Summary
L’objectif général du présent article est de normaliser le protocole pour l’isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques (CSCs) du coeur de souris adulte. Nous décrivons ici une méthode de centrifugation en gradient de densité d’isoler CCS murins et les méthodes élaborées pour la culture, la prolifération et la différenciation dans les cardiomyocytes CSC.
Abstract
Infarctus du myocarde (im) est des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Un objectif majeur de la médecine régénérative est de reconstituer le myocarde mort après MI. Bien que plusieurs stratégies ont été utilisées pour régénérer le myocarde, la thérapie de cellules souches reste une approche importante pour reconstituer le myocarde mort d’un cœur de MI. Accumuler des preuves suggère la présence de résidents des cellules souches cardiaques (CSCs) au coeur adult et leurs effets endocriniens et/ou paracrine sur la régénération cardiaque. Isolement de CSC et leur caractérisation et différentiation vers des cellules myocardiques, surtout les cardiomyocytes, reste toutefois un défi technique. Dans la présente étude, nous avons fourni une méthode simple pour l’isolation, la caractérisation et la différenciation des CSC du coeur de souris adulte. Nous décrivons ici une méthode de gradient de densité pour l’isolement des CSC, où le cœur est digéré par une solution II de collagénase de 0,2 %. Afin de caractériser les CCF isolés, nous avons évalué l’expression des marqueurs de la CCS/cardiaque Sca-1, NKX2-5 et GATA4 et marqueurs pluripotence/stemness OCT4, SOX2 et Nanog. Nous avons également déterminé le potentiel de prolifération des CSC isolées en les cultivant dans une boîte de Pétri et en évaluant l’expression du marqueur de prolifération Ki-67. Pour évaluer le potentiel de différenciation des CSC, nous avons sélectionné sept à dix jours cultivées CSCs. Nous transférés à une nouvelle plaque avec un moyen de différenciation du cardiomyocyte. Ils sont incubés dans un incubateur de culture cellulaire pendant 12 jours, alors que le milieu de différenciation est changé tous les trois jours. Les CCF différenciées expriment marqueurs spécifiques des myocytes cardiaques : actinine et la troponine I. Ainsi, CSCs isolés avec ce protocole ont stemness et marqueurs cardiaques, et ils ont un potentiel de prolifération et de différenciation vers la lignée cardiomyocyte.
Introduction
Maladie cardiaque ischémique, y compris des infarctus du myocarde (im), est une cause majeure de décès dans le monde1. Thérapie de cellules souches pour régénérer le myocarde mort reste une approche importante pour améliorer la fonction cardiaque de MI coeur2,3,4,5. Différents types de cellules souches ont servi à reconstituer le myocarde mort et d’améliorer la fonction cardiaque d’un cœur de MI. Ils peuvent être classés sur les cellules souches6 et adulte des cellules souches embryonnaires. Dans les cellules souches adultes, divers types de cellules souches ont été utilisées, comme la moelle osseuse des cellules mononucléaires7,8, des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse9,10, tissu adipeux 11,12et du cordon ombilical13et CSC14,15. Les cellules souches peuvent promouvoir la régénération cardiaque par système endocrinien et/ou paracrine actions16,17,18,19,20. Toutefois, une limitation majeure de la thérapie de cellules souches est d’obtenir un nombre suffisant de cellules souches qui peuvent proliférer et/ou différencier vers une lignée cardiaque spécifique21,22. Transplantation autologue et l’allogreffe de cellules souches est un défi important dans la thérapie de cellules souches9. CCS pourraient être une meilleure approche pour la régénération cardiaque parce qu’ils proviennent du fond du cœur, et ils peuvent être plus facilement différenciés en lignées cardiaques que les cellules souches non cardiaque. Ainsi, il réduit le risque de tératome. En outre, les effets endocriniens et paracrine des CSC, tels que les exosomes et miARN dérivés des CSC, pourraient être plus efficaces que les autres types de cellules souches. Par conséquent, le CSCs reste une meilleure option pour la régénération cardiaque23,24.
Bien que les CCM est un meilleur candidat pour la régénération cardiaque dans un cœur de MI en raison de leur origine cardiaque, une limitation majeure avec ccs est moins rendement en raison de l’absence d’une méthode d’isolation efficace. Une autre limitation pourrait être la différenciation altérée des CCS vers cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Pour contourner ces limitations, il est important de développer un protocole efficace pour CSC isolement, caractérisation et différenciation vers la lignée cardiaque. Il n’y a aucun marqueur unique acceptable pour CCM et un isolement d’axée sur le marqueur de surface cellulaire spécifique des CCS des rendements moins CCS. Ici, nous normaliser une approche simple centrifugation en gradient pour isoler CCS du coeur de souris qui est rentable et se traduit par un rendement accru des CSC. Ces CCF isolés peut être sélectionnés pour des marqueurs spécifiques de la surface cellulaire par fluorescence-lancée de cellules mise en court-circuit. En plus de l’isolement de CSC, nous avons fourni un protocole CSC culture, caractérisation, et différenciation vers cardiomyocyte lignée. Ainsi, nous présentons une méthode élégante pour isoler, de caractériser, culture et de différencier les CCS de coeurs souris adulte (Figure 5).
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Protocol
Le logement, l’anesthésie et le sacrifice des souris ont été effectuées selon le protocole IACUC approuvé de l’University of Nebraska Medical Center.
1. les matériaux
- Utilisation 10 à 12-week-old C57BL/6J noir souris mâles, maintenus internes à l’animalerie institutionnel, pour l’isolement des CSC. CSC peuvent également être isolés des souris femelles non gestantes.
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux nécessaires, y compris les ciseaux chirurgicaux, des ciseaux chirurgicaux, pinces à tige courbée et une lame chirurgicale, par autoclavage eux avant l’euthanasie de la souris.
- Préparer les tampons isolement CSC en état stérile et les stocker à 4 ° C sur la glace. Ces tampons sont polysucrose et une solution de diatrizoate de sodium ajusté à une densité de 1,077 g/mL, incomplète Dulbecco aigle modifié, 1 x Ham équilibré de solution saline (HBSS) et cell culture-grade 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Préparer une solution 1 % collagénase II stock (filtrée et stérilisée) et une solution de travail de 0,2 % dans HBSS.
- Conserver les matériaux de la culture de tissus à l’état stérile dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet, y compris une boîte de pétri 10 mm, une plaque 6 puits, une plaque 24 puits, T-25 et T-75 flacons de culture, tubes coniques 15 mL et 50 mL et pipettes sérologiques jetables avec 40 µm et 100 -tamis cellulaire µm avec filtres 0,22 µm.
- Stériliser le 10 µL, 200 µL et pointes de pipette 1 000 µL par autoclave.
- Utiliser des gants nitrile sans poudre et l’éthanol à 70 % pour maintenir un état stérile pendant toute l’expérience.
- Utiliser 10 % eau de Javel comme désinfectant.
- Utiliser commercialement disponible moyen de maintenance de CSC et cardiomyocytes moyen de différenciation pour la culture et de la différenciation des CSC, respectivement.
2. méthode isolement des cellules souches cardiaques
- Euthanasier quatre ou cinq mâle adulte (ou des femmes non enceintes) souris à l’aide d’une chambre de CO2 . Difficulté aux armements de chaque souris sur un carton de dissection séparées par des goupilles ou des bandes collantes.
- Pulvériser l’éthanol à 70 % sur la souris pour se débarrasser des germes extérieurs et de maintenir la condition stérilisée pendant la récolte du cœur. Faites une incision avec des ciseaux au milieu de l’abdomen et couper la peau de l’abdomen jusqu'à la cage thoracique en ligne droite. Enlever la peau des deux côtés de coupe moyenne pour déminer la zone abdominale de la peau et des poils. À l’aide de pinces et ciseaux, coupez la membrane sous la cage thoracique.
- Ouvrir la cavité thoracique de la souris en coupant la cage thoracique à l’intérieur de la hotte. Exposer le cœur et enlever le sang près du coeur. Laver la zone environnante du coeur avec du PBS glacée pour se débarrasser du sang dans les environs de cœur.
- Disséquer le cœur à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Place le coeur dans une boîte de pétri 100 mm contenant 10 mL de PBS glacée.
- Palpiter le cœur à l’aide de pinces à tige courbée et enlever les résidus de sang à l’intérieur du cœur.
- Utilisez le coeur entier pour l’isolement des CSC.
- Transférer tous les coeurs ensemble quatre ou cinq dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de HBSS glacée. Maintenir le tube sur la glace jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
- Essuyer l’intérieur et à l’extérieur d’une prévention des risques biotechnologiques armoire avec éthanol à 70 % pour créer un environnement stérilisé. Stériliser le tube contenant du coeur et autres matériaux nécessaires avec l’éthanol à 70 %. Placez le tube contenant du cœur dans la prévention des risques biotechnologiques armoire pour un traitement ultérieur.
- Transférer le cœur à un 100 mm boîte de pétri contenant 10 mL de HBSS glacée. Laver le cœur à nouveau en palpant pour enlever tout résidus de sang à l’intérieur du cœur. Changez la solution HBSS après chaque lavage pour assurer l’élimination complète du sang.
- Couper les coeurs en petits morceaux à l’aide des ciseaux chirurgicaux ou une lame chirurgicale dans un 100 mm boîte de pétri contenant de 5 à 7 mL de solution HBSS. Tenez chaque cœur avec une paire de pinces et utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux de fines ou une lame chirurgicale pour couper le coeur en morceaux de 2 à 4 mm. Changez la solution HBSS fréquemment pour s’assurer sans sang HBSS. Émincer le cœur dans la solution HBSS.
- Centrifuger le tissu haché à 500 x g à 4 ° C pendant 5 min. jeter le surnageant et garder le diabolo.
- Resuspendre le culot dans 5 à 6 mL de solution II de collagénase de 0,2 % dans un tube conique de 50 mL. Le volume de solution de collagènase devrait être presque 1.5 - à 2 fois le volume du culot.
Remarque : pour la digestion de collagénase 0,2 % I et 2,5 U/mL, solution a pouvons remplacer 0,2 % collagénase II de tissu. Utiliser un volume presque égal de solution a à la collagénase j’ai solution. - Bien mélanger le culot avec 0.2 % solution de collagènase II en agitant le tube ou en poussant le tube sur un agitateur à 75 x g pendant 45-60 min à 37 ° C. Agiter vigoureusement le tube à la main après chaque 20-30 min pour renforcer la lyse.
- Broyer le mélange de tissus lysées à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et une pointe de pipette de 1 mL de dissocier le morceau de tissu dans la suspension monocellulaire.
Remarque : Pour obtenir la récupération maximale des CSC, broyer le mélange de lyse pendant au moins 5 min. Si les morceaux de tissus sont relativement gros, couper l’extrémité d’une pointe de pipette 1 mL avec des ciseaux ou une lame chirurgicale et utilisez-la pour la trituration. - Arrêtez la lyse enzymatique du tissu en ajoutant le support de maintenance CSC disponible dans le commerce. Ajouter presque 2-3 x plus moyen de maintenance comme le volume du tissu à l’étape 2.14 lysé.
- Passer la suspension cellulaire digérées à travers un tamis de cellule de 100 µm pour enlever les morceaux de tissu non digérés.
- Répétez l’étape 2.16 à l’aide d’une passoire de cellule de 40 µm.
- Séparer les cellules par centrifugation en gradient de densité. Pour la séparation des cellules, doucement superposer un égal volume de filtrat au fil de la solution de diatrizoate de polysucrose et de sodium. Par exemple, tout d’abord, ajoutez 20 mL de solution de diatrizoate de polysucrose et de sodium dans un tube conique de 50 mL, puis, ajoutez 20 mL du filtrat de l’étape 2.17 leur solution de diatrizoate polysucrose et sodium.
NOTE : Préchauffer le polysucrose et solution de diatrizoate de sodium à 37 ° C avant utilisation avec les cellules. Ajouter le filtrat de l’étape 2.17 leur solution de diatrizoate polysucrose et sodium très lentement et avec précaution pour éviter tout mélange des deux solutions. Cela est considéré comme une étape cruciale. - Centrifuger le tube contenant les deux solutions à 500 x g pendant 20 min à température ambiante à l’aide d’une centrifugeuse de seau de swing. Définissez la centrifugeuse à une vitesse d’accélération et de décélération inférieure pour éviter de mélanger les deux solutions et pour une bonne séparation des CSC. Il s’agit d’une étape importante dans l’isolement de la CSC. Mettre le tube contenant le mélange gradient très lentement sans perturbation à l’intérieur de la centrifugeuse et placez-la pendant la centrifugation.
- Retirer la couche leuco-plaquettaire avec une solution supplémentaire de la couche supérieure en utilisant une pipette 1 mL ou une pipette Pasteur en plastique dans un tube stérile de 15 mL. Cette couche leuco-plaquettaire contiendra les CCF.
Remarque : Prendre des précautions supplémentaires pendant le pipetage de la couche leuco-plaquettaire ne pas à retirer la couche de solution de diatrizoate polysucrose et de sodium parce qu’il est toxique pour les CCF. - Ajouter un volume égal de support de maintenance de CSC à la suspension de cellules de l’étape 2.20 et le mélanger correctement pour neutraliser la polysucrose résiduelle et la solution de diatrizoate de sodium, s’il est présent.
- Centrifuger la suspension de cellules ci-dessus à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 7 à 10 mL de milieu DMEM incomplète et il centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C pour se débarrasser de toute polysucrose résiduel et la solution de diatrizoate de sodium.
- Recueillir le culot, qui contient les CCF purifiées.
- Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de maintenance de CSC, comptez le nombre de CSC et utiliser le culot de culture. Pour compter le nombre de CSC, utiliser une coloration bleu Trypan et un hémocytomètre. Avec quatre cœurs de souris mâles, le rendement du CSCs est ~1.8 millions.
- Graines les CCF dans une plaque de 6 puits culture recouvert d’une solution de gélatine de 0,02 % contenant 0,5 % la fibronectine. Utiliser 2 mL de milieu de maintenance complète pour l’amorçage. Incuber la plaque de culture dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
- Remplacer le milieu de culture CCS par milieu de maintenance complet SCC chaque jour jusqu’au troisième jour. Après cela, changer le milieu un jour sur deux.
- Déterminer la croissance des CSC en les observant au microscope.
3. la culture entretien et Passage de cellules souches cardiaques
- Culture les CCF isolés dans un milieu d’entretien disponibles dans le commerce. Remplacer le milieu de culture avec la moyenne des frais d’entretien un jour sur deux. Lorsque la culture de la CSC a atteint confluence, transférer les CCF à une nouvelle plaque recouverte de gélatine et la fibronectine, comme indiqué dans l’étape 2.26. Détachez les CCF cultivées en tampon de dissociation enzymatique cellulaire. Suivez le protocole standard de dissociation cellulaire de la plaque de culture. À ce stade, SCCC est considérés au passage 0 stade (P0).
- CSCs P0 culture dans de la gélatine une nouvelle plaque de fibronectine-enduit en milieu de maintenance complet SCC à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %, leur permettre d’être confluentes et puis suivez l’étape 3.1 pour obtenir le passage 1 (P1) CCF. magasin P1 CCF dans l’azote liquide ou utilisez-les pour experi ments.
- Semences de 0,5 millions de cellules dans une plaque 6 puits ou 1 million de cellules en T-25 à maintenir la culture de la CSC à son stade initial.
- Passage les CCF quand ils deviennent confluente de 85-90 %. CCS peuvent être cultivées dans le milieu de l’entretien jusqu'à quatre à six semaines.
Remarque : Maintenir la densité de semis initiale des CSC relativement élevées (40 % - 50 %) car, à une plus faible densité de semis, les CCS peuvent changer leur morphologie plate et allongée.
4. caractérisation des cellules souches cardiaques
- Afin de caractériser les CCF cultivées, observez-les sous un phage-contraste ou un microscope lumineux-zone. Placer la plaque contenant du CSC sur l’objectif d’un microscope à fluorescence. Définissez l’assez faible grossissement (10 X) à concentrer les cellules. Ouverture de contraste de phase permet d’observer les cellules. Augmenter le grossissement de 20 X en changeant la lentille d’objectif et image le CSCs. Augmentez l’objectif 40 X et image les CCF. En deux jours, les CCF apparaissent presque rondes en forme, mais la taille de la cellule augmente avec le temps et en sept jours, les CCF apparaissent presque cylindriques dans la forme (Figure 1 a - 1C).
- Effectuer l’immunomarquage de CSC avec marqueurs de pluripotence/stemness (OCT4, SOX2 ou Nanog), prolifération (Ki-67) (Figure 2 a - 2D) et cellules d’origine cardiaque/progénitrices (Sca 1, NKX2-5 ou GATA4) (Figure 3 a - 3C).
- Pour l’immunohistochimie des CSC, graines 10 000 CCS dans une plaque de culture de 24 puits.
- Le lendemain (après 18 à 24 h), fixer les CCF dans 300 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min.
- Laver les CCF avec 500 µL de PBS glacée, 3 x avec des intervalles de 5 min.
- Permeabilize les CCF avec 300 µL de 0,2 % Triton X-100 dilué dans du PBS pendant 10 min.
- Laver les CCF avec 500 µL de PBS glacée, 3 x avec des intervalles de 5 min.
- Effectuer le blocage des CSC avec 300 µL de BSA 1 % diluée dans du PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) ou 300 µL de sérum de poulet normal 10 % dilué dans du PBST pendant 1 h.
- Incuber les CCF dans 200 µL d’anticorps primaire dilué en bloquant la solution pendant une nuit à 4 ° C. Diluer l’anticorps primaire tel que recommandé par la feuille de données d’anticorps ou selon les directives de normalisation.
- Laver les CCF avec 500 µL de PBS glacée, 3 x avec des intervalles de 5 min.
- Incuber les CCF dans 200 µL d’anticorps secondaire dilué en bloquant la solution (voir étape 4.2.6) pendant 1 h à température ambiante. Diluer l’anticorps secondaire tel que recommandé par la feuille de données d’anticorps ou selon les directives de normalisation.
- Laver les CCF avec 500 µL de PBS glacée, 3 x avec des intervalles de 5 min.
- Contre-coloration CSC avec 200 µL de DAPI (1 µg/mL) dilué dans du PBS pendant 5 min.
- Laver les CCF 1 x avec 500 µL de PBS glacée. Puis, ajouter 300 µL de PBS glacée dans chaque puits.
- Effectuer l’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence. Suivez les instructions de l’imagerie, de nature à éviter la lumière directe sur la plaque fluorescente. Maintenir la plaque de culture au microscope. Concentrer les cellules à différents grossissements. Observer les cellules sous le contraste de phase ou le filtre d’excitation différente et enregistrer les images.
- Stocker la plaque dans l’obscurité à 4 ° C.
5. différenciation des cellules souches cardiaques en Cardiomyocyte
- Pour la différenciation des CSC, graines 500 000 CCS dans une plaque 6 puits avec 2 mL de préchauffer (37 ° C) disponible dans le commerce CSC entretien moyen.
- Incuber la plaque contenant les CCF dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Laissez les CCF d’attacher et de proliférer jusqu'à une croissance secondaire confluente. Si le milieu se colore en jaune, remplacer le milieu de culture avec la moyenne des frais d’entretien.
- À la confluence de 85-90 %, remplacer le milieu de l’entretien avec 2 mL de cardiomyocytes préchauffer (37 ° C) moyen de différenciation. Incuber la plaque dans un incubateur à CO2 à 37 ° C pendant 2-3 semaines.
- Changer le moyen de différenciation tous d. 2-3 observez la morphologie des CSC au microscope chaque fois pendant le milieu changent pour garantir les conditions de bonne culture.
- Après 12 jours de la culture de la CSC au moyen de différenciation, image les CCF pour les marqueurs de différenciation suivant un immunomarquage standard du protocole (voir étapes 4.2.1 - 4.2.14). Enregistrer les images fluorescentes pour l’expression des marqueurs de cardiomyocytes (Figure 4 a - 4 b).
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Representative Results
Dans la présente étude, nous avons isolé CCS des coeurs de souris mâles C57BL/6J âgés de 10 à 12 semaines. Ici, nous avons présenté une méthode simple pour CSC isolement et caractérisation à l’aide de marqueurs de pluripotence. Nous avons également présenté une méthode élégante de différenciation de la CSC et la caractérisation des CSC qui se différencient vers la lignée de cardiomyocytes. Nous avons observé une morphologie de forme de broche des CSC 2 à 3-jours-cultivées sous un microscope à contraste de phase (Figure 1 a et 1 b). Nous avons constaté un changement dans la morphologie des CSC à 7 jours de culture dans le milieu de l’entretien, au cours de laquelle les cellules souches deviennent allongée (Figure 1). Nous avons caractérisé CSCs marqueurs de pluripotence et constaté qu’elles expriment OCT4, SOX2 et Nanog (Figure 2 a - 2C). Nous avons également constaté que CCS prolifèrent en milieu de culture et d’expriment le marqueur de prolifération Ki-67 (Figure 2D). Afin de caractériser l’origine cardiaque de CSC, nous avons déterminé l’expression des marqueurs cardiaques Sca-1, NKX2-5 et GATA4 dans CCS. Nous avons trouvé une expression de marqueurs cardiaques dans les CCF cultivées (Figure 3 a - 3C). Pour déterminer la différenciation des CCS vers cardiomyocyte lignée, nous avons cultivé CSCs dans cardiomyocyte différenciation milieu pendant 12 jours. Après 12 jours, nous imagés les CCF différenciés pour les cardiomyocytes marqueurs actinine et la troponine I. Nous avons observé que cardiomyocyte marqueurs ont été exprimés dans CCS différenciées (Figure 4 a - 4 b). Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que nous avons isolé avec succès CCS de coeur de souris et que ces CSCs peuvent proliférer et différencier vers la lignée de cardiomyocytes.
Figure 1 : morphologie des cultivés CSC. Ces panneaux montrent imagerie de contraste de phase des CSC cultivées, nommément représentant CSCs après 2 jours de culture dans un milieu entretien à (A1), 20 X et objectifs (A2), 40 X, représentant CSCs après 3 jours de culture dans un milieu d’entretien à) B1) 20 X et d’objectifs (B2), 40 X et représentant CSCs après 7 jours de culture dans un milieu entretien à (C1), 20 X et objectifs (C2), 40 X. Les barres d’échelle sont 100 µm pour le taux de grossissement X 40 et 200 µm pour le taux de grossissement X 20.
Figure 2 : caractérisation des CSC pour marqueurs pluripotence. Ces panneaux montrent imagerie de fluorescence représentatif des CCS des marqueurs de pluripotence (OCT4, SOX2 et Nanog) et de la prolifération (Ki-67). Panneaux A montre expressions du OCT4 (vert) et DAPI (bleu) au CSCs à (A1), 20 X et (A2), 40 X grossissements. Panneaux B montrent des expressions de SOX2 (vert) et DAPI (bleu) dans CCS (B1), 20 X et agrandissements (B2), 40 X. Panneaux C montrent des expressions de Nanog (vert) et DAPI (bleu) au CSCs à (C1), 20 X et (C2), 40 X grossissements. Panneaux D montrer expressions du Ki-67 (rouge) et au DAPI (bleu) au CSCs à (D1), 20 X et (D2), 40 X grossissements. Les barres d’échelle sont 100 µm pour le taux de grossissement X 40 et 200 µm pour le taux de grossissement X 20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : caractérisation des CSC pour marqueurs cardiaques. Ces panneaux montrent imagerie de fluorescence représentatif des CSC cultivées pour marqueurs cardiaques. Panneaux A montre expressions du Sca-1 (rouge) et le DAPI (bleu) au CSCs à (A1), 20 X et (A2), 40 X grossissements. Panneaux B montrent des expressions NKX2-5 (vert) et DAPI (bleu) dans CCS (B1), 20 X et agrandissements (B2), 40 X. Panneaux C montrent des expressions de GATA4 (rouge) et DAPI (bleu) au CSCs à (C1), 20 X et (C2), 40 X grossissements. Les barres d’échelle sont 100 µm pour le taux de grossissement X 40 et 200 µm pour le taux de grossissement X 20.
Figure 4 : caractérisation de la différenciation de la CSC vers cardiomyocyte lineage. Ces panneaux montrent représentant contraste de phase et l’imagerie de fluorescence des 12-jours différenciés CSCs. (A) ce panneau montre l’expression du cardiomyocyte marqueur actinine dans CCS différenciées, avec (a) une image de phase-contrat, (b ) une image de fluorescence de DAPI (noyau de coloration), image (c) une fluorescence d’actinine (vert) et (d) une nouvelle image des panneaux un - c. Les grossissements sont 40 X. (B), ce panneau affiche l’expression du cardiomyocyte troponine marqueur I en différenciées CSCs, avec (un) une image de phase-contrat, (b) une fluorescence image de DAPI (noyau de coloration), image (c) une fluorescence de troponine I (vert) et (d) une image fusionnée de panneaux a - c. Les grossissements sont 40 X. Les barres d’échelle sont 100 µm pour le taux de grossissement X 40 et 200 µm pour le taux de grossissement X 20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : représentation schématique des différentes étapes de l’isolement de la CSC, la culture et la différenciation. Nous avons utilisé des coeurs chirurgicalement enlevées de quatre à cinq souris adultes pour l’isolement des CSC. Le processus progressif d’isolement, culture et différenciation vers cardiomyocytes lignées CSC sont présentés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Voici les étapes critiques du présent protocole d’isolement de CSC. 1) une condition stérilisée doit être maintenue pour l’extraction des cœurs des souris. Toute contamination lors de l’extraction du coeur peut compromettre la qualité du CSCs. 2) le sang doit être complètement retiré avant de broyer le cœur, qui est effectué par plusieurs lavages de tout le cœur et le cœur des pièces avec solution HBSS. 3) les morceaux de coeur doivent être complètement lysées dans une suspension de cellules individuelles avec solution de collagènase. 4) la solution dégradée diatrizoate polysucrose et de sodium pour la séparation des cellules doit être préchauffée. 5) le milieu de la culture de la CSC doit être préchauffé. 6) au confluent des CSC au cours de l’amorçage dans une boîte de Petri devrait être élevé car, en bas confluence, CSCs peuvent changer leur morphologie. 7) le nombre de CSC doit être noté après l’isolement du cœur et avant le placage dans une boîte de Petri. Le nombre de CCS indique l’efficacité de l’isolement du cœur. Le comptage des CSC est important pour l’ensemencement des CSC dans la plaque de culture.
Nous avons utilisé des souris adultes pour isoler le CSC, qui a été utilisé par d’autres chercheurs dans les modèles de rongeurs23,28. CCS peuvent être isolés de coeurs rongeurs nouveau-nés29,30 et même à partir de la biopsie d’un coeur humain31. Les protocoles d’isolement CSC rapportées antérieurement ont certaines limites, telles que moins de rendement, une procédure complexe d’isolation, une longue durée de différenciation et moins cardiomyocyte différenciation potentiels32,33, 34. protocole d’isolement le CSC présentée ici est simple : il prend moins de temps et est rentable et plus efficace avec un rendement de CSC. En outre, les CSC isolées sont Sca-1+ ve (marqueur reconnu pour souris CSCs) (Figures 1 a 1 - 2 de 3). Pour la différenciation des CSC, autres protocoles ont besoin de trois à quatre semaines35,,36. Toutefois, ce protocole requiert 12 jours (Figures 4 a - 4 b). L’isolement des CSC axée sur la centrifugation du gradient présenté ici donne ~1.8 millions CCS des coeurs de quatre souris mâles.
Bien que le rendement des CSC est élevé, une limitation de ce protocole est l’uniformité et la pureté des CSC isolées. Parce qu’il n’y a aucun marqueur unique acceptable pour la CSC, il est difficile d’utiliser un marqueur de cellule-surface unique pour sélectionner CSC. Toutefois, CSC isolées par le présent protocole peut être utilisé pour obtenir une population uniforme de CCS basé sur un marqueur spécifique ou plusieurs marqueurs de CSC, à l’aide de tri cellulaire activés par fluorescence. Ainsi, cette méthode d’isolement de la CSC est rentable avec un rendement élevé et a la possibilité d’obtenir une population de CSC uniforme issue des marqueurs de surface cellulaire spécifique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu, dans certaines régions, par les subventions des National Institutes of Health HL-113281 et HL116205 à par Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
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