Summary
כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.
Abstract
קליפת בתרבית של מורכב של סוגים רבים של נוירונים סינאפסות, כל אחד עם מאפייני אלקטרופיזיולוגיות וביוכימי ספציפיים, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו , אבל שלהם basic אנטומי פונקציונלי הארגון של הסלולר לקנה המידה רשת ממעטים להבין. כאן נתאר שיטת ההדמיה תלת מימדי של נוירונים שכותרתו fluorescently על פני שטחים נרחבים של המוח לחקירה של הארגון סלולרי קורטיקלית. סוגי נוירונים ספציפיים מסומנים על ידי ההזרקה של פלורסנט המשדרים עצביים רטרוגרדית או ביטוי של חלבונים פלורסנט ב העכברים הטרנסגניים. בלוק המוח דגימות, למשל, האונה, המוכנים על קיבעון, עשה שקוף עם רקמת ניקוי שיטות, נתון פלורסנט immunolabeling של סוגי תאים מסוים. אזורים גדולים נסרקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים מצויד גדול לעבוד מרחק מטרות ושלבים ממונע. בשיטה זו ניתן לפתור הארגון תקופתי של המודולים פונקציונליים ייחודיים לסוג microcolumn תא בתוך קליפת העכבר. ההליך יכול להיות שימושי לצורך המחקר של אדריכלות סלולרית תלת מימדי אזורי מוח שונים וברקמות מורכבים אחרים.
Introduction
קליפת בתרבית של מורכב של מספר רב של סוגי תאים, אחד עם דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, אלקטרופיזיולוגיות ומאפייני הביוכימי, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו 1,2 ,3,4,5,6,7. בין אם אלה סוגי תאים מאורגנים מבנים חוזרים ונשנים כבר לא ברור. קורטיקלית, כולל העמודות האוריינות החזותית וחביות המגע, יש לחזור על מבנים, אך הארגון הסלולר שלהם נשאר לא ברור8,9. אלה נמצאים אזורים קורטיקליים מסוימים והם אינם המערכת כולו במוח.
בשכבה neocortical 5, רובם המכריע של נוירונים מסווגים לארבעה סוגים עיקריים. סוג העיקריים של נוירונים סינאפסות, הקרנה מוחי תת הנוירונים, פרויקטים אקסונים אל המטרות subcortical לרבות פונס, חוט השדרה, רקתי עליון ומייצג, לכן, מסלול פלט קורטיקלית הגדולות10. הקרנה קורטיקלית הנוירונים, סוג מרכזי נוסף של הנוירונים סינאפסות, innervate קליפת10. נוירונים מעכבות גם להכיל שני מעמדות עיקריים: תאים parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין11.
ניתוחים אחרונים מציינים סוגי תאים ארבע מאורגנות מבנים חוזרים ונשנים12,13,14. הקרנה מוחי תת נוירונים12,13,14 והן נוירונים בקליפת המוח הקרנה14 לארגן סוג התא microcolumns ספציפיים בקוטר של 1-2 תאים. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין ישר במיוחד microcolumns של נוירונים הקרנה מוחי תת אבל לא עם microcolumns של נוירונים בקליפת המוח הקרנה14. Microcolumns את עצמם מעת לעת יתיישר טופס משושה סריג מערך14 , קיימים אזורים קורטיקליים מרובים כולל אזורים חזותי, המגע, מנוע12,מוח העכבר14 בשפה אזורי המוח האנושי13. נוירונים ב- microcolumn בודדים התערוכה פעילות מסונכרנת ויש תגובות החישה דומה14. מקרים אלה מצביעים על סוגי תאים בשכבה 5 לארגן לתוך מבנה סריג microcolumn המייצג הארגון ברחבי המוח הידוע הראשון של חוזרות מודולים פונקציונליים.
Microcolumns יש רדיוס של 10 מיקרומטר ויש על תקופתיות המרחבי כ-40 מיקרומטר. בנוסף, כיוון microcolumns הוא מקביל שלהם דנדריטים הפסגה, משתנה בהתאם למיקום שלהם ב- קליפת14. לכן, מערכת microcolumn קשה לנתח באמצעות פרוסות קורטיקלית קונבנציונאלי עם עובי טיפוסי של כמה עשרות מיקרומטר. בנוסף, הניתוח של תקופתיות דורשת נתונים תלת-ממדיים של מגוון רחב של אזורים במוח, ולכן אזור ההדמיה טיפוסי של מיקרוסקופיה קונפוקלית או ויוו הדמיה 2-פוטון הוא צר מדי.
לאחרונה פותחו טכניקות כדי לנקות רקמות בעובי15,16. כאן נתאר היישום של שיטות אלה כדי להשיג בקנה מידה גדול, תלת מימדי תמונות הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר 5 המרכיבים את המערכת microcolumn. הקרנת subcerebral נוירונים מסומנים על-ידי תיוג רטרוגרדית או הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת ב- Crym-egfp העכברים הטרנסגניים12, והקרנה קורטיקלית נוירונים מסומנים על-ידי גם הכוכבים תיוג או על-ידי הביטוי tdTomato ב Tlx3-cre-/Ai9-עכברים-17. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין מסומנות על ידי אימונוהיסטוכימיה. שיטה (נוגדן בקנה מידה S) AbScale18 משמש הנוגדן מכתים ניסויים, ואילו בשיטה SeeDB (ראה מוחי עמוק)19 משמש לניסויים אחרים. שיטות אלה להתגבר על הקשיים הנ של שיטות הדמיה קונבנציונאלי ולחשוף הארגון הסלולר מדויק של שכבה 514.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסיוני היו אושרה על ידי RIKEN Wako חיה ניסויים ועדת ועדת הבטיחות של הניסוי רקומביננטי RIKEN גנטי, שבוצעה על פי הנחיות המוסדי של מתקנים בעלי חיים של מדע המוח RIKEN המכון.
1. הכנת הדמיה צ'יימברס
-
הדמיית חדר19
- באמצעות יריעות גומי סיליקון, להכין חדר עם עובי של 5 מ מ, רצפת לוחות בעוביים שונים. בנוסף, מכינים צלחות פטרי עם או בלי זכוכית תחתון (איור 1 א').
-
מרווח פרוסה
- להכין את מפרידי להחזיק דגימות, באמצעות יריעות גומי סיליקון עם עובי של 0.5 מ מ (איור 1C).
2. מעקב הזרקה
הערה: לבצע זריקות לתוך פונס (2.1) או רקתי עליון (2.2). זריקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תווית פונס באזור המוח רחב כולל האזורים חזותי, מנוע, תוך הזרקה לתוך הנוירונים הקרנה מוחי תת תוויות רקתי עליון באזור החזותי. לניסויים שליטה, להזריק תמיסת. סאלין במקום כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B. לשם קיום תנאי סטרילי להשתמש בכפפות פלסטיק לנקות עם אתנול וציוד מעוקר.
-
לעשות זריקות לתוך פונס של עכברים בוגרים.
- לצייר µL 1 של כולירה fluorescently התווית על-ידי יחידת משנה של הרעלן B (25 µg/µL ב- PBS) לתוך מזרק G המילטון 26.
- במקום משאבת מזרק על המזרק.
- מקם את המזרק ואת משאבת את הכלי המחזיק תחמן על מכשיר stereotaxic. להטות manipulator 12° posteriorly מן הציר האנכי.
- עזים ומתנגד זכר או נקבה בוגרת עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9) על ידי הזרקת סודיום פנטוברביטל intraperitoneally (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) או על ידי מתן איזופלוריין (2-3%). המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.
- הנח את העכבר על הכלי stereotaxic.
- הסר בזהירות את השיער בעזרת סכין גילוח כדי למנוע זיהום ולחתוך 10 מ מ של הקרקפת כך bregma ואת למדא גלויים. לנהל 0.1 מ"ל של לידוקאין 1% באמצעות פיפטה. לקבוע את הזווית של הראש על-ידי התאמת המיקום האנכי של פיו על הכלי stereotaxic כך bregma ואת למדא באותה הרמה-z.
- להתאים את המיקום של manipulator על-ידי הזזה על הכלי stereotaxic כך קצה המזרק הוא קרוב bregma ולהקליט את המיקום של manipulator. . משכי את המזרק על-ידי הזזת כלי המחזיק על manipulator
- להזיז manipulator 5.4 מ"מ posteriorly ו- 0.4 מ מ רוחבית. לקדם את המזרק כך הטיפ הוא קרוב נקודת הכניסה על הגולגולת. . משכי את המזרק ולסמן את נקודת הכניסה.
- במיקום המסומן, לקדוח חור בקוטר של-1 מ מ.
- הכנס קצה המזרק דרך החור כך העומק טיפ הוא 6.9 מ מ יותר מאשר זה נמדד ב- bregma.
- מזריקים µL 1 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.
- הסר את המזרק המוח.
- במידת הצורך, לכסות את המוח החשוף עם רסיסי microfibrillar עוצר דימום, דבק מיידית.
- לשטוף את המוח החשוף באמצעות תמיסת מלח הנכללת פיפטה כדי למנוע זיהום, תפר את הקרקפת.
- הסר את העכבר הכלי stereotaxic. לאפשר את העכבר כדי להתאושש מן ההרדמה באינקובטור ב 30 הלעפה תרוטרפמט, בדרך כלל עבור 1 h. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. להחזיר את העכבר מחברתם של חיות אחרות אחרי זה הוא החלים לחלוטין.
- לשמור על העכבר 3 – 7 ימים.
-
לעשות זריקות לתוך רקתי עליון של עכברים בוגרים.
- הכן על פיפטה מזכוכית בקוטר עצה של 30 עד 50 מיקרומטר.
- להתחבר על פיפטה מזכוכית מזרק המילטון דרך צינור פלסטיק (איור 2 א).
- למלא את פיפטה מזכוכית, צינור פלסטיק, המילטון מזרק עם הנוזל פרפין.
- במקום משאבת מזרק על המזרק.
- למקם את פיפטה מזכוכית manipulator ותטה manipulator 60° posteriorly מן הציר האנכי (איור 2B).
- לבצע 2.1.4–2.1.9. המיקום של manipulator הוא 1.4 מ מ אחורי, צדדי 0.5 מ מ ל למדא.
- במקום סרט פרפין פלסטיק קטן על הגולגולת ולאחר מכן לשים כ 1 µL של הפתרון מעקב על זה. במהירות לקדם את פיפטה מזכוכית ולמלא אותו לפחות 0.5 µL של הפתרון מעקב.
- הכנס את פיפטה מזכוכית כך העומק עצה היא 3.0 מ מ פני המוח.
- מזריקים µL 0.5 של המשדרים באמצעות המשאבה ב 0.2 µL/דקה.
- הסר את פיפטה מזכוכית של המוח.
- לבצע 2.1.13–2.1.16.
3. קיבוע וגיזום
- להזריק סודיום פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally לתוך עכבר (C57BL/6J או Tlx3-cre/Ai9, עם או בלי הזריקה מעקב כפי שמתואר בשלב 2. המתן עד העכבר הופך ללא תגובה כאשר זנבו הוא צבט עם מלקחיים, המציין כי העכבר הוא מורדם לחלוטין.
- המתת חסד העכבר בצורה אנושית על ידי פרפוזיה transcardially העכבר20 עם סליין 0.9%.
- לתקן את העכבר20 על-ידי פרפוזיה 4% paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.5).
-
חותכים את הקרקפת בעזרת זוג מספריים כדי לחשוף את הגולגולת כפי שמתואר20.
- חותכים האמצע של הגולגולת החשופים בעזרת זוג מספריים. הסר את הגולגולת באמצעות מלקחיים.
- אם מסמנים את המיקום של bregma ולמבדה הינם הכרחיים, להסיר תחילה והזיז חצי אחד של הגולגולת. להכניס מחטים טונגסטן דק לתוך המוח-העמדות של bregma, למדה על הגולגולת שנותרו על המוח, ולאחר מכן הסר את הגולגולת הנותרים.
הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
-
כדי לבצע נוגדן מכתים של נוירונים מעכבות, לחתוך את דגימות המוח לפרוסות.
- מניחים את הדגימה המוח על vibratome.
- חותכים פרוסות עד עבה ב- PBS בטמפרטורת החדר 500 מיקרומטר, המשך לצעד שלב 5 (שיטת e AbScal).
- אם הנוגדן מכתים מיותרים, קישוט לדוגמה המוח כדי חוסמת (עד 3 מ מ עובי) בעזרת סכין גילוח (איור 3), לשלב 4 (שיטת SeeDB).
הערה: המוח יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 ° C לאחר חיתוך או חיתוך. שיטת SeeDB עדיפה כאשר נוגדן מכתים אינה נחוצה מכיוון שהיא דורשת פחות זמן מאשר שיטת elAbSca.
4. ניקוי ללא נוגדנים מכתים (שיטת SeeDB)
- להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 20% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 40% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 60% (w/v) פרוקטוז, דגירה זה במשך 4 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 100% (w/v) פרוקטוז, תקופת דגירה זה של 12 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להעביר את הדגימה בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 50 מל המכיל 20 מ של 0.5% α-thioglycerol ו- 80.2% פרוקטוז (w/w), תקופת דגירה זה של 24 שעות ייבוש עדין בטמפרטורת החדר.
הערה: לטפל המדגם בקפידה כדי לשמור על העיוותים קטן ככל האפשר. לא דגירה דגימות יותר הצביעו, כמו דגימות במהירות יכול להיות אטום. - להטביע את הדגימה תא ההדמיה מלא עם הפתרון פרוקטוז 80.2% (איור 1B). במידת הצורך, לתקן את הדגימה על ידי לשים חתיכות קטנות של דבק גומי מסביב. אם החדר הוא עמוק מדי, לשים צלחת קומה בבית הבליעה לפני הצבת את הדגימות.
- מניחים על צלחת פטרי עם כיסוי זכוכית על תא הדמיה ולשים מים המנה, ואת התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. עירור אורכי גל ומסננים פליטה מתוארים בטבלה 1. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע.
5. ניקוי עם נוגדן מכתים (שיטת e AbScal)
- להכין ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 2.
- להעביר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של פתרון סרוק/eS0 ואת תקופת דגירה אותם של 12 שעות עם טלטול עדין ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4B).
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות עבור h 36 ברעידות עדין ב 37 º C.
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eB4 ואני דגירה הפרוסות במשך 24 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של פתרון סרוק/eA2 ואני דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.
- דגירה עם ראשי נוגדנים (טבלה 3) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור 48-72 h ב 37 מעלות צלזיוס (איור 4C) ברעידות עדין.
- הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק מ ל בעזרת מרית.
- דגירה ב 4 מיליליטר AbScale פתרון 2 h 2 פעמים בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
- הסר בזהירות את הפרוסות כדי צינור פלסטיק 2 מ"ל בעזרת מרית.
- דגירה עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (טבלה של חומרים, בטחונות) ב 1 מ"ל של AbScale פתרון עבור h 48-37 ° C עם טלטול עדין.
- בזהירות להסיר את פרוסות בעזרת מרית עד צינור פלסטיק 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה הפרוסות במשך 6 שעות עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון elAbSca, דגירה את הפרוסות לקבלת 2 h 2 פעמים עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
- להסיר את הפתרון מהצינור באמצעות פיפטה ולהוסיף 4 מ"ל של 4% PFA דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל ל- PBS, דגירה הפרוסות עבור h 1 ברעידות עדין בטמפרטורת החדר.
- להסיר את הפתרון של הצינור באמצעות פיפטה להוסיף 4 מ"ל של הפתרון סרוק/eS4, דגירה הפרוסות במשך 12 שעות ייבוש עדין ב 37 º C.
- מקם את מרווח על משטח זכוכית מניחים את הפרוסות מרווח, לטבול את הפרוסות עם פתרון סרוק/eS4. חותם את מרווח עם כיסוי זכוכית (איור 1D).
- שים מים על חיפוי זכוכית ועל התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים. אם יש צורך, להשתמש במה ממונע.
הערה: לבדוק החלקים עמוק של המדגם מסומנות באופן דומה לחלקים שטחית לאשר בהיעדר דעה קדומה תיוג משמעותית.
הערה: חדירה של הנוגדנים שנבדקו מתוארת בטבלה3.
6. תא בנחישות עמדה
- לכל תפקיד של תמונות סרוקות, לחשב את ערכי המתאם באמצעות מסנן תלת ממדי התמונה14 (איור 5A-5D).
- לקבוע את העמדות של הפסגות של הערך קורלציה (איור 5D).
- לחקור תמונות סביב הפסגות כדי לאתר תאים (איור 5E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו תווית נוירונים בקליפת המוח הקרנה באמצעות הביטוי של tdTomato ב Tlx3-creהעכברים הטרנסגניים /Ai9, דמיינו נוירונים הקרנה מוחי תת ידי הזרקת את רכיב המעקב רטרוגרדית CTB488 לתוך פונס. האונה השמאלית של המוח היה נתון לשיטת SeeDB וייסרק באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים מצויד זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים (25 X, נ. א 1.1, ומרחק עבודה 2 מ מ) ו שלב ממונע. ערימה של תמונות 401 (512 x 512 פיקסלים; גודל הפיקסל = 0.99 מיקרומטר) בשלב-z = 2.8 µm בכל אחד 30 סריקה עמדות הושג. הגופים תא הסוגים התא שני היו גלויים על פני מגוון רחב של אזורים במוח (איור 6), ומקטעים אופטי הראה microcolumns תקופתי (איור 7 א). בנוסף, המוח של עכברים Crym-egfp (מתוחזקים כמו heterozygotes עם רקע C57BL/6J) היו מסומנת על-ידי פעולת השירות SeeDB, עם תמונה לעיל. תא ושל דנדריטים הפסגה של נוירונים הקרנה מוחי תת לבטא EGFP היו גלויים בסעיפים אופטי (איור 7 ב).
אנחנו גם לבצע תיוג רטרוגרדית של הקרנה מוחי תת הנוירונים בעכברים C57BL/6J באמצעות CTB488. המוח קבוע נחתך לפרוסות הילתית עם עובי של-500 מיקרומטר ולאחר נתון בשיטת elAbSca לסמן את התאים לבטא parvalbumin (אנטי-parvalbumin, 1:1000; אנטי-עכבר, IgG-fluorescently הנקרא). ערימת תמונות (512 x 512 פיקסלים, גודל הפיקסל = מיקרומטר 1.24; z-צעד = מיקרומטר 2.17, תמונות 268/מחסנית) התקבלו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם זמן עובד מרחק אובייקטיבי טבילה במים (20 X, נ. א 1.0, ומרחק עבודה 2 מ מ). הקרנה מוחי תת נוירונים ותאי לבטא parvalbumin היו שניהם גלוי הפרוסות (איור 7C).
איור 1: הדמיה צ'יימברס מפרידי. (א) העליון: עבודת יד עם תחתית זכוכית פטרי (מימין) של צלחת פטרי ללא זכוכית תחתון (משמאל). למטה: תא (מימין) ו לוחות הרצפה (משמאל) עשויים לוחות סיליקון. האונה העכבר (B) A נתון בשיטת SeeDB לאחר הזרקה של CTB555 לתוך רקתי עליון מוגדר אל החדר. המדגם קבוע עם חתיכת דבק לשימוש חוזר. שקופיות זכוכית (ג) א (למעלה), כרווח עשוי גיליון סיליקון עם עובי של 0.5 מ מ (למטה). (ד) שתי פרוסות הילתית במוח העכבר היו המקשטים את מרווח ומקורה עם כיסוי זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הזרקת מעקב. פיפטה מזכוכית (א) A מחובר מזרק המילטון דרך צינור פלסטיק. (B) A העכבר מושם על מכשיר stereotaxic. מטים את פיפטה מזכוכית כ 60° posteriorly מן הציר האנכי להזרקה לתוך רקתי עליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קיצוץ של דגימות המוח. (א) דגימת כל המוח לאחר הזרקה של CTB555 לתוך רקתי עליון ואת קיבוע. Bregma ואת למדא סומנו עם מחטים טונגסטן (חץ). (B) באותה דגימת זרע גזוז להשיג של האונה. שימו לב כי המחטים טונגסטן יישארו (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: טבילה מוחי לדוגמאות בפתרונות עבור השיטות elSeeDB ו- AbSca. (א) A האונה מדגם שקוע 0.5% α-thioglycerol ו- 20% (w/v) פרוקטוז עבור פעולת השירות SeeDB. (B) פרוסות הילתית שקוע סרוק/eA2 פתרון עבור שיטת elAbSca. (ג) פרוסות הילתית שקוע AbScale פתרון המכיל נוגדנים עבור שיטת elAbSca. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: קביעת תפקידים תא. הקרנה מוחי תת נוירונים הודבקו תוויות על-ידי הזרקת את רכיב המעקב רטרוגרדית CTB488 לתוך פונס רוב בגיל 5 שבועות. האונה השמאלית היה נתון בשיטת SeeDB, סריקה עם מיקרוסקופ שני הפוטונים (512 x 512 פיקסלים, גודל הפיקסל = מיקרומטר 0.99; z-צעד = 2.8 µm, תמונות 601/מחסנית). (א) א תמונה בודדת. (B) חמש תמונות מאוסף תמונה בודדת. מסנן (C) התמונה המשמשים לזיהוי התווית על-ידי CTB הקרנה מוחי תת נוירונים. (ד) המתאם ערכים המחושבים לתמונות חמש (ב') באמצעות המסנן ' ' ב (ג). דוגמאות (E) של נוירונים הקרנה מוחי תת שזוהו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: תוצאות נציג הדמיה בקנה מידה גדול- נוירונים בקליפת המוח הקרנה (ירוק) הודבקו תוויות על-ידי tdTomato-ביטוי Tlx3-cre/Ai9 העכברים הטרנסגניים, ו הקרנה מוחי תת נוירונים (מגנטה) היו דמיינו ידי הזרקת את רכיב המעקב רטרוגרדית CTB488 לתוך פונס בגיל שבעה שבועות של גיל. האונה השמאלית היה נתון בשיטה SeeDB, מיקרומטר 1,250 את האזור כדי 2,690 מיקרומטר לרוחב ו-3,400 מיקרומטר מיקרומטר 1,230 והשתרשה עמוק בלבה bregma עבר סריקה באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים. מבט מלמעלה (A). עמדות משוער של אזורים קורטיקליים הוצגו. (B–D) נוף עקיפה של CTB 488 מציג הקרנה מוחי תת נוירונים (B), זריחה זריחה tdTomato מציגים נוירונים בקליפת המוח הקרנה (C), וגם את התמונה הממוזגת (D). ת: קדמי; P: אחורי; מ: רכיסה המדיאלי; D: הגבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: תמונות בהגדלה של תוצאות נציג. (א) מקטע אופטי של התמונה ב- 6D איור. תמונה עובי 20 מיקרומטר. (B) = התווית על-ידי EGFP הקרנה מוחי תת נוירונים בעכבר Crym-egfp משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים רוב בגיל 6 שבועות. תמונה עובי = 30 מיקרומטר. (ג) Subcerebral הקרנה נוירונים (מגנטה) הודבקו תוויות על-ידי הזרקת CTB488 לתוך פונס של עכברים C57BL/6J ביום כמחנכת (ירוק) 49, ולבטא parvalbumin התאים היו דמיינו בשיטת elAbSca. תמונה עובי = 55 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| Fluorophore | אקס (אן אם) | מסנן (אן אם) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1,000 | 578-633 (D605/55 מ', Chroma) |
| אלקסה עבור חיל הים 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| אלקסה עבור חיל הים 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| אלקסה עבור חיל הים 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| דאפי | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
טבלה 1: עירור אורכי גל, מסננים עבור מיקרוסקופ שני הפוטונים.
בטבלה 2: ריאגנטים עבור שיטת el. AbSca. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| אנטיגן | חיסון בעל חיים | מזהה מוצר | ריכוז | בלוק 3 מ מ | פרוסה 500 μm |
| NeuN | העכבר | MAB377 | שבערך | ND | + |
| NeuN | ארנב | ABN78 | שבערך | ND | + |
| CTIP2 | חולדה | ab18465 | בטחונות | L1-L6 | + |
| Statb2 | העכבר | ab51502 | בטחונות | - | - |
| GAD67 | העכבר | MAB5406 | 1:200 | ND | + |
| גאבא | ארנב | A2052 | בטחונות | - | - |
| Parvalbumin | העכבר | 235 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | עז | PV-גו-Af460 | בטחונות | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | העכבר | P3088 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | ארנב | ab11427 | שבערך | ND | - |
| סומטוסטטין | ארנב | T-4103 | 1:1000 | L1-L2/3 | + |
| c-פוס | ארנב | PC38 | 1:1000 | ND | + |
טבלה 3: חדירה של הנוגדנים שנבדקו. תוצאות 3 רחובות מ מעבה מוצג כדלקמן; L1-L6: חדירה לתוך כל התורשתי; L1-L2/3: חדירה אל משכבה 2/3; -: אין תיוג; ND: לא נקבע. תוצאות 500 פרוסות בעובי מיקרומטר מוצג כדלקמן; +: תיוג אחיד; -: אין או מוגבלת תיוג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוצגו הליכים כדי לקבל תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה גדול של הארגון ייחודיים לסוג התא הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר, 5. לעומת ההכתמה פרוסה קונבנציונאלי, השיטה זו יותר שימושי לקביעת הארגון תלת מימדי של קליפת. השיטה מאפשרת ייבוא תמונות מ רחבה יותר, האזורים במוח עמוק יותר בהשוואה טיפוסי ויוו פוטון 2 מיקרוסקופ או קונבנציונלי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו, לפיכך, יכול לאפשר ניתוח מקיף של הטלפון הסלולרי neocortical ארגון.
שלב קריטי של השיטה היא החדירה נוגדן. תת-קבוצה של נוגדנים מראה עניים לחדירה דגימות עבה (טבלה 3), ו, ולכן, לא ניתן להשתמש עבור שיטת elAbSca. כדי להשיג תיוג אחיד עם נוגדנים השתמשו במחקר זה, היה צורך לחתוך את המוח לפרוסות מיקרומטר 500. השימוש קטנים יותר מקטעי נוגדנים, למשל, Fab או F(ab') 2 קטעים, ו/או אחרים ניקוי שיטות21,22,23,24,25,26, 27,28 עשוי לשפר את התוצאות.
נוגדן אנטיגן מחייב ירידה לפרטים מאופיין בדרך כלל בפרוסות רקמה דקה אך עלול להיות שונות ברקמות עבה לעבד עבור סליקה. כדי לשלוט על ירידה לפרטים נוגדן, אנו בשיתוף עם התווית רקמות עם מעקב הזרקת וסמן ביטוי גנים בבעלי חיים מהונדס, גם ביצע ניסויים חסימה באמצעות אנטיגן חלבונים ופפטידים14. אלה הליכים וניסויים שליטה באמצעות חיות חסר אנטיגנים היעד צריך להיות שימושי עבור המאשר יחודיות של נוגדנים.
מגבלה של השיטה הוא קצת דפורמציה של הדגימה הוא נמנע בשל הטיפול של דגימות בצובר רך. קבלת ויוו תמונות לפני קיבוע, באמצעות תמונות אלה כפי הפניות יעזרו לתיקון דפורמציות כזה.
ההליכים נוכח תוכננו עבור הניתוח של שכבה neocortical 5. ניתוחים אחרונים זיהו סמנים מולקולריים רבים את סוגי תאים עצביים תווית ב אחרים שכבות4,5,6,7, היישום של אלה מקבלי בשיטה הנוכחית עשוי לאפשר זיהוי של הארגון החשוב הסלולר ברבדים אחרים. בנוסף, זה צריך להיות אפשרי לבצע ניתוח דומה אזורים קליפת המוח, באיברים שאינו המוח, כדי לבדוק אם קיים ארגון הסלולר מדויק הדומה microcolumns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים אטסשי המייאוואקי וחמאת הירושי לעצה שלהם על הניסויים elAbSca, צ'ארלס Yokoyama לעריכה של כתב היד, Ohshima אריקו, מיוקי Kishino לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמך על ידי קרנות מחקר של RIKEN תוצרת הארץ, Grants-in-Aid למחקר מדעי של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן כדי תוצרת הארץ (אזורים חדשני "Mesoscopic Neurocircuitry"; 22115004), אס (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
