycler PCR1 접시 실행: 94 ° C 2 분; 다음 94 ° C 30에 대 한 s, 64 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 61 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30 초, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 21 사이클; 10 분 동안 68 ° C 다음 68 ° C 10 분 (총 30 주기). 4 ° c.에서 개최
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다와 PCR1 접시 최대 2 일 동안 4 ° C에서 보관. - 표 1에 나열 된 PCR (PCR2)의 두 번째 라운드에 대 한 시 약을 혼합. 새로운 96-잘 PCR 플레이트 ( 그림 1B에서레이아웃 따라) 85 웰 스 (80 샘플, 4 부정적인 컨트롤, 1 긍정적인 통제)에 28 µ L를 추가 합니다. 이 플레이트 'PCR2'를 지정 합니다.
참고: 프라이 머 PCR2에 사용 되는:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 위치 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 위치 9650-9676)
-
짧게 PCR1 접시 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 (400 x g 10에 대 한 실 온에서 s) 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 끌어. PCR1 플레이트의 각 음에 Tris HCl (5 m m, pH 8)의 80 µ L를 추가 합니다.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 PCR2 플레이트 PCR1 판의 2 µ L를 전송 합니다. 샘플 (잘 A1의 PCR1 접시 잘 PCR2 A1 격판덮개 전송에서즉, 2 µ L) 잘 잘 전송 됩니다 확인 하십시오. 명확한 접착제 인감 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 PCR2 접시를 봉인.
- 짧게 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기 PCR2 접시를 회전 (400 x g 10에 대 한 실 온에서 s) 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 끌어. 열 씰링-20 ° C에서 장기 저장을 위한 영화와 PCR1 플레이트 인감 ( 재료의 표참조).
- PCR2 플레이트는 thermocycler 실행: 94 ° C 2 분; 다음 94 ° C 30에 대 한 s, 64 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 61 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30 초, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 31 주기;에 대 일 분 동안 68 ° C 다음 68 ° C 10 분 (총 40 주기). 4 ° c.에서 개최
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 그리고 PCR2 격판덮개 최대 2 일 동안 4 ° C에서 보관. -
짧게 PCR2 격판덮개 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 당겨 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 합니다. 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫에 Tris HCl (5 m m, pH 8)의 60 µ L를 추가 합니다.
- Ethidium 평범한 사람을 포함 하는 agarose 젤 2 x 48-잘 캐스트 1%에 각의 15 µ L를 실행 (0.1\u20120.3 µ g/mL, 재료의 표참조). 사다리를 사용 하 여 범위 최대 10 kb ( 재료의 표참조). 증폭된 제품 및 그들의 대략적인 크기를 포함 하는 우물을 식별을 시각화 합니다. 젤 이미지를 저장 합니다.
참고: 긍정적인 통제는 잘 증폭된 제품을 포함 해야 합니다. 경우 부정적인 제어 우물 증폭된 제품, 오염 고려 하 고 격판덮개를 무시.
- Ethidium 평범한 사람을 포함 하는 agarose 젤 2 x 48-잘 캐스트 1%에 각의 15 µ L를 실행 (0.1\u20120.3 µ g/mL, 재료의 표참조). 사다리를 사용 하 여 범위 최대 10 kb ( 재료의 표참조). 증폭된 제품 및 그들의 대략적인 크기를 포함 하는 우물을 식별을 시각화 합니다. 젤 이미지를 저장 합니다.
- 우물의 30% 더 이상으로 보다는 증폭 된 제품에 대 한 긍정적인 희석을 결정 합니다.
참고: 이것은 우물의 대부분 (80%)가 증폭된 제품 하나의 서식 파일에서를 포함 하는 끝점 희석 이다. 이 희석 준비 하 고 이후의 PCRs에 proviral amplicons 추가를 사용 해야 합니다. 각 증폭된 제품의 대략적인 크기를 기록 합니다.
3. DNA 정화 및 정량화
- 짧게 PCR2 격판덮개 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 당겨 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 합니다. 새 midi 96 잘 접시를 증폭된 제품 (또는 끝점 희석 아래)를 포함 하는 우물에서 40 µ L를 전송 (0.8 mL의 잘 볼륨 테이블의 자료를 참조 하십시오).
참고: 원래 및 새로운 잘 위치 각 증폭된 제품의 스프레드시트에 시퀀싱 할 각 증폭된 제품의 기록으로 기록 합니다. -
정화는 증폭 된 DNA 제품 기반 자석 구슬 PCR 정화를 사용 하 여 뇌관, 뉴클레오티드, 효소, 오일과 소금 제거 (재료의 표 참조) 키트. 시작 하기 전에, 실내 온도에 자석 구슬을 하 고 신선한 80% 에탄올을 준비 합니다. DNA 샘플의 교차 오염을 방지 하는 적절 한 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.
- 그들은 철저 하 게 resuspended는 되도록 소용돌이 자석 구슬. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 0.8 mL midi 96 잘 접시에 증폭된 제품의 40 µ L를 구슬의 40 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 10 번 위아래 플라스틱. 또는, 다음 5 분 동안 실내 온도에 2 분 품에 대 한 1800 rpm에서 microplate 셰이 커에 흔들어 접시를 씰링 하 여 솔루션을 혼합.
- 장소에는 자기 접시 스탠드 ( 재료의 표참조) 2 분 제거 및 삭제에 대 한 표면에 뜨는.
- 스탠드에 접시와 함께 각 잘을 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 구슬을 씻어. 30 미 제거에 대 한 실 온에서 incubate 고는 상쾌한 삭제. 한 번 반복 합니다. 좋은 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 두 번째 세척에 따라 모든 초과 에탄올을 제거 합니다. 스탠드에 접시와 15 분 동안 건조 공기를 구슬 수 있습니다.
- 받침대에서 접시를 제거 합니다. 차입 버퍼의 30 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 잘 하. 부드럽게 혼합 10 번 위아래 플라스틱. 또는, 다음 2 분 동안 실내 온도에 2 분 품에 대 한 1800 rpm에서 microplate 셰이 커에 흔들어 접시를 씰링 하 여 솔루션을 혼합.
- 새로운 96-잘 PCR 접시에 상쾌한 (순화 된 DNA)의 25 µ L를 전송, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 2 분에 대 한 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다. 샘플 잘-투-잘 전송 됩니다 확인 하십시오 (즉, 0.8 mL 접시에 잘 A1의 상쾌한 새로운 96 잘 접시의 우물 A1 전송 됩니다).
참고: eluted 샘플의 5 uL 남아 뒤에 잔여 정화 구슬의 아무 전달 되도록 하십시오.
- 결정 하 고 정화를 분 광 광도 계를 사용 하 여 다음 각 증폭된 DNA 제품의 대략적인 농도 기록 (260의 파장에서 흡 광도 nm).
주: 각 증폭된 제품의 대략적인 농도 측정 하는 필요 없음 샘플 정화 단계 동안 손실 됩니다 하 고 다음 단계 (에 사용 되는 표준 곡선의 범위에 대략 농도이 단계에서 0.001-1 볼륨의 100 µ L에서 DNA ng / µ L). 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 그리고 청소 샘플-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다. -
각 정제 제품을 사용 하 여 dsDNA의 부 량의 DNA의 농도 정량 키트 (재료의 표 참조).
참고:이 샘플에서 dsDNA의 농도 결정 하는 표준 곡선을 사용 하 여 포함 한다. 이 킷에 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), lamda dsDNA 표준, 및 형광 성 염료. 얼음에 모든 시 약을 보관. 빛에 노출을 피하기 위해 호 염료를 포함 하는 튜브를 커버. 3 중에서 각 증폭된 제품의 농도 측정 합니다.- 살 균 DNase 무료 H2o. 추가 99 µ L의 버퍼를 빈 우물 (수 측정 증폭된 제품의 3 배는 예를 들어 레이아웃 표 2 참조)의 적절 한 수에 1 x 희석 버퍼 플랫 바닥 조직 배양 플레이트의. 3 빈 우물에 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.
- 측정 각 증폭된 제품에 대 한 추가 (3.2.5 단계)에서 순화 된 DNA의 1 µ L 3 중에서 각각 잘 포함 하는 버퍼 (예를 들어 레이아웃에 대 한 표 2 참조).
- 표준 준비를 10 배 희석 lamda dsDNA에 0.002 µ 2 ng/L에서 ng / µ L. 3 웰 스를 100 µ L 각 dsDNA 표준의 추가.
참고: 단계 3.4.4, 기준의 최종 농도에서 배열할 것 이다 1 0.001 ng / µ L - 버퍼와 형광 염료 1: 200을 희석. 신속 하 게 각 잘 샘플, 공백, 및 표준을 100 µ L를 추가 합니다. 아래로 피 펫 믹스. 빛과 접촉을 피하기 위해 호 일 접시 커버.
- 읽기 microplate 리더에 형광 방출 (여기에서 480 nm, 520에서 방출 nm). 스프레드시트에 결과 기록입니다.
- DsDNA 기록 형광 측정을 사용 하 여 각 샘플에서의 농도 결정 합니다. 샘플 및 표준에서 빈 우물에서 측정 하는 형광을 뺍니다. 각 샘플 및는 triplicates에서 표준에 대 한 평균 형광을 확인 합니다. 표준의 형광 측정에 따라 표준 곡선을 그립니다. 표준 기준으로 샘플의 농도 결정 합니다.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 표준 (1 ng/mL) | 표준 (0.1 ng/mL) | 표준 (0.01 ng/mL) | 표준 (0.001 ng/mL) | 빈 | |||||||
| 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL 버퍼 | ||||||||
| B | 표준 (1 ng/mL) | 표준 (0.1 ng/mL) | 표준 (0.01 ng/mL) | 표준 (0.001 ng/mL) | 빈 | |||||||
| 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL 버퍼 | ||||||||
| C | 표준 (1 ng/mL) | 표준 (0.1 ng/mL) | 표준 (0.01 ng/mL) | 표준 (0.001 ng/mL) | 빈 | |||||||
| 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL | 100 mL 버퍼 | ||||||||
| D | 예제 1: | 예제 2: | 샘플 3: | 샘플 4: | 예제 5: | 예제 6: | 7 샘플: | 예제 8: | 예제 9: | 10 샘플: | 예제 11: | 샘플 12: |
| 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | |
| E | 예제 1: | 예제 2: | 샘플 3: | 샘플 4: | 예제 5: | 예제 6: | 7 샘플: | 예제 8: | 예제 9: | 10 샘플: | 예제 11: | 샘플 12: |
| 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | |
| F | 예제 1: | 예제 2: | 샘플 3: | 샘플 4: | 예제 5: | 예제 6: | 7 샘플: | 예제 8: | 예제 9: | 10 샘플: | 예제 11: | 샘플 12: |
| 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 | |
| G | ||||||||||||
| H |
표 2: dsDNA의 부 량에 대 한 96 잘 접시의 예제 레이아웃입니다.
- H2O 0.2 ng / µ L (3.2.5 단계에서 얻은) 각 정제 제품을 희석.
4. 시퀀싱 라이브러리 준비
- NGS는 NGS DNA 도서관 준비를 사용 하 여 증폭 하 고 순화 proviral DNA 준비 키트 ( 재료의 표참조). [제외 하 고 (3.5 단계)에서 입력된 DNA를 포함 하 여 반응 볼륨 확장 라이브러리 준비 시 약의 사용을 절반 수] 모든 tagmentation, PCR 확대, 그리고 정리 단계에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 정량 Pcr 기반으로 NGS 라이브러리 정량화를 사용 하 여 수동으로 라이브러리 표준화 provirus의 개별 농도 결정 하기 위해 ( 재료의 표참조) 키트. 4의 최종 농도에 아데닌 금액 개별 provirus 라이브러리 결합 nM, 또는 시퀀싱 서비스 공급자에 의해 지정 된 대로.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 풀링된 라이브러리-20 ° c.에 저장 - 3.4 단계에서 사용한 동일한 dsDNA 정량화 키트를 사용 하 여 최종 풀링된 라이브러리 계량. 제조업체의 지침을 따릅니다. 적절 한 사용 하 여 자동된 전기 영동 시스템에 풀링된 도서관의 1 µ L을 실행 하 여 평균 조각 길이 결정 키트 ( 재료의 표참조). 농도 및 평균 조각 길이 사용 하 여 풀링된 라이브러리의 몰 확인 하.
- 라이브러리를 변성을 0.2 N NaOH의 5 µ L에 5 µ L 풀링된 라이브러리의 결합. 200 mm Tris HCl를 중화 하 5 µ L를 추가 합니다. 오후 12 시 5 시퀀싱 직전 냉장된 교 잡 버퍼 (DNA 도서관 준비 키트와 함께 사용 가능)을 최종 라이브러리를 희석.
- 적절 한 NGS 플랫폼에 2 x 150 (nt) 뉴클레오티드 쌍-엔드 시퀀싱을 수행 ( 재료의 표참조).
참고: 실행 당 96 proviral 라이브러리를 인덱스 하는 경우이 실행 당 약 20 백만 쌍 간 읽기 또는 다음 멀티플렉싱 분석에 대 한 개별 provirus 라이브러리 당 200000 읽기를 생성 합니다. 4.4-4.5 단계 시퀀싱 시설에 의해 일반적으로 수행 됩니다.
5. 시퀀스 HIV-1 Proviruses의 드 노 보 조립
참고: 각 증폭된 provirus의 유전 순서를, contigs 조립된 드 노 보 에서 쌍 간 읽기 있습니다. 여러 플랫폼 (예를 들어, CLC 유전체학 워크 벤치14), 노 보 드 어셈블리에 대 한 사용자 지정 워크플로 디자인을 수 있습니다. FastQC15, Trimmomatic16,17, Cutadapt 및 플래시18 같은 다른 오픈 소스 소프트웨어 또한 Bowtie219 스페이드20 읽기 매핑 및 같은 툴으로 서 처리 읽기, 이용 될 수 있다 데 노 보 어셈블리. 에이즈-1 contigs 사용 하 여 특정 상업 플랫폼 (그림 2) 아래에 개설 된다 ( 테이블의 자료를 참조)의 드 노 보 어셈블리에 대 한 단계. 사용자 지정된 워크플로 파일은 요청 시 이용 가능.
- 시퀀스 가져오기 및 품질 검사: 가져오기 짝된 시퀀스 다음 짝된 읽기의 하나의 집합으로 결합 됩니다 소프트웨어 (fastq.gz 형식)에 읽습니다. 시퀀스 QC 보고서를 생성 하 고 데이터 품질을 검토.
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품질 관리
- 품질 관리 보고서 읽기 트리밍을 수행 합니다. 모든 어댑터 시퀀스 및 모호한 뉴클레오티드를 제거 합니다. 15 트림 5'와 2 3' 터미널 뉴클레오티드. 삭제 길이 50 미만 뉴클레오티드를 읽습니다. 30의 QC phred 점수에 해당 하는 0.001의 엄격한 품질 제한을 사용 합니다.
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겹치는 쌍을 병합
- 앞으로 쌍을 병합 하 여 단일 확장된 읽기를 형성 하 고 겹치는 영역 읽기를 역방향.
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드 노 보 조립
- 30의 단어 (또는 k-메 르) 크기와 네이티브 CLC 유전체학 드 노 보 어셈블러를 사용 하 여 nt 및 65의 최대 거품 크기 10000 겹치지 짝된 읽기의 임의의 subsample 조립 nt. 드 노 보 조립 contig 예상된 범위 ~ 200 배 ~ 9 kb 시퀀스입니다.
참고:이 서브 줄일 수 계산 부담 대부분의 표준 데스크톱 컴퓨터 조립 및 분석, 처리할 수 있는 그런 고 각 provirus의 clonality (한 라이브러리는 하나의 provirus),이 다양성을 제한 하지 않습니다.
- 30의 단어 (또는 k-메 르) 크기와 네이티브 CLC 유전체학 드 노 보 어셈블러를 사용 하 여 nt 및 65의 최대 거품 크기 10000 겹치지 짝된 읽기의 임의의 subsample 조립 nt. 드 노 보 조립 contig 예상된 범위 ~ 200 배 ~ 9 kb 시퀀스입니다.
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다시 매핑 contigs 모든 읽기
- 각 provirus의 최종 대부분 합의 순서를, 드 노 보 조립 contig 설정 전체 읽기를 매핑하십시오. 1000 x의 최소 평균 보도 contigs 수락 고 최종 contig 길이 원래 agarose 젤 (단계 2.8.1)에서 밴드의 크기에 해당 합니다. .Fasta 파일로 최종 대다수 일치 시퀀스를 저장 합니다.
참고: 대부분 contigs 조립 수 있다 수 위의 단계를 사용 하 여. 그러나, 경우에 따라 단일 provirus에 대 한 비슷한 보도 여러 contigs 조립 된다. 이러한 상황에서 contigs는 근처 전체 길이 (~ 9 kb) 정렬 참가자 및 단일 contig에 수동으로 조립 같은 합의 순서. 모든 읽기는 다음 수동으로 조립된 contig 매핑되고 최종 합의 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) > 40% 존재 하는 경우 읽기 범위 어셈블리에 걸쳐도 아니 단일 허용.
- 각 provirus의 최종 대부분 합의 순서를, 드 노 보 조립 contig 설정 전체 읽기를 매핑하십시오. 1000 x의 최소 평균 보도 contigs 수락 고 최종 contig 길이 원래 agarose 젤 (단계 2.8.1)에서 밴드의 크기에 해당 합니다. .Fasta 파일로 최종 대다수 일치 시퀀스를 저장 합니다.
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추가 품질 관리
- 되도록 각 contig 단일 provirus 나타내고 단일 잘 내 여러 proviruses의 증폭 때문만 아니다, 화면 읽기 및 최종 contig의 변형 전화.
- PCR 동안 여러 proviral 서식 파일은 매우 고르지 읽기 범위 (다양 한 크기의 proviruses의 공동 증폭) 때문으로 때 식별 종종 동일한 참가자, 또는 Snp와의 존재에 의해 전체 길이 일치에 매핑 한 주파수 > 40% (대표 결과, 그림 4참조). 이후 분석에서 혼합된 인구를 무시 했다.
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맞춤
- 시퀀스 분자 진화 유전학 분석 (메가) 721같은 소프트웨어를 볼로 각 proviral 시퀀스의 최종 합의 가져옵니다. 각 시퀀스 HXB2 참조 순서를 수동으로 맞춥니다. 트림 5' 그리고 3' 위치 666-9650 뇌관 시퀀스를 제거 하는 HXB2의 끝.
- Fasta 형태로 시퀀스 목록을 내보내고 최종 정렬을 적절 한 수동 편집 MAFFT 버전 722를 사용 하 여 정렬.
참고: 어떤 시퀀스는 정렬 되지 않습니다, 경우 첫 번째 역방향 시퀀스를 보완 합니다. 시퀀스는 여전히 정렬 되지 않는 경우 HIV-1 순서가 확인을 폭발 검색을 수행. 에이즈-1 서식 파일을 증폭 하 고이이 단계에서 확인할 수 있습니다. 시퀀스 HIV-1 하지만 정렬 되지 않습니다, 뒤집어 (단계 6.1 참조)의 존재를 고려 하십시오.
6. 에이즈-1 Proviral 시퀀스의 잠재적인 복제 능력을 결정
참고: 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한의 시퀀스를 식별 하려면 HIV-1 proviruses 제거의 엄격한 과정은 (그림 1C) 뒤. 뒤집어 부족 proviral 시퀀스, 대형 내부 삭제, 해로운 정지 codons/hypermutation, frameshift 돌연변이 및 엠 사이트 또는 패킹 신호에서 결함 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 간주 됩니다.
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뒤집어
- 정렬 단계 뒤집어 식별 합니다. 여 지역 어디 시퀀스는 정렬 되지 않을 참조 HXB2에 지역 보충 역은 제외입니다.
참고: 데이터 응용 프로그램에 따라 시퀀스를 포함 하 여 추가 분석에서 생략 할 수 있습니다.
- 정렬 단계 뒤집어 식별 합니다. 여 지역 어디 시퀀스는 정렬 되지 않을 참조 HXB2에 지역 보충 역은 제외입니다.
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큰 내부 삭제
- 큰 내부 삭제 contigs 식별 (> 600 bp) 맞춤 단계에. 않는 삭제 nef안에 앉아, 시퀀스 결함으로 정의할 수 있습니다.
참고: 내부 삭제 모든 시퀀스 < 600 bp 불완전 한 유전자 순서 데로 유전자 커터 (6.3.1 단계)에 의해 식별 됩니다.
- 큰 내부 삭제 contigs 식별 (> 600 bp) 맞춤 단계에. 않는 삭제 nef안에 앉아, 시퀀스 결함으로 정의할 수 있습니다.
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해로운 정지 codons, frameshift 돌연변이 및 삭제
- 길이의 모든 contigs 확인 > 해로운 정지 codons, frameshifts 및 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 유전자 커터를 사용 하 여 불완전 한 유전자 시퀀스의 존재에 대 한 8400 뉴클레오티드 도구23.
참고: 유전자 커터 도구 유전자 개 그, 폴, vif, vpr, 문신, 레 브, vpu, 환경을, nef에 proviral 시퀀스를 분할 하 고 아미노산으로 그들을 변환 합니다. 유전자 커터 다음 정지 codons 그리고 (때문에 삽입 또는 삭제) frameshift 돌연변이의 존재에 대 한 화면. Contigs 정지 codons 또는 frameshifts 어떤 유전자에 들어 있는 nef24를 제외 하 고는 결함으로 분류 됩니다. 유전자 커터는 또한 삭제와 불완전 한 유전자 시퀀스 및 어떤 proviruses를 식별 < 600 혈압 이외의 nef 유전자에 큰 내부 삭제 인해 결함으로 재분류 될 수 있습니다.
- 길이의 모든 contigs 확인 > 해로운 정지 codons, frameshifts 및 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 유전자 커터를 사용 하 여 불완전 한 유전자 시퀀스의 존재에 대 한 8400 뉴클레오티드 도구23.
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Hypermutation
- 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 일치 메이커 도구 (간단한 합의 메이커)25를 사용 하 여 나머지 전체 길이 proviral 시퀀스의 일치를 생성 합니다. 만 나머지 전체 길이 proviral 시퀀스를 포함 하는 정렬의 상단에 합의 시퀀스를 추가 합니다. 사용 하 여이 정렬 및 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 Hypermut 도구26 나머지 전체 길이 proviral 시퀀스에서 G-A hypermutation APOBEC 유도 식별.
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MSD 및 포장 신호 결함
- 각 렌더링 proviral 시퀀스 결함이4는 MSD와 포장 신호 (HXB2 지역 670-810)에 결함에 대 한 나머지 contigs 검사 합니다. 엠 사이트 (시퀀스 GT, HXB2 744 745)에 점 돌연변이 대 한 보고 또는 4에서 모든 삭제 줄기 루프 포장 신호 (SL1 (691-734 HXB2), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (766-779 HXB2), 그리고 SL4 (HXB2 790-810)).
Representative Results
튀기기 분석 결과 증폭 하 고 전장 HIV-1 proviruses 근처, 단일 시퀀스. 프로토콜 전체 길이 proviral 시퀀스 근처를 6 단계를 포함 한다. 이러한 단계를 포함: 세포의 용 해 감염 세포, 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses, DNA 정제 및 정량화, 라이브러리 준비, NGS, 시퀀싱의 중첩 된 PCR 및 드 노 보 의 조립 순서가 proviruses. 각 단계의 최종 검사점 전에 다음 단계 (예: 증폭 DNA, 순화 된 DNA, 시퀀싱 라이브러리 또는 시퀀스) 제품의 품질 평가 수 있다 여겨질 수 있다. 각 단계의 끝에서 수행 평가의 개요 그리고 예상된 된 결과 아래에 설명 된.
다음 중첩 된 PCR 증폭된 제품 1 %agarose 젤 (그림 3)에 실행 됩니다. PCR의 초기 품질은 부정적이 고 긍정적인 컨트롤의 검사에 의해 확인할 수 있습니다. 증폭된 제품을 포함 하는 부정적인 제어 우물 오염 나타내고 증폭된 제품의 결 석 긍정적인 제어 우물 부족 확대 표시 합니다. 다음, 웰 스 증폭된 제품을 포함 하는 시퀀싱에 대 한 선택 됩니다. 여러 증폭 된 proviruses의 혼합물을 포함 하는 우물을 피하기 위해, 웰 스만 증폭된 제품 끝점 희석에 실행을 포함 하는 시퀀싱에 대 한 간주 됩니다. 포아송 분포에 따라 끝점 희석 우물의 30%는 증폭 된 제품에 대 한 긍정적인 발견 된다. 이 희석, 80%는 이러한 웰 스 포함 단일 증폭된 provirus 기회. 여러 밴드 젤에 표시 됩니다 또한, 서로 다른 길이의 여러 증폭 된 proviruses를 포함 하는 우물이이 단계에서 구상 수 있다. 이 우물 (그림 3)을 시퀀싱 하지 선택 합니다.
증폭된 proviruses 시퀀싱에 대 한 선택의 정화, 따라 정량화 아무 proviral DNA 정화 단계 손실 됩니다 보장 합니다. 증폭된 provirus의 DNA 농도 경우 < 0.2 ng / µ L, 접시는 순화 될 수 있다 PCR2에 나머지 샘플. 유사한 검사점 라이브러리 준비, 각 개별 라이브러리 계량은 다음 발생 합니다. 이렇게 하면 개별 proviruses 적절 하 게 조각, 태그 되었고 시퀀싱 전에 증폭. 개별 proviral 라이브러리는 4의 마지막 라이브러리 농도에 아데닌 금액에 풀링된 nM (또는 시퀀싱 공급자에 의해 지정 된 대로). 개별 proviral 라이브러리의 농도가 너무 낮은 경우, 시퀀싱 라이브러리 풀에서 제외 될 수 있습니다 또는 개별 라이브러리 다시 준비. 풀링된 라이브러리의 농도 대 한 최종 검사 확인 평균 조각 길이 함께 시퀀싱 전에 수행 됩니다.
품질 관리 단계 드 노 보 어셈블리 단계 최종 proviral contig을 조립 하는 데 사용 하는 읽기의 품질을 보장 하기 전에. 이러한 단계를 포함: 어댑터 시퀀스, 5'과 3' 뉴클레오티드, 엄격한 품질 제한, 정돈 하 고 무시 하는 짧은 읽기의 제거. CLC 유전체학 워크 벤치는 트리밍 낮은 품질 영역을 제거 하는 충분 한 결정 하 읽기 및 가이드 트리밍 설정, 그리고 후 초기 품질을 평가 하기 전에 사용할 수 있는 품질 관리 보고서를 제공할 수 있습니다. 또한, 노 보 드 어셈블리 조립된 contigs의 품질 평가 될 수 있다 충분 한 깊이 (> 1000 X) 및 범위 (그림 4A)의 균일성. 혼합된 인구는 또한이 단계에서 확인할 수 있습니다. 반면 짧은 (큰 내부 삭제 포함)와 전체 길이 proviruses의 혼합물 고르지 의해 확인 될 수 있다 여러 전장 (~ 9 kb) proviruses의 혼합물의 40%, 보다 큰 주파수와 함께 여러 개의 Snp의 존재를 통해 식별 됩니다. 읽기 범위 (그림 4B) 같은 참가자에서 매핑 전체 참조를 다음.
응용 프로그램에 따라 최종 정렬 "r A: 언어 및 통계 컴퓨팅 환경"27패키지로 ggtree 사용할 수 있는 같은 도구를 사용 하 여 시각화 수 있습니다. 최근 연구에 넘겼습니다 순진한, 중앙, 과도, 및 이펙터 메모리 CD4에서에서 시퀀스 HIV-1 proviruses+ T 활용 세포 특정 하위 집합 높은 면을 식별 하는 목적으로 장기 예술에서 개인에서 분리 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 HIV-12비율 여기, 한 참가자 (참가자 2026)이이 연구의에서 고립 된 시퀀스의 시각적 표현 (그림 5) 제공 됩니다. 이 참가자 시퀀스의 대부분 (97%) 했다 결함, 이펙터 및 과도 메모리 CD4 그대로 시퀀스+ T 세포. 이 시각화 도구는 큰 내부 삭제 시퀀스 수와 게놈에 있는 그들의 위치를 표시 하는 데 유용 합니다. 그것은 수 있습니다 해로운 정지 codons, frameshift 돌연변이 및 삭제/돌연변이 엠 사이트 및/또는 포장 신호에는 시퀀스를 나타내기 위해 추가 주석을 답니다.
넘겼습니다 분석 실험의 한 응용 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 HIV-1 proviruses의 신분증입니다. 531 시퀀스 CD4에서 고립의 최근 연구에서+ T 세포 6 참가자 장기 예술에 26 (5%) 유전자 그대로 HIV-1 proviruses 했다 확인된2. 나머지 결함이 proviruses 포장 신호 또는 엠 사이트 (11%)에서 돌연변이에 그 반전 시퀀스 (6%), 대형 내부 삭제 (68%), 해로운 정지 codons/hypermutation (9%), frameshift 돌연변이 (1%), 및 결함을 포함 .
그림 2: 에이즈-1 proviruses의 de novo 어셈블리에 대 한 워크플로 개요. 워크플로의 주요 단계를 포함: 1) 시퀀스 읽기 2) 병합 겹치는 쌍, 3 품질 관리) 노 보 드 어셈블리 및 4) 매핑 되었으며 일치 건물 색된 빨강, 파랑, 녹색, 오렌지, 각각. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 예제 agarose 젤 PCR의 증폭 HIV-1 proviruses. 웰 스 1, 2, 3, 6, 9 및 10 증폭된 HIV-1 proviruses 포함 되어 있습니다. 잘 10 포함 provirus 큰 내부 삭제와, 잘 2 포함 (혼합물), 다른 길이의 두 에이즈-1 proviruses의 공동 증폭 하 고 잘 12 긍정적인 컨트롤이 포함 되어 있습니다. 참고 % 증폭된 제품을 포함 하는 웰 스의 60%, 단일 서식 파일을 분리 하는 데 필요한 비율 위에 있는입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 읽기 매핑 출력 예. (A) 예를 들어 단일 전체 길이 HIV-1 provirus의 증폭 때문도 보험 혜택을 보여주는. 드 노 보 어셈블리, 다음 모든 읽기 합의 시퀀스 조립된 contig에 매핑됩니다. 소프트웨어 플랫폼에는 충분 하 고도 범위에 대 한 검사 매핑된 읽기 수 있습니다. (B) 예를 들어 서로 다른 길이 (혼합물)의 두 에이즈-1 proviruses의 공동 확대를 보여주는. 혼합물을 확인 하려면 읽기는 전체 길이 (~ 9 kb) 참조 시퀀스 같은 참가자 로부터 매핑되고 매핑 검사를 읽고. 고르지 못한 보도의 혼합물을 나타냅니다. 이 그림은 Qiagen14에서 허가로 재생 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 예제 시각화 에이즈-1 proviral 시퀀스 CD4에서 격리의+ T 세포 장기 예술에 개인에서 하위 집합. 개별 HIV-1 proviral 시퀀스 가로선으로 표시 됩니다. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
튀기기 분석 결과 증폭 및 시퀀싱 단일, 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 여러 요소 및 프로토콜에서 번호와 얻은 시퀀스의 품질에 영향을 주는 중요 한 단계 확인 되었습니다. 첫째, 세포 수와 세포 인구의 에이즈-1 감염 주파수 증폭 하는 proviruses의 수에 영향. 예를 들어 이전 간행물에서 약 절반 만큼 시퀀스는 같은 수의 순진한 CD4+ T에서 입수 했다 effector 메모리 CD4에 비해 셀+ T 세포. 이것은 순진한 세포는 일반적으로 이펙터 메모리 셀2보다는 낮은 감염 주파수를가지고 있기 때문 에입니다. 둘째, 세포 세포 DNA 추출 과정에서 손실의 아무 위험으로 게놈 DNA를 얻기 위해 열 기반 추출 방법 바람직합니다. 마지막으로, 어떤 PCR 기반 분석 결과와 마찬가지로 오염 예방이 중요 합니다. 분리 된 깨끗 한 영역 마스터 믹스, genomic DNA, 긍정적인 컨트롤, DNA 정제, 정량화, 및 라이브러리 준비 추가 처리를 준비 하기 위한 지정 해야 합니다. 이것은 여기에 제시 된 것과 같은 단일-사본을 분석 실험을 위해 특히 중요 하다입니다.
튀기기 분석 결과의 구현 처음 참가자 샘플 보다는 pNL4 3 플라스 미드와 같은 긍정적인 컨트롤 실행 포함 해야 합니다. 얻은 시퀀스가 플라스이 미드에 대 한 사용 가능한 참조 시퀀스에 비해 수 있습니다 이것은 모든 문제 해결 이전에 에이즈-1 긍정적인 세포의 사용에 대 한 허용 됩니다. 에이즈-1 긍정적인 세포를 사용 하는 경우 그것은 거의 아무 proviruses 증폭 됩니다 경우 에이즈-1 subtype (뇌관 넘겼습니다 하위 B에 대 한 설계) 및 세포 인구의 감염 빈도 고려 하는 것이 중요. 뇌관 시퀀스 수정/다른 하위에 맞게 재설계 될 수 있습니다. 또한, 긍정적인 통제를 포함 하는 잘 모든 PCR 수행에 포함 되어야 합니다.
튀기기는 SPS를 포함 하 여 이전 시퀀싱 분석의 한계를 극복 했다. 증폭 및 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처 시퀀싱을 통해 넘겼습니다 에이즈-1 proviruses의 잠재적인 복제 역량을 확인할 수 있습니다. 이것은 SPS 하위 게놈 영역만을 시퀀싱 하 고 따라서 시퀀스를 그대로 뇌관 바인딩 사이트 선택을 사용 하 여 이었다. 또한, 넘겼습니다 활용 하 여 여러 증폭 및 시퀀싱 뇌관, 이전 전장 시퀀싱 분석1,4에 의해 고용 되었다와 관련 된 한계 극복. NGS와 함께 HIV-1 LTR 영역을 대상으로 하는 PCR의 2 라운드를 통해 넘겼습니다 수와 필요한 뇌관의 복잡성을 줄입니다. 튀기기 적습니다 뇌관 불일치, 즉 결함이 있는 proviruses의 잘못 된 식별 및 인구 내의 몇 가지 proviruses을 증폭 하는 무 능력의 결과에 따라서 이다. 넘겼습니다 프로토콜 더 효율적 이며 또한 이전 방법 보다 시퀀싱의 높은 처리량에 대 한 수 있습니다.
결국, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 유전적 구성을 결정 하는 기존 방법에 비해 이점이 있습니다. 그러나, 그것은 튀기기의 한계를 인정 하는 것이 중요입니다. 첫째, 넘겼습니다 분석 결과 하지 개발 되었습니다 잠재 HIV-1 저수지의 크기를 측정 하기 위한 도구로 넘겼습니다 세포 인구에 있는 모든 HIV-1 provirus 증폭 여부를 결정 하는 분석 완료 하지 않은. 튀기기는 대신 다른 세포 인구2사이 저수지의 구성의 상대 비교를 만들기 위한 유용 합니다. 둘째, 그대로 HIV-1 proviruses의 복제 능력 vivo에서 , 같은 분석 호 외. 수행 없이 확실 하 게 확인할 수 없는 4. 셋째, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 통합 사이트를 확인 하도록 설계 되지 않았습니다.
넘겼습니다 프로토콜에 작은 변이 응용 프로그램을 늘릴 수 있습니다. 예를 들어 시퀀스 다른 수 뇌관 및 증폭 하 여 시퀀싱 여러 에이즈-1 하위에서 변경 합니다. 플라즈마 1 HIV virions의 시퀀싱 중첩된 PCR 이전 cDNA 합성의 추가 통해 가능 하다. 단일 분자 시퀀싱 방법의 미래 활용 드 노 보 어셈블리에 대 한 필요성을 제거 합니다.
통합된 HIV-1 proviruses의 유전자 시퀀싱 잠재 HIV-1 저수지의 우리의 이해를 증가 했다. 튀기기 elucidating 구성과 잠재 저수지의 미래 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 그러나, 뒤집기의 응용 프로그램은 저수지 넘어 확장할 수 있습니다. 미래 연구 넘겼습니다 CRISPR Cas 기술에 대 한 특정 목표를 결정 하거나 코딩의 식별에 사용할 수 및 비 코딩 영역 바이러스를 에이전트를 반전 하는 대기 시간을 더 응답 하 게 만들기. 바이러스 성 재결합 큰 내부 삭제의 접합 사이트를 보면 더 이해 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작업을 지원 했다 (1U19AI096109와 1UM1AI126611-01); 치료법을 찾을 Delaney 에이즈 연구 기업 (감히) 자선단체 에이즈 연구 (amfAR 108074-50-RGRL);는 재단에서 에이즈 퇴치 (ARCHE) 공동 연구 그랜트에 연구 컨소시엄 호주 센터 에이즈 및 간염 바이러스학 연구 (ACH2); UCSF GIVI 센터 에이즈 연구 (P30 AI027763); 그리고 호주 국가 건강과 의료 연구 위원회 (AAP1061681). 우리 박사 조이 라이, 웨스트 미드 연구소 도서관 준비 및 그의 시설 사용에 그의 훈련에 대 한 의학 연구에 대 한 게놈 시설 관리자와 Ramaciotti 센터 유전체학 (대학의 뉴 사우스 웨일즈, 시드니, 호주)에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 시퀀싱을 진행 하는 방법에 대 한 우리는 감사와 함께이 연구에 대 한 샘플을 기증 참가자 인정.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
| Tween-20 | Sigma | P9416 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
| 96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
| 50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
| Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
| PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O | ||
| PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
| HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 105 copies/mL and used as positive control | |
| PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
| E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
| DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
| Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
| PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
| 96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
| Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
| Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
| Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
| Microplate shaker | Optional | ||
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| Microplate reader | |||
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
| Library Quantification Kit - Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
| High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
| Illumina MiSeq Platform | Illumina |
References
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