Summary
Aqui, apresentamos um modelo poderoso e fisiológico para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à secreção de hormônio do intestino e a absorção intestinal — intestino isolado perfundido de rato.
Abstract
A barriga é o maior órgão endócrino do organismo, produzindo mais de 15 diferentes peptídeo hormônios que regulam o apetite e alimentar a ingestão, digestão, absorção de nutrientes e distribuição e excursões de glicose pós-prandial. Compreender os mecanismos moleculares que regulam a secreção de hormônio do intestino é fundamental para compreender e traduzir a fisiologia de hormônio do intestino. Tradicionalmente, os mecanismos subjacentes a secreção de hormônio do intestino também são estudados in vivo (em animais ou seres humanos) ou usando primária secretoras de hormônio gut mucosal culturas de células ou linhas de células. Aqui, apresentamos um intestino de rato perfundido isolado como um método alternativo para estudar a secreção de hormônio do intestino. As virtudes deste modelo são que ele depende do intestino intacto, significando que recapitula a maioria dos parâmetros fisiologicamente importantes responsáveis para o secretion em estudos in vivo, incluindo polarização da mucosa, relacionamentos parácrina e rotas de exposição de perfusão/estímulo. Além disso e ao contrário de estudos in vivo, o intestino de rato perfundido isolado permite quase completo controle experimental e avaliação direta da secreção. Em contraste com os estudos in vitro, é possível estudar tanto a magnitude e a dinâmica de secreção e para responder a perguntas importantes, tais como estímulos que causam a secreção de hormônios do intestino diferentes, de que lado do intestino (luminal ou vascular) é a secreção estimulada e analisar em sensores moleculares de detalhe subjacentes a resposta secretora. Além disso, a preparação é um poderoso modelo para o estudo da absorção intestinal e detalhes sobre a dinâmica de absorção intestinal, incluindo os transportadores responsáveis.
Introduction
A barriga é o maior órgão endócrino do organismo, produzindo mais de 15 diferentes peptídeo hormônios que regulam a absorção de nutrientes e disposição de nutrientes, crescimento intestinal e modulam o apetite1. Hormônios do intestino são, portanto, envolvidos em muitos processos fisiológicos fundamentais, e compreender estes padrões de secreção e os detalhes moleculares que controlam a secreção de hormônios respectivos, portanto, é importante para nossa basic fisiológica entendimento e para abordar aspectos translacionais das acções de hormônio do intestino; Mas como se pode estudar os mecanismos de detecção moleculares subjacente a secreção de hormônio do intestino? Em geral, a secreção do hormônio pode ser estudada em organismos intactos (humanos ou animais experimentais), de preparações isoladas do intestino ou de culturas de células primárias de secretoras de hormônio de intestino ou imortalizado célula culturas2,3, 4 , 5 , 6. nosso modelo preferido é o intestino delgado isolado perfundido de rato, que é um modelo fisiologicamente relevante que permite a secreção de hormônios do intestino a ser estudado em detalhe, com resolução de tempo ideal (secreção taxas podem ser determinadas a qualquer momento, base para o segundo), e os resultados são provavelmente transferível para uma situação em que vivo7. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre como executar este procedimento, mas primeiro vamos discutir outros métodos para estudar a secreção do hormônio do intestino, incluindo as vantagens e limitações desses modelos, em comparação com o intestino isolado perfundido de rato.
Se deseja estabelecer se um determinado composto regula a secreção de certos hormônios do intestino, estudos em humanos são o objetivo final. Assim, se um composto mostra grandes efeitos sobre a secreção de um ou vários hormônios do intestino em roedores (vivo ou perfusions) ou de hormônio secretoras células (linhas de célula ou células primárias), este efeito é apenas relevante em medicina e fisiologia humana se pode confirmar em seres humanos. No entanto, existem limites claros para o tipo de estudos que podem ser executadas em seres humanos, e estudos in vivo em animais experimentais são, portanto, muitas vezes a segunda melhor opção para esses estudos. Camundongos e ratos são os animais experimentais utilizados mais frequentemente presumivelmente devido ao seu tamanho conveniente, baixo custo e a opção de alterar geneticamente os genes suspeitados de estarem envolvidos em questões específicas do estudo (por exemplo, tirar um determinado transportador ou receptor). Em geral, modelos in vivo beneficiam sendo fisiologicamente intacto, mas também tem várias limitações. O mais importante, o tamanho pequeno de roedores, sobretudo ratos, é um fator limitante, como a maioria dos ensaios para quantificação de hormônio do intestino exigem pelo menos 20 µ l de plasma (e muitas vezes muito mais), o que significa que pelo menos 100 µ l de sangue tem que ser retirados para tornar um duplicado quantificação. Portanto, só é possível obter muito poucas amostras correspondentes às amostras de base e uma ou duas amostras pós-estimulação (o volume de sangue total em um rato de 20 g é ~1.4 mL). Por conseguinte, respostas secretoras potenciais (por exemplo, rapidamente ou respostas tarde-ocorrendo), portanto, pode ser perdida.
No modelo de perfusão, esse problema é superado, como amostra de grande volumes são obtidos (taxa de fluxo: 7,5 mL/min) e os intervalos de coleção podem ser ajustados conforme necessário para garantir que as respostas rápidas e de curta duração não são perdidas (nós recolher amostras de cada min)7 . Outro problema com estudos in vivo em roedores é que a maioria dos hormônios do intestino são ainda mais rapidamente eliminado ou metabolizada do que em seres humanos8,9,10, que pode complicar a análise bioquímica subsequente. Por exemplo, nós mostramos que o GLP-1 é metabolizado em ratos num ritmo ainda mais rápido do que em seres humanos (onde T1/2 é 1-2 min11) e, mais importante, que envolve a clivagem de GLP-1 em camundongos, além de clivagem do N-terminal por Dipeptidil-peptidase-4 (DPP4) (que é a enzima degradante de GLP-1 principal nos seres humanos), ainda mais a clivagem por enzima endopeptidase neutra 24,1112. Por conseguinte, atuais ensaios comerciais para a quantificação de GLP-1, que também são baseados no isoform intacta de GLP-1 (7-36amide) ou a isoforma de DPP-4 clivada (39amide-9), vastamente subestimam a secreção de GLP-1 em camundongos e resultam em enganosa resultados 12. no intestino delgado isolado perfundido de rato, a maioria do metabolismo dos hormônios secretados é eliminada ou marcadamente reduzida, desde que mediada por plasma degradação é evitada, e extração de fígado/rim/pulmão/degradação é impedida porque ( perfusato é recolhido assim que sai do intestino).
Claro, uma visão importante pode ser gerada pelo uso de animais geneticamente modificados, por exemplo,, de sódio-glicose transporte-1 nocaute ratos13, mas requer uma avaliação detalhada dos sensores moleculares envolvidos na secreção muitas vezes consideração de múltiplos sites moleculares, variando de transportadores moleculares de canais iônicos e de diferentes receptores G-proteína-acoplados a proteínas intracelulares. Por exemplo, escolhemos a atividade de nove diferentes sítios moleculares quando desvendar os sensores moleculares responsáveis pela secreção de GLP-1 glicose estimulada7. Um inquérito semelhante não seria possível em vivo como alguns dos compostos usados inespecíficas ou efeitos nocivos/letais. Por exemplo, quando usando o intestino perfundido, foi possível avaliar o papel do metabolismo da glicose intra celular para a secreção de GLP-1 e Neurotensina, bloqueando a formação de ATP com 2-4-dinitrofenol7,14 , bem como o papel de canais de cálcio dependentes de voltagem para ácidos biliares estimularam a secreção de GLP-1, NT e PYY3. Com efeito, a tetrodotoxina de bloqueador de canal de sódio altamente tóxico pode ser aplicada com sucesso em estudos de perfusão. Finalmente, no modelo de perfusão, pode ser diretamente avaliado onde no intestino um determinado composto estimula a secreção de um determinado hormônio, como o investigador pode simplesmente escolher e preparar a região desejada para perfundir, e ao mesmo tempo pode ser investigado se um estímulo causa secreção pela ativação dos sensores moleculares do lado luminal ou vascular do intestino,3,15,16.
Os mecanismos secretoras subjacente secreção do hormônio do intestino também pode ser estudada por usam pedaços de tecido do intestino (incluindo tecido humano), hormônio de culturas primárias intestinal (geralmente a partir de ratos), imortalizados secretando linhas celulares (de mouse ou de origem humana), por instinto tecido montada na câmara de Ussing ou pelo organoids (ambos mais frequentemente de ratos)2,3,4,5,6,17,18. Comparado a perfusions intestinais, estudos sobre pedaços de intestino humano, culturas de células primárias e linhagens celulares são tecnicamente mais fáceis de realizar e são uma maneira mais rápida e barata de gerar dados, mas claro, o estudo de pedaços de intestino requer acesso ao intestino humano fresco espécimes. No entanto, nestes modelos a polarização celular normal do intestino é inerentemente perdida, significando que estes modelos não podem ser usados para avaliar a ativação normal de sensores moleculares, e processos de absorção também não podem ser estudados. Além disso, esses estudos geralmente empregam a incubação do estática (para até vários h) que é altamente não-fisiológico e não tem nada a ver com a dinâmica de secreção normal das células, porque o produto secretado não é removido e assim gabarito pode influenciar o secreção de hormônios. Em contraste, no intestino perfundido, segregadas e absorvidas moléculas são eficientemente removidas pela microcirculação da mucosa como eles são em vivo, assegura a manutenção do Transmucoso gradientes para que absorção e secreção podem ocorrer a um ritmo normal. Além disso, culturas de células podem ter dedifferentiated de sua origem de células enteroendócrina nativo, significa que eles não são mais representante das células nativas em termos de conteúdo do peptide e expressão de sensores moleculares, embora eles ainda podem secretam o hormônio em questão. Isto é, por exemplo, o caso de GLP-1 linhas de célula segrega19.
É, portanto, nossa opinião de que as culturas de células primárias ou célula linha estudos são mais adequados para fins de triagem e para a realização de experiências de tipos que não podem ser realizados no vivo ou no intestino isolado perfundido. Por exemplo, uma verdadeira força das culturas de células primárias e culturas de linha celular é aquela secundária intra celular mensageiros (por exemplo, Ca2 +, acampamento, NAD(P)H) pode ser monitorado em tempo real, e sinalização eléctrica do hormônio secretoras células pode ser investigado de21,20,22. Além disso, siRNA nocaute pode ser feito, que é particularmente útil se inibidores específicos não estão disponíveis20,21,22,23,24. Tecido do intestino de ratos montado na câmara de Ussing recentemente tem sido usado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a secreção de ácidos biliares GLP-1 estimulada, enquanto organoids intestinal (de ratos) e pedaços de intestino humano também têm sido usados para estudar o detalhes moleculares do intestino a secreção de hormônio17,25. Considerando que os antigos benefícios de ser polarizado2 todos estes modelos envolvem incubação do estática. Estudos sobre pedaços de intestino humano, no entanto, beneficiam de tecido humano, ao invés de roedores, o que é importante, desde que a diferença de espécie na expressão tecidual dos receptores 7TM e transportadores moleculares podem resultar em diferentes caminhos de detecção moleculares entre espécies. Na verdade, a maioria dos dados nesse campo tem sido gerados por estudos em porcos, ratos ou ratos, e continua a ser evasivo se estes resultados podem ser transferidos para os seres humanos. É, no entanto, tranquilizando que os mecanismos de detecção moleculares subjacentes a glicose-estimulou a secreção de GLP-1 parecem ser semelhantes entre o rato, o rato, o homem, e transcriptomic e peptidomic de criação de perfil de rato e L-células humanas revelaram forte global semelhanças entre as duas espécies7,18,26,27.
O intestino de rato perfundido isolado, no entanto, também tem algumas limitações que devem ser consideradas. Mais importante, é impossível determinar se uma dada resposta secretora resulta da ativação direta pela substância das células produtoras de hormônio alvo ou melhor é causada por um mecanismo indireto. Por exemplo, KCl instantaneamente aumenta a secreção de GLP-1 do intestino perfundidos7, mas continua a ser desconhecido se isto é uma consequência da despolarização direta da L-célula ou resulta da despolarização de neurônios perto do L-células ou efeitos de lançado simultaneamente parácrina estimuladores/inibidores. Dados provenientes de estudos utilizando o intestino perfundido que visam elucidar os mecanismos moleculares subjacentes secreção devem, portanto, sempre ser colocados no contexto com dados obtidos de outros modelos mais específicos para aumentar a capacidade de estabelecer nexo de causalidade. Por exemplo, secreção de GLP-1 glicose-estimulada da linha celular secretando GLUTag28,29 de GLP-1 e do mouse principal L-células dependem da atividade dos transportadores de glicose (SGLT1 e GLUT2). Bloquear esses transportadores no intestino pequeno rato perfundido também atenua a secreção20, significa que é provável que glicose-estimulou a secreção de GLP-1 é em grande parte mediada por ações diretas de glicose na célula-L. Uma outra limitação importante do intestino isolado perfundido é que alguns dos lipídeos são difíceis de estudar devido a sua hidrofobicidade. Embora seja possível investigar os produtos finais da digestão de lipídios (ácidos graxos, diacil glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) e, embora a preparação pode ser capaz de re-esterificar os lipídios intra celularmente e talvez embalá-los em quilomícrons, o transporte dos quilomícrons fora das células e sua subsequente penetração pelos lacteals das vilosidades é interrompida, desde que o fluxo de linfa no intestino isolado não pode ser garantido. O mais provável, portanto, absorção de lipídios é interrompida quando os produtos absorvidos começam a acumular-se nas células. Os sistemas de células in vitro são ainda menos adequados para estudos de lipídios por causa de sua falta de polarização. Obviamente, esta limitação só é relevante para lipídios que são absorvidos e transportados através do lacteals, Considerando que aquelas absorveram através dos vasos sanguíneos intestinais são susceptível de ser tratado normalmente.
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Protocol
Todos os estudos foram realizados com a permissão da Inspetoria de experimentos de Animal dinamarquês (2013-15-2934-00833) e o Comitê de ético local, em conformidade com as diretrizes da legislação dinamarquesa que regem a experimentação animal (1987) e o nacional Institutos de saúde (publicação n º 85-23).
1. animais
- Obter ratos machos Wistar (250g) e casa 2 por gaiola, com acesso ad libitum chow padrão e água e manter-se em um 12:12 h ciclo claro-escuro. Nossas instalações de animais utiliza água não tratada e Alrtromin roedor chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Dinamarca).
Nota: Permitir que os animais pelo menos uma semana de aclimatação.
2. pré-operatório preparações
- Fazer reserva de perfusão: tampão de bicarbonato Krebs-Ringer suplementado com 0,1% BSA (fração V), fumarato de T-70, 3,5 mmol/L glicose e piruvato 5 mmol/L, 5% de dextran e glutamato (se necessário); pH 7,4.
- Prepare uma quantidade adequada de buffer de perfusão por filtragem através de um tamanho adequado do filtro e ajustar o pH a ~7.5 por adição gota a gota de 5 M de HCl.
- Adicione 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) (se necessário) diretamente para o buffer no dia do estudo para uma concentração final de 10 µM.
Nota: IBMX é um inibidor da fosfodiesterase que aumenta [campo]eu e, assim, restaura a sensibilidade e a capacidade de resposta do intestino em termos de secreção de hormônios a um estímulo de secreção. - Prepare soluções de teste. Prepare-se estímulos vasculares em uma concentração mais elevada do que a concentração final desejada no buffer de perfusão filtrada e pH ajustado de 20x. Prepare teste luminal estímulos em solução salina isotônica na concentração final.
- Dissolver compostos não prontamente solúveis em 100% dimetilsulfóxido (DMSO) e diluir ainda mais em buffer de perfusão ou solução salina isotônica. Para estímulos vasculares, manter a concentração final de DMSO em 1% ou abaixo, como concentrações acima isto danificar o intestino e pode levar à secreção de hormônio do intestino inespecíficos. Medir o pH e ajuste para ~7.5, se necessário.
3. operação e perfusão
Nota: Uma ilustração de uma instalação de perfusão é fornecida na Figura 1.
- Anestesiar os ratos pelo uso de um regime anestésico que pode sustentar cirúrgica anestesia e analgesia para 30-40 min de Hypnorm/Midazolam (0,3 ml/100 g de massa corporal, por ml: Hypnorm: fentanil 0,08 mg, 2,5 mg fluanisone, 0,45 mg de metil Parahydroxybenzoate, 0,05 mg Parahydroxybenzoate de propila, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Dinamarca)
- Verificar por falta de reflexos (pitada de dedo do pé), coloque o rato na mesa de operação aquecida e realizar uma incisão da pele para expor o intestino.
-
Expor a parte terminal do cólon, deslocando o intestino à parte, tanto quanto possível. Gravata de fornecendo vascularização para o cólon e o imposto especial de consumo-gradualmente a partir da parte terminal do cólon, se movendo em direção ao intestino.
- Se apenas uma determinada parte do intestino delgado é necessária para perfusão (metade superior), impostos especiais de consumo segmentos não é necessário depois de amarrar fora fornecendo vascularização. Para minimizar o dano tecidual, hidratar o intestino com solução salina isotônica e usar cotonetes para remover o tecido conjuntivo.
- Inserir um tubo de plástico (comprimento: ~ 15 cm, diâmetro externo: ~0.4 cm) para o lúmen intestinal (na parte proximal) e gravata corretamente usando suturas. Lave cuidadosamente com solução salina isotônica (temperatura ambiente) para esvaziar o lúmen do quimo.
- Perfundir o lúmen com solução salina isotônica em um fluxo de 0,25 mL/min, utilizando uma seringa de 10 mL, ligada a uma bomba de seringa.
- Afaste-se do intestino para a artéria mesentérica superior é acessível e remover o tecido conjuntivo e gordo, para expor a artéria.
- Colocar duas suturas sob a artéria mesentérica usando pinças de ponta fina; uma das suturas é para o levantamento da artéria para controle do sangramento, uma vez que a artéria foi cortada e o outro é para fixar o cateter que será colocado na artéria. Tome cuidado para não perfurar a artéria.
- Coloque duas suturas sob a veia porta para fixar o cateter de metal que vai ser colocado na veia para coleta de efluentes de perfusão.
- Antes de cortar o buraco na artéria mesentérica, certifique-se de que o cateter que vai até inserido na artéria é preenchido com buffer de perfusão para evitar a formação de êmbolo de ar.
- Um pequeno buraco na artéria mesentérica, usando um par de tesouras cirúrgicas e inserir o cateter plástico imediatamente após.
- Imediatamente depois que o cateter foi assegurado, iniciar perfusão do intestino, iniciando a bomba de roletes (taxa de fluxo = 7,5 mL/min).
- Confirme que os vasos sanguíneos no intestino empalidecer dentro de poucos segundos, e a veia porta gira pálida.
- Imediatamente após a perfusão adequada foi estabelecida, abrir um buraco na veia portal, introduza o cateter metal e fixe-a com a sutura.
Nota: O cateter pode ser difícil de lugar mas levantando a veia puxando cautelosamente o ajuda de sutura mais proximal. - Uma vez que os cateteres estão no lugar e a saída de perfusão é satisfatória, mate o rato por perfuração de diafragma, tomando cuidado para não rasgar os cateteres.
- Coletar a saída de perfusão por 1 min e medir o volume. Comece as pressão de perfusão aquisição/gravações clique Executar o experimento no programa de gravação de pressão.
- Cobrir a barriga com tecido umedecido para evitar que sequem durante o experimento.
- Certifique-se de que a extremidade distal do intestino não está bloqueada para que o efluente luminal pode sair, caso contrário, o intestino vai inchar, irá desenvolver o edema, irá aumentar a pressão de perfusão e saída de perfusão vai cair.
- Deixe a preparação para cerca de 30 min antes de iniciar o experimento.
Nota: As saídas secretoras de hormônios do intestino são muito instáveis para o primeiro 15 min de perfusão, assim que esta etapa de equilíbrio é necessário para ter uma base firme.
4. o experimento
- Após cerca de 30 min de perfusão, começa o experimento através da recolha a primeira amostra da linha de base usando um coletor de fração. Coletar as amostras no intervalo de tempo desejado (por exemplo, cada minuto, 6,5-7,5 mL geralmente é coletado) e colocá-los no gelo dentro de poucos minutos.
-
Inspecionar o borbulhador regularmente e, se esvaziou, encha-o com buffer de perfusão.
- Recolha a reserva através da galo-válvula de três vias imediatamente antes da sua entrada no órgão e do cateter inserido na veia porta (depois que ele tem sido perfundido através do órgão) para confirmar que o órgão é metabolicamente ativo. Colete amostras no início e no final do experimento para avaliar a viabilidade durante todo o experimento.
- Medir as amostras rapidamente, com um analisador automatizado de sangue-gás, contém mais plásticas/seringas não são completamente herméticas, dando origem a troca com o ar atmosférico.
- Após 10-15 min de coleção de linha de base, estimule-se com a primeira substância. Administrar estimulações intra-arterial com uma bomba de seringa através de uma torneira de três vias (fluxo = 0,350 mL/min).
- Realizar estimulações luminal por uma injeção de bólus inicial (2,5 mL/min durante o primeiro 5 min), para substituir a solução salina isotônica que já está no lúmen, seguido pela administração da solução de teste de uma baixa taxa de fluxo (0,5 mL/min).
- Para garantir que o lúmen é rapidamente esvaziado da substância, uma vez que o período de estimulação luminal, irrigue o lúmen intestinal com solução salina isotônica, aplicando taxas de fluxo mesmo que acima.
- Colete amostras de base por 15-30 min antes que a próxima substância é administrada. Dependendo do protocolo, 2-3 teste estímulos geralmente podem ser incluídos por experiência. Se o protocolo experimental inclui ativação/inibição de um determinado site molecular simultaneamente com a administração de um determinado secretagogue, sempre pre-estimular com o inibidor de ativador/10-15 min antes da administração da secretagogue para Certifique-se de que o site molecular é inibido no início da infusão de secretagogue.
- No final do protocolo, administre (5-10 min) um controlo positivo apropriado para testar a capacidade de resposta da preparação e coletar amostras de linha de base de 10-15 min após o período de estimulação.
Nota: Vários teste de substâncias podem ser usadas como controle positivo, por exemplo, estímulos para a crescente [campo]eu (por exemplo, foskolin ou IBMX), [Ca2 +]eu (por exemplo, Bombesina ou Neuromedina C), despolarizar agentes (por exemplo,, 30-50 mM KCl) ou mais fisiologicamente relevantes estímulos como macronutrientes: glicose, aminoácidos, peptonas, etc. No entanto, a escolha do controlo positivo depende do resultado experimental. Glicose por exemplo é um secretagogue pobre colecistoquinina (CCK), enquanto que internalizadas não é um robusto secretagogue para insulinotrópica da glicose-dependente de secreção de peptídeo (GIP)30. - Após o final do experimento, excisar o intestino perfundido, pesar e medir seu comprimento. Colocá-lo em paraformaldeído e armazená-lo (4 ° C) para potencial mais tarde histochemical análise de integridade/danos nos tecidos, por exemplo pela H & E mancha.
5. bioquímicas medições
- Quantificar as concentrações de peptídeos secretados no efluente venoso pelo uso de um radioimunoanálises interno ou comercialmente disponíveis (RIA) ou ensaios de ELISA. Para estudos que investigam a absorção intestinal, quantificar a molécula de interesse, por exemplo,, glicose ou aminoácidos, no efluente venoso.
Nota: O perfusato é geralmente um bom amortecedor basal para a maioria das análises, incluindo ensaios que se baseia em reações enzimáticas (tais como a quantificação da glicose pelo método glucoseoxidase).
6. análise de dados
- Apresentar dados de diferentes maneiras, por exemplo como um gráfico de concentração-tempo mostrando a saída real secretora (fluxo x concentração) e como enredo de coluna mostrando o total secretora de saída durante os períodos de base e resposta (geralmente pontos de tempo de 10-15).
- Traça a concentração medida real dos respectivos hormônios como unidades de concentração. (pmol/L),
Nota: É preferível, em vez disso, expressar dados como saída (fmol/min), porque com este modelo, em contraste com os estudos in vivo, os valores obtidos são a saída real secretora (devido a constante coleta de efluentes de perfusão). - Dependendo do número de grupos a serem analisados estatisticamente, uso bicaudal pareado t-teste (dois grupos) ou One-Way ANOVA para medidas repetidas (mais de dois grupos) seguido por um teste post-hoc adequadas para comparações múltiplas.
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Representative Results
A capacidade de determinar se um determinado estímulo faz com que a secreção do hormônio do intestino de interesse se baseia em uma secreção constante da linha de base. Além disso, se não há resposta ao estímulo é observada, uma resposta secretória robusta para o controlo positivo deve ser evidente para excluir que a falta de resposta ao estímulo do teste não reflete uma falta geral de responsividade. Figura 2A e 2B mostra um exemplo de dados de boa qualidade; Secreção de GLP-1 do intestino de rato perfundido isoladas são mostradas em intervalos de 1 min (± significa SEM). Em condições basais a secreção é constante; antes e após a administração do teste de estímulo (insulina) e uma resposta secretória robusta para o positivo controle (internalizadas (BBS)) é evidente. Além disso, a média de secreção de GLP-1, em condições basais (durante os períodos respectivos de base anterior insulina ou administração de BBS) bem como a secreção em média durante a insulina e estimulação BBS são mostrados como gráficos de barras (meios ± SEM). Secreção foi testada para a significância estatística por One-Way ANOVA para medidas repetidas. Baseado nestes dados combinados, pode concluir-se que insulina intra-arterial não estimula a secreção de GLP-1 do intestino isolado perfundido de rato.
Figura 2 e 2D mostra um exemplo de secreção de GLP-1 do intestino isolado perfundido de rato. Ao contrário da Figura 2A e 2B, estes dados são de má qualidade; a secreção é instável em condições basais e flutua para cima ao longo de uma forma que parece não estar relacionado para testar as administrações de substância (intra-luminal e intra-arterial frutose, respectivamente) e o controle positivo, BBS, não resulta em estatística significativa aumento da secreção de GLP-1. É, portanto, impossível concluir se as estimulações frutose dão origem a secreção de GLP-1, por exemplo, é a secreção de GLP-1 aumentada no final da estimulação vascular frutose uma resposta mediada por frutose ou não.
Figura 1: exemplo de uma configuração de perfusão. O sistema consiste de um posto de plexiglass, uma mesa de operação aquecida, um trocador de calor com compilação no borbulhador, um calibre de pressão e a bomba de eixo para a regulação da pressão de perfusão. O sistema de perfusão é conectado a um circulador termostático que aquece o intoxicado (95% O2, 5% CO2) reserva de perfusão para 37 ° C. Além disso, pressão de perfusão é gravada continuamente e transformado pelo transdutor de pressão de gravação e visualizado e salvos em um PC com software adequado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dados do intestino isolado perfundido de rato. (A, B) um exemplo de um bem realizados experimentos e dados fiáveis, (C, D) um exemplo de dados abaixo do ideal, onde o aumento da pressão de perfusão, e saída de perfusão diminuiu drasticamente ao longo do tempo do estudo. (A) saída de GLP-1 (total) (fmol/min) é mostrada em condições basais e em resposta à administração de insulina intra-arterial (pM 200 e 1.000, como indicado). Bombesina (BBS), um conhecido, potente secretagogue de GLP-1, foi infundida intra arterially no final do experimento de controle para resposta (controle de POS). Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O intestino delgado isolado perfundido de rato é uma ferramenta poderosa da pesquisa que permite a dinâmica e os mecanismos moleculares subjacentes a secreção de hormônio do intestino a ser estudado em detalhe. O passo mais crítico para o sucesso da produção de dados com este modelo é a operação cirúrgica. Manipulação do intestino irá inevitavelmente causar algum dano para o intestino e, portanto, deve ser mantida a um absoluto mínima. Ainda mais importante, a velocidade de operação é chave, particularmente no que se refere o tempo para a colocação do cateter na artéria mesentérica. Nossa experiência é que o cateter deve ser colocado com êxito, e a perfusão deve ser iniciada dentro de um par de min depois de ter cortado o orifício no vaso. A colocação de cateteres da é a parte mais desafiadora da operação é complicada pelo pequeno tamanho da artéria mesentérica e a parede fina da veia portal e esta etapa exige alguma prática. Rápida inserção do cateter venoso é, no entanto, não tão urgente como o caso da artéria mesentérica, como o intestino está agora sendo perfundidos e manteve vivo. O próximo passo crítico é realizar o experimento. Se a operação foi executada com êxito, o intestino perfundido normalmente prosperarão e ser ágil para até 3 h e pressão de perfusão e saída normalmente permanecerá constante ao longo de todo o experimento. O fator mais importante para uma experiência bem sucedida nesta fase é evitar bolhas, entrando o sistema, já que isso faz com que a embolização de ar que instantaneamente reduz ou elimina a saída de perfusão. Como a reserva de perfusão contém BSA e é de gás para garantir a entrega de oxigênio suficiente para o intestino perfundido, é difícil evitar a formação de bolhas inteiramente. Bolhas devem, contudo, ser preso na armadilha da bolha dos sistemas, mas este esvazia gradualmente ao longo do tempo (mais bolhas, o esvaziamento mais rápido) e, portanto, é importante manter um olho sobre o borbulhador e encha-o com buffer de perfusão quando necessário. Também é importante manter o pH de perfusato abaixo de 7,5 — para aumentar o pH, podem formar precipitados de carbonato de cálcio, obstruindo o fluxo capilar e causando um grave aumento da pressão de perfusão.
O intestino perfundido é uma preparação bastante robusta, mas não tolera altas concentrações de detergentes, tais como ácidos biliares, etanol e DMSO. Portanto, o uso de detergentes de preferência deve ser evitado, mas às vezes é necessário para obter compostos pouco solúveis em solução. O intestino perfundido geralmente tolera detergentes administrados intra-luminally melhor que intra-vascularly. Por exemplo, administração de ácido de taurodeoxycholic de 1 mM (um ácido biliar secundário, conjugado) era tolerada bem quando infundido intraluminally mas instantaneamente resultou na perfusão bloqueada saída quando entregues intra-arterially2. Para estimulação vascular, manter a concentração final de DMSO abaixo de 1% para evitar inespecíficas respostas secretoras (DMSO estimula, por exemplo, a secreção de GLP-1) e para evitar causar danos aos tecidos, resultando em pressão de perfusão de aumento e diminuição da perfusão saída. As experiências devem ser desconsideradas se a saída de perfusão diminui em mais de 20% ao longo do estudo, se a pressão de perfusão aumenta mais de 20% ou se o edema se desenvolve. Aderência a estes critérios macroscópicos de sucesso (incluindo rápida inserção do cateter na artéria mesentérica) geralmente resulta em boa qualidade em experimentos de ~14/15.
Depois de completar a experiência, o próximo procedimento crítico é escolher o método apropriado e ensaio para quantificação da hormone(s) de interesse. Alta através de Coloque-análise de hormônios peptídicos pode ser realizado usando os imunoensaios: radioimunoensaio ou ELISA. De qualquer forma, é altamente recomendável para validar os respectivos ensaios antes de usá-los para quantificação da amostra, como nem todos os ensaios disponíveis comercialmente desempenho satisfatório no que diz respeito a sensibilidade, especificidade e precisão (para exemplos a respeito GLP-131). Com relação a especificidade, a reactividade cruzada é, como sempre, uma preocupação. Efeitos de interferência e matriz inespecíficos são geralmente menos pronunciados com perfusates artificial em relação ao plasma. Com relação à sensibilidade, muitas vezes é muito mais fácil de obter dados fiáveis de perfusions do que de estudos em vivo como o peptídeo concentrações muitas vezes são mais elevadas porque o efluente de perfusão não é diluído na circulação sistêmica e porque processos de eliminação (pelo fígado/pulmão/rim) são evitados. Normalmente, as concentrações de linha de base nos efluentes venosos situar-se no menor intervalo de trabalho da maioria dos ensaios (em caso de GLP-1 (total), Neurotensina (total) e PYY (total): 8-15 pmol/L) enquanto respostas estimuladas podem chegar tão alto quanto 200-300 pmol/L3.
Em comparação, valores de linha de base dos mesmos hormônios no plasma de humanos saudáveis, ratos ou camundongos são normalmente e 5-10 pmol/L Considerando que valores de resposta são 15-30 pmol/L3,32.
Se os critérios de sucesso predefinidos são seguidos, os dados de perfusão gerado geralmente são de boa qualidade e a análise estatística então é simples. Comparado a secreção de insulina, glucagon e somatostatina do isolado perfundido de rato ou pâncreas de rato, a secreção basal de hormônios do intestino é estável e bastante semelhante entre as experiências em matéria de concentrações medidas, e a secreção não é claramente pulsátil. Coletivamente, a variação no conjunto de dados, portanto, é mínima e um tamanho de amostra tão baixo quanto três experimentos de perfusão é muitas vezes suficiente para atingir significância estatística. No entanto, para padronizar e evitar erros-tipo-2, bem como para reduzir a possibilidade de vista para menos respostas bem pronunciadas, é recomendado um tamanho de amostra de seis a oito.
Em resumo, o intestino de rato perfundido isolado é um modelo importante, fisiologicamente relevante, experimental que pode ser usado para investigar os efeitos directos de uma dada substância na secreção de hormônio do intestino. Importantes questões fundamentais, tais como onde no intestino uma secretagogue estimula a secreção, se estimula a secreção através da ativação de luminally ou basolaterally localizado sensores, e quais sensores moleculares são registrados e, portanto, responsável por a secreção pode ser dirigida em detalhe com este modelo. Deve, no entanto, ser reconhecido que o desacoplamento do intestino do animal dador, para algumas questões de estudo, seja de relevância. Por exemplo, o intestino interage intimamente com o fígado (o eixo do intestino-fígado) e do cérebro (o eixo do intestino-cérebro), e mecanismos que dependem da Cruz-fala-se, portanto, não podem ser investigados com este modelo. A qualidade da operação é o fator crítico para a qualidade dos dados e os fatores mais importantes para uma operação bem sucedida são para manter manipulação do intestino ao mínimo e rapidamente iniciar perfusão do intestino uma vez cortou a artéria mesentérica. É nossa experiência que demora de 2 a 4 meses de prática antes de dados de boa qualidade são produzidos. No entanto, uma vez que a técnica foi aprendida, as possibilidades desse método são quase infinito e apenas limitado pela solubilidade de substâncias o teste e qualquer potencial prejudiciais efeitos as substâncias de ensaio podem ter sobre os tecidos perfundidos.
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Disclosures
Os autores deste trabalho declaram não potenciais conflitos de interesse relevantes para este artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma concessão irrestrita para Prof Jens Juul Holst do Novo Nordisk centro de pesquisa metabólica básica (Novo Nordisk Foundation, Dinamarca), uma concessão separada da Novo Nordisk Foundation para fazer estudos de perfusão roedores (conceder n. NNF15OC0016574), uma subvenção ao Prof Holst desde o Conselho Europeu de investigação (Grant no.695069) e a União Europeia é sétimo programa-quadro de investigação, TechnologicalDevelopment e actividades de demonstração (Grant no. 266408), bem como um pós-doutorado conceda a Rune E. Kuhre da Fundação Lundbeck (3492-R264-2017). Agradecemos a Jenna E. Hunt e Carolyn F. Deacon para revisão cuidadosa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
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