Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Published: September 6, 2018 doi: 10.3791/58216
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 1,2
1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Summary

Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Birkaç patolojik koşulları göz işlevselliği ve/veya retina pigment epiteli (RPE) yaşama etkiler. Bunlar bazı formlar retinitis pigmentosa (RP) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) içerir. Hücre tedavisi zaten insanlarda ilk sonuçlar teşvik ile bu hastalıkların tedavisi için önerilen en umut verici tedavi stratejileri biridir. Ancak, greft hazırlanması yöntemi onun fonksiyonel sonuçlar içinde vivoüzerinde önemli bir etkisi vardır. Nitekim, RPE hücrelerinin hücre süspansiyon aşılı Retina bir doku nakli aynı hücreler daha az işlevsel. Burada, mühendis RPE doku ve onun hazırlık in vivo implantasyon için basit ve tekrarlanabilir bir yönteme açıklar. RPE hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerden türetilmiş bir biyolojik destek, insan amniyotik membran (hAM) numaralı seribaşı. Yapay iskele için karşılaştırıldığında, bu destek nerede endojen RPE hücrelerinin bağlı Bruch'ın membran yakın olan bir membran sahip olmanın avantajı var. Ancak, onun manipülasyon kolay değildir ve onun uygun kültür için çeşitli stratejiler ve hazırlık içinde vivoaşılama için geliştirdiğimiz.

Introduction

RPE çok hayatta kalma ve sıkı bir şekilde ilişkili1olduğu photoreceptors homeostazı için önemlidir. Birkaç patolojik koşulları, işlevsellik ve/veya hayatta kalma, RP ve AMD gibi değişiklikler.

RP photoreceptors veya RPE hücrelerinin ya da her ikisi2,3fonksiyonları etkiler devralınan monogenic mutasyonlar oluşan bir gruptur. Bu etkiler özellikle RPE mutasyonlar RP2%5 için hesap hücreleri tahmin edilmektedir. AMD nerede RPE katman değiştirilmez, başka bir lider sonuçta için merkezi görme kaybı durumdur. AMD tarafından genetik ve çevresel faktörlerin karmaşık etkileşimlerin neden olur ve yaşlı4,5,6etkiler. Projeksiyonlar göre AMD için 196 milyon hasta 20207tarafından Dünya çapında bir endişe olacaktır. Bu bozuklukları için etkili tedavisi yoktur var, ve bir teklif stratejileri yeni RPE hücrelerinin nakli ölü/işlevsiz önceden varolan RPE hücrelerinin8için telafi etmek için.

Aşılı için nihai ürün formülasyonu modu en iyi fonksiyonel sonuçları sağlamak için önemlidir. Teslimat, kolay ve basit bir yöntem olmasına rağmen bir hücre süspansiyon olarak enjekte RPE hücrelerinin endişeleri ile ilgili olarak onların hayatta kalma, tümleştirme ve işlevsellik9,10,11,12 yükseltmek , 13. bilim adamları artık daha fazla gelişmekte teslim etmek için karmaşık formülasyonları mühendislik Retina doku9,13,14,15,16. Bu bağlamda, ekimi9için kullanılabilir vitro RPE doku oluşturmak için özgün bir yöntem geliştirdik.

RPE hücre bankalar (ES) insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş bu protokol için kullanılır. Ancak, alternatif RPE hücre bankalar farklı hücre kaynaklarından (insan kaynaklı pluripotent kök hücreler, birincil RPE hücrelerinin, vb) ve farklı bir yöntem ile Ayrıştırılan bu iletişim kuralı için uygundur. Yönlendirilmiş farklılaşma içermektedir sitokinler ve/veya küçük moleküller17,18,19,20,21,22kullanarak iletişim kuralları.

Nakledilecek, mühendislik doku üzerinde bir iskele hazırlanmalıdır. Son birkaç yıl içinde farklı iskele tabanlı bir polimer veya bir matris biyolojik kökenli13,23,24geliştirilmiştir. Burada, kullanılan biyolojik substrat jambon olmakla beraber denuded Bruch zarı gibi diğer yüzeylerde uygulanabilir. Burada açıklanan yöntemi daha RPE yerel ortam ile ilgili biyolojik bir iskele kullanmanın avantajı vardır.

İnsan ES Hücre kaynaklı RPE hücrelerinin en az 4 hafta için tam bir Arnavut kaldırımlı monolayer düzenlenmesi amacıyla kültürlü. Bu aşamada elde edilen epitel işlevseldir ve9polarize. Son olarak, bu doku kolayca kırışıklıkları gibi daha fazla sertlik ve esneklik vermek için ve enjeksiyon işlemi sırasında korumak için hidrojel taşıyıcı ince bir tabaka, gömülüdür. Bu ürün sonra aşılama kadar 4 ° C'de depolanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol için kullanılan tüm insan malzemelerin Avrupa Birliği yönetmeliklerine uygun olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan insan ES hücre hattı benzersiz bir embriyo elde edildi. Embriyo hibe çift tam bilgi verildi ve isimsiz bir bağış için onların onayını verdi. Bir klinik-grade insan ES hücre kültürünü Bu embriyo türetilmiş, banked, nitelikli ve düzgün Roslin hücreleri (İngiltere) tarafından belgelenmiş. Jambon steril koşullarda plasenta bağış hastane yönergelere (APHP, Hôpital Saint Louis) için bir onay imzalayan annelerinde sezaryen sırasında tedarik.

1. hazırlanması Kültür Medya ve Kimyasalları

  1. RPE hücre kültür orta hazırlanması
    1. RPE hücre kültür ortamı hazırlamak için % 4 serum yedek (için son hacmi 500 mL 20 mL), 1000 x seyreltilmiş 2-mercaptoethanol (500 mL son hacmi için 500 µL) ve % 1 ' Eagle′s en az gerekli Orta (MEM) non-gerekli amino asitler çözüm (5 mL bir final için ekleyin 500 mL hacmi) Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) yüksek glikoz (475 mL 500 mL nihai bir birim için) için.
  2. Taşıma/koruma orta hazırlanması
    1. Taşıma/koruma orta hazırlamak, penisilin-streptomisin (için son hacmi 500 mL 5 mL) % 1'i CO2' ye ekleyin-bağımsız Orta (500 mL son hacmi için 495 mL) ve 4 ° C'de tutmak
  3. Resuspension thermolysin enzim
    1. Thermolysin stok çözeltisi hazırlanması
      1. Thermolysin stok çözeltisi hazırlamak için oda sıcaklığında-20 ° C'de depolanan thermolysin toz çözülme.
      2. Enzimatik aktivite değişken toplu iş toplu gibi kullanılacak toplu iş thermolysin tozu ile sağlanan analiz belgesi dayalı bu etkinliği hesaplayın. Bölmek "etkinliği tarafsız proteaz hesaplanan ANPC =" (analiz sertifika gösterilir) (Tirozin'ın molekül ağırlığı olan) 181 tarafından. Elde edilen sonuç sağlanan thermolysin toz (U/flakon) Toplam enzimatik aktivite için karşılık gelir.
      3. 200 U/mL stok bir çözüme 200 (U/mL) tarafından ayrılmış toplam enzimatik aktivite (U/flakon) karşılık gelen su hacmi ekleyerek hazırlayın.
      4. Enzim yukarı ve aşağı eklendi su pipetting tarafından çözülür. Girdap 30 s ve onay için çözüm olup toz tamamen askıya alındı. Daha fazla pipetting için tam bir çözünme gerekli olabilir.
      5. Aliquot hisse senedi çözüm ve -20 ° C'de saklayın
    2. Thermolysin çalışan bir çözüm hazırlanması
      Not: Thermolysin çözüm jambon tedavi günü hazırlanmalıdır.
      1. Thermolysin 200 U/mL-20 ° C'de depolanan, hisse senedi aliquots tezcan Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hisse senedi çözüm 200 x 1 U/ml nihai bir enzimatik aktivite elde etmek için oranında seyreltin. 1 – 4 jambon yamalar tedavi etmek için 40 mL hazırlayın.
      2. Thermolysin çözüm kullanmadan 0.2 µm filtre önce aracılığıyla filtre.
  4. Resuspension jelatin
    1. % 20 jelatin çözüm ve blok hazırlanması
      Not: % 20 jelatin çözüm ve blok kadar kullanmadan önce 1 hafta hazır.
      1. CO2sıcak-42 ° c su banyosu (1 s) en fazla 30 dakika içinde bağımsız orta. 50 mL tüp içinde 10 g jelatin için 40 mL sıcak CO2eklemek-bağımsız orta ve girdap çözüm.
      2. 30-60 dk 42 ° C'de jelatin dağıtılması Girdap çözüm homojenize her 10 min.
      3. Bir kez homojen bir çözümdür, dört 6 cm kültür yemekleri için 4 mL % 20 jelatin çözeltisi ekleyin. Bubbles kaçınmak. Bulaşıkları korumak için bir plastik parafin film ekleyin ve 4 ° C'de kuvvetlendirmek çözüm sağlar
    2. %8 jelatin çözelti hazırlanması
      Not: % 8 jelatin çözüm gün kullanmadan önce hazırlanacak ve 4 ° C'de depolanan
      1. CO2sıcak-42 ° c (1 s) en fazla 30 dk için bağımsız orta. Bir 50 mL tüp 4 g jelatin için 46 mL sıcak CO2eklemek-bağımsız orta ve girdap çözüm.
      2. 30-60 dk 42 ° C'de jelatin dağıtılması Tüp korumak ve aynı gün kullanılmak üzere ise 37 ° C'de bir su banyosunda sağlamak için bir plastik parafin film eklemek veya daha sonra kullanılmak üzere ise 4 ° C'de saklayabilirsiniz.

2. Thermolysin tedavisi insan amniyotik membran

  1. İnsan amniyotik membran yıkama
    1. Bir naylon iskele, ya zaten PBS 4 ° C'de sabit veya dondurulmuş küçük parçalar (yaklaşık 30 mm x 30 mm) sağlanan jambon var. Eğer dondurulmuş, membranlar bir kuluçka için 30 dk 37 ° C'de erimek.
    2. Membranlar yıkama:
      1. 1 – 4 membranlar PBS 80 mL içeren bir 250 mL şişe yerleştirin. Çok sayıda şişe gerektiği gibi kullanın.
      2. Her şişe 5 min için yüksek hızda bir plaka shaker sallamayın, sonra PBS atmak. PBS ve tekrar 80 mL ekleyin.
  2. Thermolysin tedavi
    1. 40 mL thermolysin (1 U/mL) membranlar içeren şişe başına çalışma çözeltisi ekleyin (1 – 4 membranlar şişe; başına bir seferde 3 şişe).
    2. 450 d/d, sonra girdap 5 min için şişe sallamak için 30 onları s. 1 x tekrarlayın.
    3. Thermolysin çözüm atın ve PBS 80 mL ekleyin.
    4. 450 rpm'de 5 min için şişe sallamak. PBS atın ve PBS 80 mL ekleyin. 3 x tekrarlayın.

3. bir kültür Ekle insan amniyotik membran fiksasyonu

  1. (Bu şişenin dibinde ulaşabilirsiniz) kadar steril forseps hAMs tek tek kaldırmak için kullanın ve her jambon PBS 10 mL içeren 10 cm kültür çanak transfer.
  2. PBS 10 mL içeren yeni bir 10 cm kültür tabak içinde Membranlar ile naylon aşağı bakacak şekilde yerleştirin. İki membran naylon için düzeltmek için kullanılan dört klip bağlantısını kesin.
  3. Naylon ve membran arasında kültür ucun daha küçük yüzüğü takın.
  4. Membran daha küçük halka tamamen kapsadığından emin olun. Kültür Ekle membran üstüne ikinci bölümü küçük. Jambon membran içinde kültür Ekle karşıya. Son iki klibin bağlantısını kesin.
  5. Kesim, steril makasla, membran dışında kültür Ekle gerekirse fazlalığı. Forseps kullanarak, bir 12-şey plakasına kültür eklemek içinde sabit membran transfer PBS ekleyin ve bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2plaka saklayın.
  6. Diğer membranlar (Kimden adım 3.2-3,5) bu işlemleri tekrarlayın.

4. çözülme ve Retina Pigment epitel hücre insan amniyotik membran üzerinde tohum

  1. Retina pigment epiteli hücrelerinin çözdürme
    1. RPE hücre banka kriyojenik şişe başına 1 milyon hücre, sıvı nitrojen içinde donmuş. Gerektiği gibi çok sayıda kriyojenik şişeleri çözülme (membran 350.000 hücreleri numaralı seribaşı).
    2. RPE orta kriyojenik şişe başına 3 mL içeren bir 15 mL Tüp hazırlayın. Sonra şişeyi çözdürülen, hücreleri her tüpün aktarın. Diğer şişeleri için bu işlemi yineleyin.
    3. Homojenize (yukarı ve aşağı birkaç kez-pipet RPE orta hücrelerde resuspend) ve hücre çözümü 10 µL alıp 1,5 mL tüp aktarmak. Trypan mavi, 10 µL ekleyin. Bu çözümün bir sayım odasında yer 15 µL sonra hücrelerin sayısı (mavi renkli değil) uygun bir 4 X amacı ile mikroskop altında saymak. Diğer şişeleri için bu işlemi yineleyin.
    4. Bu arada, 110 x g 5 dk. atmak için de 15 mL tüpler süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücreleri 700.000 hücre/mL, resuspend.
  2. Retina pigment epiteli hücrelerinin insan amniyotik membran tohumlama
    1. Üzerinden kuluçka makinesi membranların içeren 12-şey plaka kaldırın.
    2. PBS Aspire edin. Adım 4.1.4 kültür Ekle ortasına hazırlanan hücre süspansiyon 500 µL ekleyin. RPE orta kültür Ekle (içinde de) dışında 1 mL ekleyin. Diğer membran için yineleyin.
    3. Kuluçka makinesi membranların içeren 12-şey tabak koyun.

5. bakım Retina Pigment epitel hücre kültürlerinde insan amniyotik membran üzerinde

  1. Orta 2 yenilemek hafta, genellikle Pazartesi ve Cuma, en az kadar her gün 30 kültür.
  2. İçinde ve dışında kültür ekleme her şey için orta Aspire edin ve taze Orta (1 mL kültür Ekle dışında ve içinde 500 µL) ile yenilemek. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2tabak koyun.

6. nakli için Retina Pigment epiteli yama hazırlanması

Not: kültür 30 gün başlayarak, doku nakli için hazırdır.

  1. Sıcak su banyosu 30 dk. 37 ° C'de % 8 jelatin çözümde doldurmak vibratome soğuk CO2iç TMMOB-bağımsız Orta (4 ° C'de).
  2. % 20 jelatin blok vibratome yerleştirin.
    1. % 20 jelatin buzdolabından bloğunu içeren 6 cm kültür yemek al. Bir neşter kullanılarak, bir 5 cm x 5 cm blok kesme. Cyanoacrylate tutkal veya eşdeğeri ile çekmek için blok üst kısmı yapıştırın.
    2. Yeni bir bıçak vibratome yerleştirin.
    3. Jilet aynı düzeyine gelinceye blok düzeyini ayarlayın.
    4. Banyo destek etrafında taze CO2ile doldurun-4 ° C'de bağımsız orta Blok blok düzgün kesilmiş kadar orta hızlı kullanarak, pürüzsüz bir yüzey için önde gelen vibratome ile kesti. 0 konumunu belirleyin.
    5. Kadar tamamen kuru orta jelatin blok etrafında Aspire edin ve 37 ° C'de kuluçka makinesi dokulardan içeren 12-şey kültür plaka almak
    6. Forseps kullanarak kültür Ekle jelatin blok üzerine dikkatlice açın. Kesim, makas ile tüm hücreleri (dışında nerede hücreleri değil kültürlü halka) içermez ve membranlar parçaları. Tüm kalan orta Aspire edin.
    7. Membran kapak için 37 ° C'de 1 mL sıvı % 8 jelatin çözeltisi ekleyin. Aşırı dikkatli bir şekilde çıkarın. 5-8 dakika jelatin kuvvetlendirmek izin vermek için bekleyin.
    8. Taze CO2ekleyin-bağımsız Orta (4 ° C'de) ve banyo membran kaplı kadar.
    9. Kesim, vibratome bir pozisyonda blok çalışma şeklini farkında kalan bir orta hızlı ile-100 µm ile. Bölümünün sonunda doku yönünü korumak için dikkatli olun.
    10. Bir neşter ile bölüm yönünü belirlemek için bir köşe kesti.
    11. İçinde jelatin bir spatula ile gömülü membran toplamak ve alıcı göz içine aşılama kadar koruma orta 4 ° C'de dolu bir 6-şey plaka yerleştirebilirsiniz.
    12. Nakli zamanda, implantın cerrahi mikroskop (1-3 için rats, insan dışı primatlar için 10-15 mm2 ) altında alıcı göz büyüklüğüne boyutunu ayarlamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Jambon RPE hücrelerinin tohum önce kaldırılması gerektiğini bir epitel tabakası içerir. Membran bir enzimatik tedavi altında sallayarak thermolysin ile gerçekleştirilir. Değil için sırayla (epitel bir tarafı) membran polarite kaybetmek, hangi kompozisyon sağlayıcı (Şekil 1A) bağlı olarak farklı olabilir bir destek tamir edildi. Bu adımda verdiği destek için membran yapışma denetleyin ve gerekirse klip ekleyin. Kültür eklemek içinde fiksasyon zamanda, dikkatli bir şekilde delik içinde membran önüne geçmek için çalışma ve onun polarite (Şekil 1Bkadar) karşı karşıya membran ile ilerlemeye devam. Hücre membranlar tohumlari, bu deliklerden kaçış olabilir ve son hücre konsantrasyonu azalır. Delik varlığı bir mikroskop altında veya PBS içinde kültür Ekle ekleyerek ve PBS sızıntı kontrol görüntülenmeyecektir. Herhangi bir membran ile delik atılmalıdır.

Fiksasyon üzerine Kültür yerleştirin, faz kontrast mikroskop içinde kalan hücrelerin değerlendirilmiş (rakamlar 1 c ve 1 D) varlığıdır. Klasik, birkaç ölü hücreleri membran yüzeyinde kalır, ancak kültür orta değiştirildiğinde bu hücreleri yok edilecek (Şekil 1 c). Hiçbir hücre kalırsa membran liflerinin daha yüksek büyütme oranında (Şekil 1 d) görülebilir. Bu durumda değilse, thermolysin ile kuluçka zamanlama ayarlanmış.

RPE hücrelerinin tohum izleyen günlerde hücreleri uygun Eğer kontrol edin. Bağlı olarak kullanılan mikroskop, açıkça ilk birkaç hafta boyunca hücreleri görmek zor olabilir ama hücreleri uymayan varsa, hücre hücre kültürü ortamında dolaşan görülecektir. Epitel oluşur ve olgunlaşmaya başlar sonra (Şekil 2A, 2Bve 2 C) mikroskop altında görmek daha kolay olur. 3 haftada, RPE (Arnavut Örgütü) tipik bir tam monolayer epitel hücreleri oluşturur. 4 hafta sonra epitel implantasyon (Şekil 2B) için onun hazırlanması için yeterince olgun bir davranış. Ancak, bu kültürde lojistik nedenlerle daha fazla hafta için muhafaza edilebilir.

Greft implantasyonu için hazırlık Şekil 3' te tanımlanmıştır. Appozisyon membran % 20 jelatin engellemek için tüm aşırı hücre kültür orta Aspire edin. Bu adım önemlidir, RPE ve membran için kalan herhangi bir ortamda % 8 jelatin yapışma engel. Gerçekten de, orta sıvı jelatin katmanlar arasında bir film oluşturacak.

İmplant gömmek için kullanılan jelatin Bloom dizinini bağlı olarak değişen bir güç olabilir (yani, bir kalite kontrol testi gerçekleştirilen ve tedarikçiler tarafından sağlanan standart bir sıcaklık bir jel gücünü değerlendirir ve konsantrasyon). Kullanılan jelatin yeterince sert değil ve aşılama sırasında disaggregates, kullanılan jelatin başvuru başka bir daha yüksek bir güç ile değiştirilmesi gerekir. Jelatin konsantrasyonu da, onun güç ve esneklik ayarlamak için deneme üzerinde göre değiştirilebilir.

Figure 1
Şekil 1: önce ve sonra thermolysin tedavi ve bir kültür üzerinde tespit jambon temsilcisi görüntüleri. (A)bir doku Bankası tarafından sağlanan bir membran temsilcisi görüntüsü. (B) bir kültür eklemek üzerinde sabit bir membran temsilcisi görüntüsü. (C) thermolysin düşük büyütmede ile tedavi bir membran temsilcisi görüntüsü. (D) thermolysin yüksek büyütmede ile tedavi bir membran temsilcisi görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi RPE hücrelerinin tohum üzerine hAM görüntülerini. (A)tohum önce membran temsilcisi görüntüsü. (B ve C) 3 hafta sonrası tohum membranlar üzerinde RPE hücrelerinin temsilcisi görüntüler. Zar Masası Cgörüldüğü gibi tamamen düzlemsel olmayabilir. Ölçek çubuğu = 100 µm (C), büyütme için 20 µm. (D) 30 sonrası tohum, onları içinde jelatin katıştırma zaman karşılık gelen güne bir membran üzerinde RPE hücrelerinin temsili resim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: jambon bir jelatin film içinde RPE hücre katmanda içeren mühendislik Retina dokusunun eklenmesi için sıralı adımları açıklayan düzeni. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biyolojik bir iskele ve onun hazırlanması için implantasyon hayvan modellerinde RPE hücrelerinin kültürü için bir yöntem nitelendirdi. Bakım prosedürü boyunca jambon yönünün jelatin içine onun dahil kadar Protokolü'nün önemli adımlardan biri. Nitekim, membran yerli epitel kaldırılır ve onun membran maruz kalan9olur. RPE hücrelerinin üstünde tepe-in bu membran seribaşı zorunda. Jelatin katıştırma için hazırlık, tanımlanmış sıcaklığında iş ile tüm ürün çok önemlidir. Gerçekten de, jelatin özelliğini 4 ° C ve sıvı vücut sıcaklığı (37 ° C)9katı vardır. Eğer sıcaklık saygı değil, jelatin kuvvetlendirmek veya nerede bu etkiyi değil isteniyorsa bir adımda sıvılaştırmak olabilir.

Descemet'ın membranlar25 veya jambon26gibi birçok biyolojik iskele önerilmiştir. Özellikle, jambon, bir sezaryen27dan, subretinal uzayda iyi tolere olmak choroidal neovaskülarizasyon26azaltılması ve sınırlı iltihap neden gösterdi. Membran başarıyla insan RPE hücrelerinin9,28kültür destekler. Ayrıca, bu membran de uzun bir geçmişi klinikler29yapım onları iyi adaylar RPE hücre tedavisi için bir iskele, zorunda. Diğer biyolojik destek kolayca bu protokolle uygulamaya olabilir. Sentetik iskele üzerinde polimer esaslı zaten katı ve implantasyon13,30,31,32,33önce gömme bir jelatin gerekmeyebilir. Diğer sistemleri implantasyon için son zamanlarda bir hESC elde edilen RPE monolayer katı polyester iskele34 veya Bruch'ın membran35 taklit etmek için tasarlanmış bir sentetik parilen substrat insan gözünde subretinal teslimat için geliştirilmiştir . Bu stratejileri umut verici olmasına rağmen biyolojik iskele RPE doku mühendisliği için en iyi platform sağlayabilir inanıyorum.

Bu protokol için numaralı seribaşı RPE hücrelerinin insan ES hücreleri bir spontan farklılaşma yöntemiyle elde edilmiştir. Ancak, RPE hücrelerinin farklı türleri kullanılabilir, ya da insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya kadavra veya hatta bir RPE hücre satırı19,36,37elde edilen birincil RPE hücreleri Ayrıştırılan, 38. Ayrıca, Eğer pluripotent kök hücreler kullanarak, birkaç protokol üzerinde spontan bir farklılaşma dayalı veya küçük moleküller farklılaşma18,22kılavuzunu kullanarak RPE hücre elde etmek için geçmiş yıllarda geliştirilmiştir. Bu farklı farklılaşma iletişim kuralları alınan kısıtlı RPE hücrelerinin doku mühendisliği için bu yöntemi ile de kullanılabilir.

Bu yöntemin bir sınırı 4 ° C'de katıştırılmış dokusunun istikrar olduğunu Jelatin hemen önce cerrahi sitesi sevkiyata eklenir, bu sıcaklıkta engraftment kadar muhafaza edilmesi vardır. Bu bağlamda, 48 saat içinde ameliyat yapılmalıdır.

Bu yöntem kolayca kliniğe transfer. CO24 ° C'de içinde jelatin gömülü RPE doku korunmuş-bağımsız orta. Bu orta, gerekirse diğerleri zaten öldükten sonra ve hangi insanlar içine nakillerine için kullanılan elde edilen kornealar korunması için ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış ile yerine. Başarıyla bu strateji için nakli kemirgenler modelleri9içine bir kanıtı-of-concept çalışma verimliliğini gösterdi ve biz şu anda insan dışı primatlar cerrahi yaklaşımda bir klinik için uygulamadan önce doğrulama RP RPE etkileyen belirli şekilleri ile hastaların tedavisi için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Olivier Goureau Retina hücreleri üretimi için insan pluripotent kök hücre ile ilgili patent bekleyen üzerinde mucit biridir. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Jérôme Larghero ve Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Fransa) ayarlama sırasında burada açıklanan yöntemin kendi giriş için teşekkür etmek istiyorum.

Bu eser ANR gelen hibe tarafından desteklenen [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [biyo-mühendislik programı - DBS20140930777] ve LABEX [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau ve Christelle Monville canlandırmak. O NeurATRIS, pluripotent için mühendislik translasyonel araştırma için bir altyapı (Investissements d'Avenir) biotherapies sinir [ANR-11-INBS-0011] ve INGESTEM, Ulusal altyapı (Investissements d'Avenir) tarafından desteklenen ve Christelle Monville için farklı kök hücre [ANR-11-INBS-000]. Karim Ben M'Barek DIM Stempole ve LABEX canlandırmak [ANR-10-LABX-73] arkadaş grupları tarafından desteklenmiştir. Kök Biotherapies Enstitüsü Nadir Hastalıklar Derneği Française contre les Myopathies (AFM) tarafından desteklenen bir parçasıdır-Téléthon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250 mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1x (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100x) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
  5. Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
  6. Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
  7. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
  8. Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
  9. Ben M'Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  10. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  11. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  12. Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
  13. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  14. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
  17. Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
  18. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  19. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  20. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
  21. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  22. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  23. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  24. Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
  25. Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
  26. Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
  27. Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
  28. Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
  29. Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
  30. Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  31. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
  32. Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
  33. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  34. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  35. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  36. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  37. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  38. Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 139 Pluripotent kök hücreler farklılaşma hücre tedavisi retina pigment epiteli Retina dystrophies yaşa bağlı makula dejenerasyonu
Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben M'Barek, K., Habeler, W.,… More

Ben M'Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter