基于类病毒系统的Escherichia coli中环形支架上大规模生产重组RNA

摘要

本文介绍一种通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中共表达嵌合RNA和植物tRNA连接酶来大量生产重组RNA的实验方案。该嵌合RNA包含目标RNA序列和类病毒骨架。主要产物为环状分子，有利于实现均一纯化。

摘要

随着人们对RNA生物学及其在复杂生物技术应用中使用RNA分子的兴趣日益增加，生产大量重组RNA的方法却十分有限。本文介绍了一种在体外生产大量重组RNA的实验方案 大肠杆菌 基于嵌合分子的共表达，该嵌合分子包含目标RNA与类病毒骨架融合的序列以及植物tRNA连接酶。类病毒是相对较小、非编码、高度碱基配对的环状RNA，可感染高等植物。宿主植物tRNA连接酶是一种被属于类病毒科的类病毒所招募的酶。 Avsunviroidae，例如 茄子潜隐病原体 （ELVd）以介导RNA在类病毒复制过程中的环化。尽管ELVd不在 E. coli一种ELVd前体可被高效转录 E. coli RNA聚合酶在细菌细胞内转录并由嵌入的锤头状核酶加工，产生的单体通过共表达的茄子tRNA连接酶环化，达到显著浓度。将目标RNA插入ELVd支架中，可在常规实验室条件下每升细菌培养物中生产数十毫克的重组RNA。RNA产物的主要组分为环状，这一特性有利于将重组RNA纯化至近乎均一。在本方案中，将对应于目标RNA的互补DNA（cDNA）插入表达质粒中ELVd cDNA的特定位置，并与共表达茄子tRNA连接酶的质粒共同用于转化 E. coli在强组成型启动子的调控下共表达这两种分子，可产生大量重组RNA。该重组RNA可从细菌细胞中提取，并利用其环状特性与大部分细菌RNA分离。

引言

与DNA和蛋白质相比，能够简便、高效且低成本地大量制备RNA的实验方案并不丰富。然而，科研与工业领域对这些生物大分子的需求日益增长，以深入研究其独特的生物学特性¹，或用于复杂的生物技术应用，包括作为高特异性的适配体²，治疗剂³，或选择性杀虫剂⁴体外转录和化学合成是研究中常用的RNA制备方法。然而，当需要大量产物时，这些方法存在重要局限性。合理的替代策略是利用活细胞内源性的转录机制，再通过纯化步骤将目标RNA与其共存的细胞组分分离。基于这一策略，已发展出在细菌细胞中生产重组RNA的方法，例如实验室常用的大肠杆菌 大肠杆菌⁵ 或海洋紫色光合α-变形菌 Rhodovolum sulfidophilum⁶大多数在细菌中生产重组RNA的方法依赖于表达一种天然的高稳定性RNA骨架（如tRNA或rRNA），并将目标RNA插入其中⁷这要求必须将目标RNA从嵌合分子中释放出来，如果额外的RNA对后续应用造成干扰的话。⁸重组RNA生物技术的另一个概念是生产可作为目标产物的重组核糖核蛋白复合物 本身 或用作一种保护策略，以提高目标RNA的稳定性^9,10同样，环状RNA的制备也被提出作为一种生成更稳定产物的策略¹¹.

我们最近开发了一种在E. coli中大量生产重组RNA的新方法，该方法涉及上述三个概念中的三个：将目标RNA插入一个高度稳定的环形RNA支架中，并使重组RNA与一种相互作用蛋白共表达，从而可能形成稳定的核糖核蛋白复合物，并在细菌细胞中大量积累¹²。与以往的方法不同，我们采用了一种完全异源于E. coli的RNA支架，即类病毒。类病毒是一类特殊的高等植物病原体，仅由一段相对较小（246–401 nt）且高度碱基配对的环形RNA构成¹³。有趣的是，类病毒属于非编码RNA，无需自身编码的蛋白质协助，即可在宿主细胞内完成复杂的感染循环¹⁴。这些循环包括在细胞核或叶绿体中进行的RNA到RNA的复制（取决于类病毒科别——分别为Pospiviroidae和Avsunviroidae）、在植株体内的系统移动以及逃逸宿主防御反应。由于类病毒是裸露的环形RNA，且必须在受感染植物细胞的恶劣环境中存活，因此可被视为自然界中最稳定的RNA之一。这一特性使其在生物技术应用中成为稳定重组RNA的理想支架。此外，该新方法基于类病毒支架与一种相互作用的植物蛋白的共表达。类病毒通过滚环机制进行复制，该过程招募宿主酶来催化各个步骤。值得注意的是，某些类病毒，特别是属于Avsunviroidae科的类病毒¹⁵，其基因组中含有核酶，也参与复制过程。根据类病毒种类的不同，类病毒RNA的转录由宿主RNA聚合酶II或叶绿体核编码RNA聚合酶（NEP）介导。类病毒RNA的加工似乎由宿主III型RNase催化，但在含有核酶的类病毒中，寡聚RNA中间体会在复制过程中自我切割。最后，产生的类病毒单体通过宿主DNA连接酶1或叶绿体形式的tRNA连接酶环化，具体取决于类病毒科别^16,17。后者参与Avsunviroidae科类病毒（如Eggplant latent viroid（ELVd））单体形式的连接¹⁸。

在分析决定茄子（Solanum melongena L.）tRNA连接酶识别ELVd的序列与结构要求的研究过程中，我们建立了一个基于在E. coli¹⁹中共同表达这两种分子的实验系统。我们注意到，长度超过单体单位的ELVd转录本可在E. coli细胞内通过其内部嵌入的锤头状核酶高效地自我切割，产生的具有5'-羟基和2',3'-磷酸二酯末端的viroid单体可被共表达的茄子tRNA连接酶高效环化。更值得注意的是，所生成的环状viroid RNA在E. coli中达到出乎意料的高浓度，甚至超过内源rRNA的水平¹²。由于未检测到复制中间体，表明这些细菌细胞中不存在ELVd RNA到RNA的扩增过程。有趣的是，在viroid分子的特定位置插入异源RNA对环状viroid来源RNA的积累仅有中等程度的影响¹²。这些观察结果促使我们设想出一种在细菌中大量生产重组RNA的方法。该方法中，将目标RNA对应的cDNA插入ELVd cDNA中，并通过强组成型启动子在E. coli中表达所形成的嵌合RNA。为使该系统正常工作，必须将E. coli共转化一个表达茄子tRNA连接酶的质粒。ELVd来源的长于单体单位的转录本由内部嵌入的锤头状核酶进行加工，产生的具有正确末端的单体被共表达的tRNA连接酶识别并环化。由此，目标RNA被插入到由viroid环状分子构成的高度稳定支架中。这种重组嵌合RNA很可能在E. coli细胞内通过与tRNA连接酶相互作用形成核糖核蛋白复合物而进一步稳定。利用该方法（见下文实验方案），在常规实验室条件下，每升E. coli培养物可轻松生产出数十毫克的RNA适配体、发夹RNA及其他结构化RNA，并可利用其环状特性进行均一化纯化¹²。

方案

1. 质粒构建

1. 使用带有5’端延伸的引物，通过PCR（若起始模板为RNA，则采用逆转录PCR）扩增与目标RNA对应的cDNA，以便将其组装至表达质粒中。 为避免产生非预期的突变，应使用高保真DNA聚合酶。
   1. 通过Gibson组装将cDNA插入表达质粒²⁰，向PCR引物添加以下5’延伸序列：上游引物为5’-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’；下游引物为5’-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’；其中X代表与目标RNA末端同源的核苷酸。
   2. 98 °C孵育30秒，随后进行30个循环：98 °C变性10秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，最后在72 °C延伸10分钟。
2. 用10 U的I型IIS限制性内切酶消化100 ng质粒pLELVd-BZB Bpi 在0.5 mL离心管中，于37 °C下在20 µL反应体系中孵育1 h，缓冲液G（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl₂）₂，50 mM NaCl，0.1 mg/mL BSA。
   注意： 所有质粒均可向通讯作者申请获取。 Bpi I 等价于 Bbs 一、
3. 使用含TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA，pH 7.2）的1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和酶切产物。将凝胶置于200 mL浓度为0.5 µg/mL的溴化乙锭溶液中振荡染色15分钟。利用紫外透射仪观察DNA条带，并切下对应于扩增cDNA和目标片段的条带 Bpi 用手术刀片切割I型消化的质粒（2046 bp）。
   注意： Bpi pLELVd-BZB 的 I 消化也释放出一个 528 bp 的产物，对应于 LacZ 蓝白斑报告基因。
4. 使用硅胶柱（凝胶DNA回收试剂盒）从凝胶片段中洗脱DNA 材料表并通过分光光度法分析定量DNA浓度。
5. 使用扩增的cDNA和酶切后的质粒进行Gibson组装反应。插入片段的摩尔量应为载体的3倍。 与 载体²⁰. 50 °C 下孵育 1 小时，使用硅胶柱纯化反应产物（DNA 纯化） & 浓缩试剂盒在 材料表).
6. 使用Gibson组装反应的纯化产物对感受态细胞进行电穿孔 E. coli DH5α细胞。使用1 mm电穿孔比色皿，设置参数为：1,500 V，5 ms。在含有分解代谢物阻遏的超优化肉汤（SOC；20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，0.5 g/L NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl₂）中，37 °C孵育1小时。₂，20 mM葡萄糖，pH 7.0）液体培养基中，随后涂布于含50 µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB；10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl）琼脂（1.5%）平板上。
   1. 筛选对应于转化的菌落 E. coli 在将电穿孔细胞铺板前15分钟，向可能含有插入片段的克隆中加入30 µL浓度为50 mg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal）二甲基甲酰胺溶液。37 °C过夜培养平板。
7. 挑取数个白色菌落，于37 °C液体LB培养基中过夜培养。使用质粒小提试剂盒（miniprep kit）纯化质粒（参见 材料表）并在TAE缓冲液中通过1%琼脂糖凝胶电泳分析其大小。
8. 根据电泳迁移率与pLELVd-BZB对照相比，选择最可能的重组质粒。使用引物5’-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3’和5’-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3’对所选质粒进行测序，以确认其序列，这两个引物位于pLELVd-BZB中整个表达盒的两侧。
   注意： 请注意，该质粒含有一个528 bp的多克隆位点，其中LacZ标记将被目的cDNA所替换。限制性酶切图谱分析有助于筛选正确的重组质粒。

2. RNA 表达

1. 共电穿孔（见1.6步骤中的条件）所选 E. coli 菌株（E. coli BL21 或 BL21 衍生菌株，转化含有目标 RNA 对应 cDNA 的 pLELVd-BZB 衍生质粒以及质粒 p15LtRnlSm，以共表达茄子 tRNA 连接酶。使用 E. coli HT115(DE3)，缺乏RNase III²¹，用于表达具有长双链区域的RNA。
   注意：目的RNA和tRNA连接酶mRNA均由 E. coli RNA聚合酶。无需含有DE3溶原化噬菌体以表达T7 RNA聚合酶的菌株 E. coli 菌株，尽管该溶原性噬菌体的存在不会产生有害影响。
2. 之后 1 37 °C 下于 SOC 液体培养基中孵育 1 小时，将电转化后的细菌涂布于含有 50 µg/mL 氨苄青霉素和 34 µg/mL 氯霉素的 LB 固体培养基平板上，37 °C 过夜培养。
3. 挑选一个菌落，接种于装有250 mL液体培养基的1 L挡板三角烧瓶中 毫升液体TB培养基（12 g/L 胰蛋白胨，24 g/L 酵母提取物，0.4% 甘油，0.17 M KH₂PO₄，以及 0.72 M K₂HPO₄），含50 µg/mL氨苄青霉素和34 µg/mL氯霉素。在37 °C、180转/分钟（rpm）剧烈振荡条件下培养。在接种培养后12至16小时收获细菌。

3. RNA 提取与纯化

1. 为进行分析，在预定时间点取 2 mL 培养液样品，于 14,000 x g 离心 g 孵育2分钟。弃去上清液，将细胞重悬于50 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）中，涡旋混匀。
   1. 加入等体积（50 µL）苯酚（用水饱和，并用Tris-HCl缓冲液pH 8.0平衡至pH 8.0）与氯仿的1:1（v/v）混合液。通过剧烈涡旋震荡裂解细胞，随后离心5分钟以分离水相和有机相。 分钟，在14,000 x g.
   2. 小心回收含有总细菌RNA的水相（上层）。
      注意：样品可在 -20 °C 保存，以备后续分析。
2. 出于制备目的，将培养物倒入250 mL离心瓶中，在14,000 x g 10分钟。弃去上清液。通过在30中重悬细胞来洗涤细胞 mL 水。转移至离心管，相同条件下再次离心收集细胞。
3. 弃去上清液，并将细胞重悬于 10 通过涡旋振荡将样品与色谱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.5，150 mM NaCl，0.2 mM EDTA）混合。
   注意： 此时，可将细胞于 -20 °C 冻存，以便在其他任意时间进行纯化。
4. 使用新鲜或解冻的细菌样品，通过加入1体积（10 mL) 苯酚：氯仿（见步骤 3.2），并剧烈涡旋振荡。
5. 以 12,000 x g 离心 10 分钟 g，回收水相，并用1体积（10 mL）氯仿，在相同条件下。
   注意： 此时，RNA 样品可在 -20 °C 保存。
6. 通过阴离子交换色谱进一步纯化总细菌RNA。将RNA样品经45 µm注射器滤膜过滤后，上样至1 mL二乙基乙醇胺（DEAE）柱。
   1. 用于色谱纯化时，使用液相色谱系统，流速为1 mL/min。上样前，用10 mL平衡缓冲液平衡色谱柱 mL 层析缓冲液（缓冲液成分见步骤 3.3）。
   2. 上样并用10倍柱体积的缓冲液洗涤柱子 mL 柱层析缓冲液。用 20 mL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.5，1 M NaCl，0.2 mM EDTA）并收集1 mL等份试样。
      注意：RNA 在最初的洗脱组分中会快速洗出。该层析柱可重复用于后续纯化。具体操作为，用 10 mL 水中，置于 4 °C、20% 乙醇中保存。
7. 由于大部分重组RNA在...中积累 E. coli 以环状形式存在时，可利用该特性实现纯化至均一状态¹²通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D PAGE）结合非变性与变性（8 M 尿素）条件，将环状RNA与其线性对应物分离^12,22.

4. RNA 分析

1. 在含有 8 M 尿素的 TBE 缓冲液（89 mM Tris，89 mM 硼酸，2 mM EDTA）中配制 5% 聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，质量比为 37.5:1）。
2. 将 20 µL RNA 样品与 1 体积（20 µL）上样缓冲液（98% 甲酰胺，10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA，0.0025% 溴酚蓝，0.0025% 二甲苯青）混合，在加热块中 95 °C 孵育 1.5 分钟，然后迅速在冰上冷却。
3. 将样品上样至聚丙烯酰胺凝胶中，根据凝胶尺寸在适当条件下进行电泳（例如，在 200 V 条件下运行 140 × 130 × 2 mm 凝胶 2.5 小时）。将凝胶在 0.5 µg/mL 溴化乙锭中染色 15 分钟，用水洗涤，然后在紫外光下观察 RNA。

结果

为了利用源自ELVd的系统在E. coli中生产重组RNA¹²，需将目标RNA插入ELVd RNA支架中。该嵌合RNA在E. coli中与茄子tRNA连接酶共表达。经过加工、切割并环化后，形成环状嵌合RNA，目标RNA由此突出，可能与共表达的茄子酶形成核糖核蛋白复合物，该酶在细菌细胞中可达到极高的浓度（图1）。因此，利用该系统生产重组RNA的第一步是将对应于目标RNA的cDNA插入ELVd cDNA的特定位置，即ELVd序列变体AJ536613中的T245-T246位点。质粒pLELVd-BZB在该位置含有一个带有两个BpiI识别位点的多克隆位点以及LacZ蓝/白筛选标记基因，可通过高效的Gibson组装方法²⁰实现插入。通过LacZ标记的蓝/白筛选，可方便地选择含有目标重组质粒的转化E. coli克隆。若双BpiI酶切不完全而未...

讨论

在研究茄子tRNA连接酶识别ELVd序列和结构要求的过程中，我们注意到，在非宿主E. coli中同时表达这两种分子会导致细菌细胞内意外大量积累类病毒环状形式¹⁹。我们认为，类病毒RNA在E. coli中的大量积累，很可能是由于共表达了某种高度稳定的RNA分子（例如相对较小（333 nt）、碱基配对程度高、呈环状的类病毒）以及一种对该特定类病毒具有高亲和力的蛋白质。ELVd RNA在感染植物体内复制时，必须招募宿主tRNA连接酶以介导其环化过程¹⁷。尽管我们尚无实验验证，但我们推测这两种分子在E. coli中形成了核糖核蛋白复合物，进一步稳定了类病毒RNA，使其浓度达到每升细菌培养物150 mg的显著水平，远超rRNA等内源性RNA的浓度¹²。由于ELVd在E. coli中不进行复制，我们推断插入外源RNA不会显著影响类病毒来源RNA的积累，事实也确实如此。这一观察结果构成了本文所描述的在E. coli中大量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	赛默飞世尔科技	F530S
Bpi 我	赛默飞世尔科技	ER1011
琼脂糖	Conda	8010	D1 低电渗流
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
乙酸	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
溴化乙锭	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒	Zymo Research	D4001
NanoDrop	赛默飞世尔科技	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA组装预混液	New England BioLabs	E2621S
DNA 纯化 &和浓缩器	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
大肠杆菌 DH5α	Invitrogen	18265-017
胰蛋白胨	Intron Biotechnology	Ba2014
酵母提取物	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
琼脂	Intron Biotechnology	25999
氨苄青霉素	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-二甲基甲酰胺	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin 质粒抽提试剂盒	Macherey-Nagel	22740588.250
大肠杆菌 BL21(DE3)	Novagen	69387-3
大肠杆菌 HT115(DE3)			参考文献：Timmons 等，2001
氯霉素	Duchefa	C 0113.0025
甘油	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
苯酚	Scharlau	FE04791000	90%
氯仿	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF 柱	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus 液相色谱系统	GE Healthcare Life Sciences	11001313
丙烯酰胺	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-甲叉双丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	M7279-100G
尿素	PanReac AppliChem	146392.1211
硼酸	PanReac AppliChem	A2940,1000
甲酰胺	PanReac AppliChem	A0937,2500
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B8026-5G
二甲苯青	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′双丙烯酰基胱胺	Sigma-Aldrich	A4929-5G