Summary
我们报告的方法, MLKL 介导的等离子膜破裂在 necroptosis 包括常规和共聚焦活细胞显微成像, 扫描电镜, 核磁共振基脂结合。
Abstract
Necroptosis 是由受体相互作用蛋白激酶 3 (RIPK3) 激活触发的程序化细胞死亡通路, phosphorylates 并激活混合谱系激酶样域 pseudokinase, MLKL, 破裂或 permeabilize 等离子膜.Necroptosis 是一种炎症通路, 涉及多种病理, 包括自身免疫、传染性和心血管疾病、中风、变性和癌症。在这里, 我们描述的协议, 可以用来表征 MLKL 作为刽子手的等离子膜破裂在 necroptosis。我们用常规和共聚焦荧光显微学的活细胞成像和固定细胞中的电子显微术来可视化细胞 necroptosis 的过程, 这一起揭示了 MLKL 从细胞质向血浆的再分布膜前诱导大孔的等离子体膜。我们采用体外核磁共振 (NMR) 分析方法, 用脂质来鉴定 MLKL 介导 necroptosis 的调节剂。基于这种方法, 我们确定了定量脂结合偏好和磷脂肌醇磷酸盐 (点子) 作为 MLKL 的关键粘合剂, 这是需要的血浆膜靶向和通透在 necroptosis。
Introduction
确定 necroptosis 的遗传成分有助于使用动物模型测试 necroptosis 在生理学和疾病1、2、3、4、5中的含义。RIPK3 或 MLKL 在小鼠中的击倒对发育和成人稳态的影响最小, 表明 necroptosis 对生命3,6不重要。此外, 某些物种不包含 RIPK3 或 MLKL 基因, 支持 necroptosis 在动物7,8的非必要的作用。另一方面, 在实验室诱发的各种病态的击倒动物模型揭示了 necroptosis 在炎症、先天免疫和病毒感染方面的重要作用,9,10,11,12。
Necroptosis 可以通过多种方式激活, 通过不同的先天免疫传感器发出信号, 所有这些都导致激活 RIPK31,13,14。活动 RIPK3 依次 phosphorylates 并激活 MLKL3、4、5、6、7、8、9、10 ,11,12,13,14,15,16,17,18。最受研究的, 也许是最复杂的方式, 导致激活的 RIPK3 涉及死亡受体结扎, 分叉的基础上的信号复合物的下游组成, 以诱导凋亡或 necroptosis1。Necroptosis 发生时, 通过 RIPK1 信号是青睐和结果参与 RIPK319,20。这一结果很容易被青睐的药理抑制或基因删除 caspase 8, 一个假定的内源性抑制剂 necroptosis, 保持 necroptosis 在海湾。RIPK1 绑定并激活 RIPK3。激活 necroptosis 的另一种方法是通过类似于 TLR3/TLR4 信号的像样的受体, 它通过域的适配器诱导的干扰素β (TRIF)21参与并激活 RIPK3。另一种死于 necroptosis 的方法是激活 DNA 传感器戴, 它直接参与并激活 RIPK322。
MLKL 是由一个 n-端螺旋束 (NB) 域和一个 C 终端 pseudokinase 域 (psKD) 组成的胞浆蛋白, 由一个调节支撑区3连接。在正常细胞中, MLKL 被发现在细胞质中, 它被认为是在一个不活跃的复杂与 RIPK314。激活 necroptosis 触发器 RIPK3 磷酸化的 MLKL 在 psKD 的活化回路, 并有可能在 NB 和支撑3,15,23的其他地点。磷酸化诱导 MLKL 的构象变化, 导致从 RIPK314的离解。不清楚的构象变化释放 psKD24的支撑。支撑, 其中包含2螺旋, 介导 MLKL 的齐聚三聚体通过 C 端螺旋25。支撑的 n-端螺旋抑制 NB 域, 这对于膜通透24,26是必不可少的。在分离的情况下, NB 域足以诱发等离子膜通透和 necroptosis16、24、27。在 MLKL (MLKL MEFs) 小鼠胚胎成纤维细胞中, necroptotic 活性为铌的重组。NB 是一种脂质结合领域, 优先从事磷脂磷酸肌醇45磷酸 (PIP2)。我们提出了 MLKL 活化的逐步机制, 其中大括号齐聚通过与 PIP2极性头组24的弱相互作用, 促进了 MLKL 到等离子膜的招募。在膜上, NB 对2的附加高亲和结合点进行了规范的曝光, 在非活动 MLKL 中由大括号屏蔽。总的来说, NB 与 PIP2的多重相互作用破坏了等离子膜的破裂, 尽管这些事件的分子机制尚未被阐明。
在这里, 我们说明了一些具体的方法来描述 MLKL 作为 necroptosis24的刽子手的功能。特别是, 我们专注于最微小的领域 MLKL, NB 和支撑 (NBB), 这是由支撑抑制, 可以通过强制二聚化激活, 以诱导等离子膜破裂和 necroptosis。我们描述了我们的诱导表达系统结合强迫药物诱导 FKBP 介导的二聚化的活细胞成像和电子显微手术细胞 necroptosis。此外, 我们还说明了我们的体外核磁共振分析的相互作用的 NBB 与 phosphatidylinositols (点子)。
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Protocol
1. 克隆和细胞线生成
- PCR 放大 NBB 区域, 对应于氨基酸残滓 1-140 (NBB140), 从人的 MLKL cDNA 的框架标准限制酶的克隆与齐聚的领域 2x FK506 结合蛋白 (2xFKBP 或 2xFV) 和金星荧光蛋白入强力霉素 (Dox) 诱导的逆转录病毒载体 pRetroX-TRE3G 获得 NBB140-2 xfv-金星 (表 1, 图 1 a B)。
- 用 MEFs 抗原瞬态转染法从绿色实验室中获得的不朽初级mlkl-/或ripk3- mlkl/ 小鼠胚成纤维细胞 (SV40-large)表达质粒。在 DMEM 周内选择永生化细胞, 并在标准组织中以10% 胎牛血清 (血清)、2毫米 l-谷氨酰胺、100的 U/毫升青霉素和链霉素、1毫米丙酮酸钠和不必要氨基酸在37°c 和 5% CO2中补充。文化孵化器。
- 传感器 SV40-immortalized mlkl- MEFs 与反式四环素控制 transactivator (rtTA) 包含的逆转录酶表达的质粒含有 blasticidin 抗性基因 (我们的改良质粒) 和治疗1周与5微克/毫升 blasticidin 选择的细胞稳定表达 rtTA28。
- 传感器 rtTA 表达 MEFs 与 Dox 诱导的逆转录病毒载体含有嵌合体 MLKL (pRetroX NBB140-2 xfv-金星普洛), 并选择使用4微克/毫升嘌呤霉素一周, 2 天后转导。
2. MLKL 介导 Necroptosis 的活体细胞显微成像
- 板mlkl- MEFs 表示 NBB140-2 xfv-金星密度5万细胞每井 (1 毫升/井) 在24井板, 和孵化过夜 (图 2a)。使用活细胞染色自动计数 (见材料表)。
- 用 Dox (0.5 微克/毫升) 治疗细胞12小时, 以诱导 NBB140-2 xfv 金星的表达。
- 诱导 necroptosis 与25毫微米 FKBP dimerizer (暗淡) 除25毫微米膜不透水绿色荧光染料 (参见材料表) 在标准 DMEM (参见 1.2)。细胞 necroptosis 积累染料, 因为他们的等离子膜完整性被 NBB140介导的破裂破坏。用三份或四份进行化验。
- 使用单或双色成像系统监视 necroptosis (见材料表), 将血管放置在哺乳动物组织培养孵化器中的相应成像单元中。
- 打开软件 (参见材料表), 然后在 "任务" 列表下选择选项卡计划即将进行的扫描。
注意:此协议用于使用单色系统进行成像, 但双色系统可使用类似的软件。 - 在 "属性" 选项卡中, 选择 "物理布局" 选项卡和 "快速荧光" 中的 "托盘、容器、扫描类型" 和 "扫描模式"。
- 通过单击 "时间线" 窗口和获取时间点和频率的总次数 (通常为 6 h 到 12 h, 或每5分钟为快速动力学 necroptosis) 添加 "扫描时间", 并通过选择 "应用程序" 来开始图像获取。"(红色按钮)。
- 使用图像分析软件 (参见材料表), 通过从 "任务窗格" (necroptosis) 中选择 "对象计数新的分析, 将固定的分割阈值放在背景水平之上" 来量化, 这可以通过悬停鼠标光标悬停在背景区域的多个图像中使用的分析。
- 通过选择使用当前图像预览并根据需要细化阈值级别来检查荧光对象。
- 通过打开 "启动新分析" 选项卡, 选择 "时间范围", 选择要分析的井, 输入 "分析作业名称", 然后按 "确定", 将绿色荧光计数集成。
- 通过双击相应的作业名称并从图形/导出窗口导出外部绘图软件中的其他分析, Access 从 "分析作业" 选项卡分析数据 (见材料表)。
- 定量数据作为绿色荧光正 (+ ve) 计数/毫米2或正常化计数通过汇合并且表达数据作为绿色荧光 + ve 计数或汇合。
- 有选择地, 在实验终点, 染色细胞与 100 nM 的膜-permeant 绿色荧光染料 (见材料表)。将数据规范化为% necroptotic 单元格, 作为端点上绿色荧光/绿色荧光的比值。
3. MLKL 对血浆膜招募和通透的活体细胞共聚焦显微成像
- 板mlkl- MEFs 表示 NBB140-2 xfv-金星在密度2万个细胞每井 (0.5 毫升/井) 在玻璃底部 4-井显微镜室预处理与50µg/毫升纤维连接蛋白在 PBS 在37°c 为30分钟和孵化为 ~ 12 h (图 2B)。
- 用 Dox (0.5 微克/毫升) 治疗细胞12小时, 诱导 NBB140-2 xfv 金星的表达。
- 通过孵化与新鲜培养基 (1 毫升/井) 含有 25 nM 暗淡诱导 necroptosis 诱导 NBB140-2 xfv 金星活化和转运到等离子膜。
- 将腔室放在旋转圆盘激光扫描共聚焦显微镜上, 安装有环境控制的倒立架和 63 1.4 NA 目标, 并使用选择软件开始图像采集 (见材料表)。
- 初始化软件, 选择 "焦点" 图标和 YFP 过滤器配置 (激发波长 515 nm)。
- 找到视图和焦点平面的字段, 并使用 "确定焦点" 选项卡参与焦点维护系统。
- 要开始获取, 请选择 "捕获" 选项卡, 然后依次分配过滤器配置、适当的 EMCCD 相机曝光时间和增强增益, 以及时间推移采集参数, 包括间隔和采集长度。
- 通过使用 515 nm 激光 (影片 1) 的 EMCCD 照相机, 在 necroptosis 期间通过获取图像, 监测荧光 NBB140-2 xfv-金星蛋白的细胞再分布。
注: 漂白是荧光蛋白成像的关注事项。金星是漂白29的抗性荧光蛋白之一。如果使用更容易漂白的荧光蛋白, 图像每三十年代或更长时间, 以允许恢复在成像时间点之间的信号。 - 为了监测 NBB140-2 xfv-金星在 necroptosis 期间的等离子膜协会, 每年十年代, 图像在3.3 由全内反射荧光 (TIRF) 显微镜制备, 使用一个装有自动 TIRF 滑块的显微镜和100X 1.4 NA 目标和 EMCCD 照相机 (影片 2)。按照步骤 3.5–3.7, 但根据显微镜室的样品和底部玻璃厚度调整 TIRF 焦点标签内的 TIRF 角。
注: 在 TIRF 分析中, 等离子膜标记 (如 LCK-RFP) 可作为血浆膜定位的控制手段。 - 用高斯函数的负归一化二阶导数 (马尔算法) 进行图像处理以提高卷积的质量。
4. 电子显微术
- mlkl MEFs 表达 NBB140-2 xfv-金星密度500万细胞在等离子涂层150毫米细胞培养皿和孵化为 12 h (图 3)。
- 用强力霉素 (0.5 微克/毫升) 治疗细胞, 以诱导1-140-2 xfv-金星的表达为 12 h。
- 诱导 NBB140-2 xfv-金星活化和易位到血浆膜与 25 nM homodimerizer 5 分钟。这一次是建立在 necroptosis 的动力学中观察到的活细胞成像。
- 用10毫升的2.5% 戊二醛、2% 多聚甲醛在0.1 米常使用缓冲液 pH 7.4 (常使用缓冲) 中取出介质并固定细胞, 在37摄氏度前预热。
- 收集样品的刮和旋转样品10分钟在 500 x g。放弃上清。
- 在0.1 米钠常使用缓冲器中, 用1.5% 钾盐在减少的2% 锇毒气中对样品进行1.5 小时的后缀。锇毒气是一种广泛应用于 TEM 中的染色剂, 可提供对比度。在 necroptosis 细胞扫描电镜前, 我们用 TEM 进行了初步分析。
- 将样品在超纯水中冲洗5次, 每 500 x克5 分钟, 然后在自动处理器上用缓冲液 (见 4.6)、水和乙醇漂洗。放弃上清。
- 对于扫描电镜, 染色前固定样品与1% 醋酸铀和铅天门冬氨酸重金属染色31。
- 通过一系列的酒精和丙烯氧化物溶液来脱水样品。
- 将样品嵌入硬树脂32以获得树脂块。
- 切厚部分0.5 微米, 以确定正确的分析区域。
- 用导电金属 (铱) 的超薄薄膜涂上样品。
- 图像和分析样本 (图 3)。为量化, 用电子显微镜扫描5凯文的树脂块表面与暴露的细胞的低放大图像。
- 通过扫描电镜或成像软件捕获的单个图像中的细胞可视化, 可以将多个视场连接到一个连续的图像30中。通过在选择软件中生成高分辨率蒙太奇 (见材料表), 大约有100个细胞可以用这种方式来评估 necroptosis 细胞的分数。
注: 扫描电镜评分坏死形态学比较正常细胞特征与前坏死或坏死表型的进展。这些特征包括膜的改变, 包括微绒毛的消失, 扁平化, 细胞破裂从 10 nm 到1µm 的大小, 或失去的器官结构的至少30–40% 的胞浆细胞区。
5. MLKL 的脂质结合核磁共振 (NMR) 光谱学
- 用标准蛋白表达和纯化制备15N 标记的 NBB1-156 , 如前所述24。
- 溶解500µg 12-二硬脂酸甘油酯锡磷脂酰 3-肌醇磷脂铵盐 (18:0 PI) 和 12-dioleoyl-锡磷脂酰-3-磷-(1 '-肌醇) 铵盐 (18:1 PI) 在500µL 冰冷 CHCl3每个为最后的浓度1毫克/毫升。
- 油脂实验1毫克/毫升18:0 和 18:1 PI 在超声波水浴为1分钟在室温或至多5分钟在冰水混合物。
-
整除1毫克/毫升18:0 和 18:1 PI 成清洁玻璃瓶为个别核磁共振滴定系列 (图 4)。用玻璃气密注射器在有机溶剂中转移脂质。
- 整除132µL 1 毫克/毫升 18:1 PI (摩尔质量 = 880.137 克/摩尔) 在 CHCl3为最后泥沙容量1200µL 在125µM 集中。
注: 为5毫米核磁共振管, 准备连续稀释量 > 1000 µL 和最后核磁共振样品容量 > 500 µL。为3毫米核磁共振管, 准备连续稀释容量 > 300 µL 和最后核磁共振样品容量 > 150 µL。
- 整除132µL 1 毫克/毫升 18:1 PI (摩尔质量 = 880.137 克/摩尔) 在 CHCl3为最后泥沙容量1200µL 在125µM 集中。
- 整除1毫克/毫升猪脑 L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 铵盐 20:9: 1 CHCl3/甲醇/小时2O (脑 PI (45) P2) 成清洁玻璃瓶。
- 将小瓶置于氩气气流 (Ar) 或氮气 (N2) 中, 适度流动, 蒸发有机溶剂, 不溅到玻璃玻璃瓶壁上。五到三十分钟通常是足够为10–200µL 有机溶剂的容量。
- 用大镊子在 Büchner 或真空瓶底部排列玻璃瓶, 用橡皮塞密封, 并将塑料油管连接到真空线上。夜间在轻度真空下疏散烧瓶, 清除残余有机物。
- 覆盖脂膜整除数与惰性气体, 密封与密闭盖子, 并贮存在-20 °c, 用于在一个月或-80 °c, 以长期储存。
- 制备含20毫米 naxhypo4 ph 6.8, 10% D2O 和洗涤剂 (+ 炸药) 的核磁共振样品缓冲器, 含20毫米 naxhypo4 ph 6.8, 10% D2o,0.34 毫米的 n-月桂-maltopyranoside。
- 在带脂膜的玻璃瓶中加入 + 引爆缓冲器, 达到所需浓度, 在水浴中油脂实验30分钟, 交替超声波10分钟后进行目视检查。
注: 超声波可加热样品。在最终蛋白质样品重组前, 允许冷却至室温15分钟。 - 使用1:1 混合物的超声波为所需浓度序列, 对脂洗涤剂胶束进行串联稀释。从125µM 脂浓度开始, 三重复将产生62.5 µM, 31.3 µM, 15.6 µM 脂在0.34 毫米的分布。
- 分别制备蛋白质和添加剂的控制和参考核磁共振样品。添加蛋白质和添加剂, 每稀释脂在 + 引爆缓冲。
注: 15N NBB156, 蛋白质添加到最后浓度40µM 和补充2毫米氘 dithiothreitol, 以保持胱氨酸残留减少。 - 将适当的样品体积转移到5毫米或3毫米核磁共振管 (见步骤5.4 中的说明)。
- 在核磁共振仪器中手动加载样品或在自动化平台 (如 SampleCase 加载器) 中进行排列。
- 利用标准脉冲程序获得1H 质子谱的复合核磁共振谱作为质量控制, 其次是 2D 1H-15N 相关谱作为横向松弛优化光谱学 (TROSY) 或异多量子相干性 (SOFAST-HMQC)33。
注: 使用3毫米核磁共振管需要64扫描 1H-15n TROSY (~ 3 小时) 或1h-15n SOFAST-HMQC (~ 90 分钟)。扫描数字为5毫米核磁共振管减半。 - 经过处理的2D 核磁共振谱可以添加到卡拉资料库34中, 用于分析或供用户选择的其他软件。
-
通过注释2D 核磁共振共振为每个蛋白质状态的三个良好分散和分辨峰值分析软件。记录包含 NBB156 (图 5A) 的每个缓冲区条件中每个六峰值的峰值振幅。
- 使用卡拉准备一批集成列表 (单击主菜单标题 "频谱 |安装批次列表 "...)所有的频谱收集和分析使用一个单一的峰值分配文件 (点击主菜单标题 "峰值 |导入 Peaklist "... 并选择用户定义的. 峰值文件, 其峰值为 6, 每个蛋白质状态为 3, 在内定义)。
- 调整设置 ("集成商 |调峰模型 "...)X 宽 0.06 ppm 和 Y 宽 0.30 ppm (点击主菜单标题 "积分器 |调峰模型 "...)在将最终输出记录到两个菜单选择之前 (1。单击主菜单标题 "集成商 |集成批次列表 ") (2。单击主菜单标题 "峰值 |导出集成表 ") (图 5B)。
注: M21、V53 和 L105 残留物的骨干酰胺共振已被分配给 NBB156闭支撑状态。采用3D 核磁共振实验24, 将开放支撑状态分配给残余 G130 和 A141 的骨干酰胺共振和 W133 的氢质子侧链共振。
- 通过将参考样品的三个开括号振幅平均, 并计算与这两个参照相关的正常化因子, 使样品直接与不同的磁铁或样品条件进行比较。使用规范化因子计算 NBB156共振的缩放振幅, 并将负振幅设置为零 (表 2)。
示例: 1) 比较不同磁铁的样品: 磁铁 A、NBB156+ 和磁铁 B、NBB156+。2) 洗涤剂比较: 0.34 毫米和1.7 毫米。 - 计算每个共振的闭合或开放支撑的比例比例除以最小到最大振幅的所有光谱收集包含适当的参考自由 NBB156和完全开放大括号 NBB156在洗涤剂。
- 将规范化的核磁共振振幅作为脂质浓度的函数进行绘制, 并比较 NBB156在不同条件下的比例 (图 5C)。
注: 另外, 对脂质浓度的闭合支撑构象的分数进行分析可以比较脂质结合 NBB156。我们更喜欢前者的分析, 因为它更快, 更好地报告的分数完全参与脂质。
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Representative Results
通过最小截断 MLKL 构造, NBB140-2 xfv-金星的诱导表达, 可视化调节 necroptosis 在活细胞中的执行是可能的。该结构保持了诱导等离子膜通透的能力, 并通过 FKBP 盒 (2xFV) 的暗诱导齐聚而活化。我们观察和量化 necroptosis 的活细胞显微成像, 监测动力学 (每5分钟) 摄取的细胞不透水绿色荧光 DNA 结合染料 (图 6a)。这个诱导系统是非常健壮的, 和完整的necroptosis mlkl- MEFs 可以观察到1小时后, 在模糊介导的 Dox preincubated 细胞的齐聚, 表达 NBB140-2 xfv-金星 (图 1A).我们把这些条件称为快速动力学 necroptosis。仅金星的表示在暗淡或 NBB140-2 xfv-金星在缺乏昏暗没有导致 necroptosis (图 6A)。我们通常在24、96、384井板上至少进行3个以上的复制成像实验, 其中三个或四份。
NBB140-2 xfv-金星 (图 6A) 强迫二聚化诱导的快速动力学 necroptosis 支持 MLKL 作为血浆膜破裂的假定刽子手的作用。为了可视化的 NBB140-2 xfv 金星的再分配到血浆膜在 necroptosis 期间, 活细胞共焦显微术用于监测金星荧光。在快速动力学 necroptosis 期间, 在2–3极小的孵化与暗淡, 细胞边缘的金星涂层被观察, 然后逐渐细胞四舍五入 (影片 1)。NBB140-2 xfv-金星积累在等离子膜是可视化的 TIRF 共焦显微镜, 重点是细胞体积在细胞质等离子膜-玻璃界面。血浆膜相关的金星 puncta 是可见的在孵育极小的孵化与暗淡 (电影 2)。因此, NBB140-2 xfv-金星的强迫齐聚诱导其快速再分配到等离子膜。
扫描电镜 (SEM) 是揭示 necroptosis 细胞形态学变化的有力工具。在 NBB140-2 xfv-金星齐聚的快速 necroptosis 下, 细胞改变形态学从正常拉长的形状 (时间0分钟) 到圆形和膨胀 (5 分钟) 到部分破裂 (10 分钟) 和广泛拆除的地方, 细胞质有消失 (20 分钟) (图 6B)。SEM 补充先前的观察, 从活细胞显微学相关 MLKL 定位与膜破裂的等离子膜。总的来说, 本文提出的显微技术提供了补充手段, 以监测, 评估和量化 necroptosis 在细胞水平和牵连 NBB140-2 xfv-金星在执行等离子膜破裂。
为了确定 MLKL 是否能直接接触等离子膜, 我们进行体外脂质结合实验, 利用重组 NBB156进行核磁共振波谱监测。通过对15N 标记 NBB156的稀释, 采用恒定浓度的洗涤剂 (用于脂质表现的车辆) 和可变脂质浓度, 对脂洗涤剂胶束的串联进行了测试, 以此来结合2D 核磁共振光谱学,监测蛋白的结合诱导变化。NBB156进行脂质结合的重大结构变化, 以取代抑制支撑区 (氨基酸 132-156) 从闭合和螺旋 (封闭的大括号), 以开放和内在无序的构象 (左大括号) (图7 A)。二维核磁共振光谱学提供每个残滓信息关于混合物的两个构象 (图 7 b-7 c)。我们以前分配了两个构象24的骨干酰胺。我们可以很容易地监控在给定样本中闭合和开放构象的百分比, 如图 5 a C所述。利用这一结合试验, 我们探索 NBB156绑定到点的 NBB 洗涤剂, 这是惰性的156绑定 (图 5B)。在这项试验中, PIP2是最好的 NBB156配体, 它诱导完全开放的抑制支架在125µM (图 5C)。相比之下, 饱和 (18:0) pi 和不饱和 (18:1) pi 是较差的 NBB156配体诱导部分支撑开口在相同条件下 (图 5C)。我们基于核磁共振的脂质结合试验为 MLKL NBB156与磷脂的相互作用提供了佐证, 并提示 MLKL 与血浆膜之间有直接的联系。
图 1:稳定的细胞系窝藏一个改良的3G 诱导系统.(A) 稳定的细胞系是由逆转录病毒转导的mlkl-/- MEFs 与 pTREX rtTA 爆炸后, pRetroX-TRE3G-NBB140-2 xfv-金星普洛。每次转导后, 抗生素选择长达1周, 然后再进行后续分析。(B) 诱导性 MLKL 表达系统的示意图表示。该系统是基于2药物诱导调控步骤: i) MLKL 基因表达和蛋白生产 (+ Dox) 和 ii) 活化的齐聚 (+ 暗淡)。当蛋白质生产提前诱导, + Dox, 快速动力学 necroptosis 可以触发, + 暗淡。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 快速动力学 necroptosis 的活细胞成像揭示了 MLKL 的快速膜孵育由.(A) 在成像系统中可以监测如图 1B所示的快速动力学 necroptosis。Necroptosis 是通过吸收细胞不透水的绿色荧光染料获得的。(B) 荧光和全内反射荧光 (TIRF) 显微分析的快速动力学 necroptosis 活细胞成像的示意图表示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 扫描电镜 (SEM) 样品制备和分析的示意图.如图1所示, 快速动力学 necroptosis 的细胞在不同的时间点上固定在板上, 加上暗淡。然后通过刮和池、重金属染色、树脂嵌入和铱涂层等方法对细胞进行扫描电镜分析, 如第4节所述。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 15N NBB156和脂洗涤剂胶束的核磁共振滴定的样品制备和数据收集.这种化验和分析通常在3–4天进行: 在1天, 脂整除数被配发和干燥过夜。在2天, 脂质膜水化在测定缓冲液, 微气泡, 和连续稀释 (两倍) 的水化脂溶液相同体积的无脂缓冲溶液混合。每次稀释都是微气泡的, 以确保在随后的稀释之前, 洗涤剂胶束中的脂质均匀混合和分布。蛋白质样品混合在系列脂洗涤剂胶束稀释, 加载在适当的核磁共振管, 放置在 SampleCase 装载机 (或手动加载), 并开始自动核磁共振数据收集。在随后的日子里, 核磁共振数据收集完成, 然后是2D 核磁共振分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 用2D 核磁共振测量 NBB156的脂质结合偏好.(A) 叠加1H-15n TROSY 谱为15n-NBB156在存在 (红色) 或缺席 (蓝色) 125 µM PI (45) P2在0.34 毫米的显示在卡拉。(B) 用于振幅测量和正常化的一维共振片。原始光谱 (绿色) 被包裹与边界为振幅和集成由节目卡拉。(C) NBB156的归一化振幅, 在磷脂胶束的存在下对脂质浓度进行绘制。PIP2诱导大括号的完全打开。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: NBB140-2 xfv-金星齐聚mlkl- MEFs 诱导的快速动力学 necroptosis.(A) 通过高通量荧光成像对细胞不透水、DNA 结合的绿色荧光染料进行 Necroptosis 量化。只有在 NBB140-2 xfv-金星的暗淡诱导齐聚时才观察到鲁棒 necroptosis 诱导, 但不存在暗淡。只有金星控制实验也执行。所有条件都是以三项进行, 并绘制为平均值和 SD 从一个代表复制。(B) 在扫描电镜下出现暗淡可视化时诱导的快速动力学 necroptosis。时间过程揭示了 necroptosis 的形态学变化, 包括细胞四舍五入和肿胀 (5 分钟), 血浆膜破裂 (10 分钟), 细胞质 (20 分钟) 的完全渗出。每个样本在0分钟的时间内都有相同数量的细胞。从左到右, 放大区域包含26、32、23和36个带细胞核的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: NBB156对磷脂肌醇进行核磁共振波谱监测.(A) 1H-15n TROSY 光谱15n-NBB156。在闭式支撑谱的规范化或开放状态的量化中, 共振的化学位移分别以正方形或圆形突出显示。正确的, 在没有或存在脂洗涤剂胶束的情况下检测到的核磁共振特征示意图。NBB156不结合磷脂肌醇洗涤剂胶束在缺乏。(B) 在各自的脂洗涤剂胶束的存在下叠加1H-15n TROSY 光谱, 15n-NBB156 。(C) 单1H-15n TROSY 光谱15n-NBB156在各自的脂洗涤剂胶束的存在从小组 B。通过在两种构象的混合物中明确地检测出开放和闭合的构象, 我们可以在给定样本中量化两个构象的百分比。PIP2是 NBB156的首选脂配体, 提供了 MLKL 和血浆膜磷脂之间的直接联系。请单击此处查看此图的较大版本.
| PCR 缓冲器 (10x) | 5.0 µL |
| DNA 模板 (100 µL) | 1.0 µL |
| 基因为 MLKL, 2x FKBP, 金星) | |
| dNTPs (每 NTP 25 毫米) | 0.5 µL |
| PCR 引物向前 (F) (100 ng/µL) | 1.3 µL |
| PCR 引物向前 (法郎 (100 ng/µL) | 1.3 µL |
| NBB140楼 | ATAATCGATACCATGGAAAATTTGAAGCATATT |
| NBB140 R | TATGCGGCCGCATCCTGCTGATCTTCCTGTGC |
| 2xFKBP F | ATAGCGGCCGCAGGCGTCCAAGTCGAAACCATT |
| 2xFKBP R | TATGCGGCCGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC |
| 金星 F | ATAGGGCCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG |
| 金星 R | TATGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC |
| DNA 聚合酶 (2.5 U/µL) | 1.0 µL |
| 蒸馏去离子水 (ddH2O) | 39.9 µL |
| 总反应量 | 50.0 µL |
| PCR 循环参数 | |
| 1周期 | 94-98 °c;四十五年代 |
| 25–30周期 | 94-98 °c;四十五年代 |
| 58°c;四十五年代 | |
| 72°c;1-2 分钟 | |
| 1周期 | 72°c;10分钟 |
表 1: 铌的 PCR 反应140-2 xfv-金星, 用于限制 pRetroX-TRE3G 中的基于酶的克隆.
表 2: 图5中所示核磁共振谱的原始数据, 说明从第二核磁共振磁体收集的数据到计算的平均开大括号状态的规范化转换.请单击此处查看此表的更大版本.
电影 1: NBB 齐聚诱导的快速动力学 necroptosis140-2 xfv-金星在 mlkl-/- MEFs.现场共聚焦显微显示 NBB140-2 xfv 金星的快速易位, 从细胞质到等离子膜后, FKBP 域的强迫齐聚。细胞被治疗如图1所述。黄色: NBB140-2 xfv-金星。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
电影 2: TIRF 显微学的快速动力学 necroptosis.TIRF 显微显示快速 (~ 2 分钟) 孵育由和聚集 MLKL 在等离子膜上添加暗淡到MLKL MEFs 表达 NBB140-2 xfv 金星。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
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Discussion
我们提供的技术协议, 我们结合到牵连 MLKL 作为推定刽子手的等离子膜破裂24。除了破译调节 MLKL 介导的 necroptosis 的规管网络外, 这些技术还可以独立用于其他合适的生物系统。实际上, 这些技术是中等到低吞吐量的发现工具。
我们经常使用活细胞成像 NBB140-2 xfv-金星介导 necroptosis, 并诱导其他 MLKL 构造, 机械化解剖 MLKL 的调节 necroptosis 通过诱变和使用小分子化学探针。特别是, 我们和其他团体已经证明, MLKL 的人和老鼠的构造, 包含 NBB 的最小区域可以调解 necroptosis 在人和老鼠细胞线。据报道, MLKL 介导的 necroptosis 是 RIPK3 和 MLKL 相互作用的物种特异性, 它阻止了 TNF、smac mimetics 和 caspase 抑制在上游刺激观察到的物种间的交叉反应。25,35,36。相应地, 人和老鼠 RIPK3 和 MLKL 蛋白质在这些情况下不跨反应25,35,36。为了绕过物种间的限制, 我们引入了激活人类 MLKL 或使用齐聚物盒的突变, 如这里所示的 NBB140-2 xfv-金星24。人类 NBB140是一个结构, 保持抑制区域, 因此保持不活跃的背景下 NBB140-2 xfv-金星。2xFV 的二聚化被认为通过释放支架激活 NBB140 。相比之下, 人类 NBB182诱导 necroptosis, 即使在没有齐聚, 因为这个构造能够自发 oligomerize24。此外, 点突变体 (R30A、R30E、E136A 和 E136R) 在全长人类 MLKL 的范围内激活 NB 区域, 克服了 RIPK3 磷酸化24对活化的需要。此外, 我们重组 dimerizable 人 RIPK3 (Cerulean-2xFV-RIPK3) 和 Dox 诱导的全长人类 MLKL 金星, 这是相容的和强劲的诱导 necroptosis 在ripk3-/- MLKL-/ MEFs24.其他一些最近发现了额外的突变或人鼠域交换 MLKL 构造, 可能克服物种特异性障碍25。
我们通常通过在96井板中进行几种测距实验来优化 necroptosis 的检测条件。然后, 我们对24井板进行了优化实验, 为多路复用提供了足够的细胞, 补充荧光活化细胞分选 (外地行动) 和西方印迹分析随后在相同的样本进行在成像最后的时间点后立即。目前, 活细胞成像是基于检测绿色和红色荧光, 限制了标签的可能性, 许多应用。绿色荧光染料的一个常见的替代方法是细胞不透水的 DNA 结合荧光染料碘碘化物 (PI)。双色成像仪器提供了使用这些染料与互补绿色或红色荧光蛋白的选择, 以提高 necroptosis 成像的效用和信息内容。
MLKL 在其活化后植物常常将等离子体膜的能力, 使活体显微学成为研究该蛋白生物学的选择技术, 并实时跟踪 necroptosis 的形态学变化。TIRF 显微术明确地解决了 MLKL 蛋白在等离子膜上的聚集, 特别是当在与等离子膜共同定位的标记存在时执行。我们用 LCK-C-RFP 作为一个标记的等离子膜共定位24。用不同的显影标记感兴趣的蛋白质的能力, 也允许同时研究在同一过程中涉及的几种蛋白质的活性。下一代超分辨率显微术部分克服了标准共焦显微镜的衍射极限问题, 有可能揭示 MLKL 介导 necroptosis 的附加特性。
necroptosis 的标志之一是等离子膜通透。即使有几种技术可以间接量化或表明膜破裂, 只有 EM 能可视化 MLKL 诱导的细胞膜完整性的不连续性。透射电镜具有最高分辨率, SEM 具有绘制较大试样区域的能力。这一特点, 结合开发新的强大的软件, 能够管理更大的数据量, 增强了 SEM 在细胞形态学表征的效用。此外, SEM 还能够扫描连续的样本部分, 允许3D 重建时, 耦合到其他系统, 如聚焦离子束。EM 分析的一些缺点包括仪器设备和维护成本、高度专业化人员的必要性以及对样品处理和分析的大量时间投资。
斑点杂交法最初用于使 MLKL 和血浆膜磷脂之间的直接连接16,27。我们以核磁共振为基础的脂质结合试验明确地牵连 MLKL 在特定的磷脂结合, 突出 PIP2作为 MLKL 配体的选择。结果表明, 酰链饱和度对 NBB156对磷酸肌醇的影响是有害的。然而, 如何 MLKL 绑定到 PIP2, 以及潜在的其他磷脂, 导致血浆膜破裂仍然未知。使用此协议, 任何其他磷脂可能被测试绑定到 MLKL。我们的化验是一个伟大的工具, 以测试新兴模型的 MLKL 介导 necroptosis, 因为它可以与突变体 MLKL 和各种配体, 以查明具体贡献的脂质结合。此外, 它可以用于任何其他膜相关系统, 以询问他们的脂质结合配置文件。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
References
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