Summary
Nous présentons ici un protocole visant à construire un modèle d’un épanchement pleural chez le rat par instillation intratrachéale de polyacrylate/nanosilice.
Abstract
Épanchement pleural est une constatation clinique répandue de nombreuses maladies pulmonaires. Avoir un modèle utile d’épanchement pleural animaux est très important d’étudier ces maladies pulmonaires. Les modèles précédents d’un épanchement pleural plus d’attention aux facteurs biologiques plutôt que des nanoparticules dans l’environnement. Ici, nous présentons un modèle pour faire un épanchement pleural par instillation intratrachéale de polyacrylate/nanosilice chez les rats et une méthode d’isolement de nanoparticules dans l’épanchement pleural. Par instillation intratrachéale de polyacrylate/nanosilice avec des concentrations de 3,125, 6,25 et 12,5 mg/kg∙mL, l’épanchement pleural chez les rats présentés le jour 3, a culminé à jours 7 à 10 groupes de 6,25 et 12,5 mg/kg∙mL, puis lentement diminué et disparu le jour 14. Lorsque la concentration de polyacrylate/nanosilice augmente, l’épanchement pleural est plus produite et plus rapide. Ce liquide pleural a été détecté par l’examen échographique ou poitrine CT scanner et confirmé par la dissection de rats. Nanoparticules de silice ont été observés dans un épanchement pleural rats par microscope électronique à transmission. Ces résultats ont montré que l’exposition aux polyacrylate/nanosilice conduit à l’induction d’un épanchement pleural, qui concorde avec notre précédent rapport chez l’homme. En outre, ce modèle est bénéfique pour une étude plus approfondie de la nanotoxicologie et les maladies de l’épanchement pleural.
Introduction
Épanchement pleural est une manifestation clinique très commune de maladies pulmonaires avec une variété de causes. Avoir un modèle utile d’épanchement pleural animaux est très important d’étudier ces maladies pulmonaires, les rôles des deux couches de membrane pleurale, les mécanismes de l’épanchement pleural et son traitement. Toutefois, certains rapporté modèles épanchement pleural portent principalement sur l’épanchement pleural malin ou facteurs biologiques plutôt que les nanoparticules dans l’environnement1,2. Ici, nous présentons un nouveau modèle d’un épanchement pleural qui est simple, sûr et efficace.
Avec le développement de la nanotechnologie et l’utilisation extensive des nanoproduits, il y a une inquiétude sur les risques potentiels des nanomatériaux pour l’environnement et la santé humaine3,4. Nanomatériaux, introduire des facteurs de risque et susceptibles d’entraîner de nouveaux dangers en milieu de travail ou par le biais de contamination de l’environnement. Des études in vitro et in vivo montrent que les nanomatériaux peut donner lieu à plusieurs organes pour les poumons, le cœur, le foie, les reins et le système nerveux, ainsi que la reproduction et le système immunitaires5,6. En outre, certaines études ont indiqué que la toxicité spécifique des nanomatériaux était en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques3,4,7.
Nous avons rapporté qu’un groupe de travailleurs bénéficiant d’une orientation professionnelle aux nanomatériaux présentée cliniquement épanchement pleural et péricardique, fibrose pulmonaire et granulome8,9. Nanoparticules de silice ont été isolés dans ces patients un épanchement pleural9. Afin de reproduire et vérifier l’épanchement pleural induite par les nanoparticules inhalées chez les humains, nous avons mené l’expérience en instillant le polyacrylate/nanosilice (PA/NPSi) via les voies respiratoires chez le rat, qui a imité la respiration humaine dans un véritable environnement et trouvé que par voie intratrachéale instillation de PA/NPSi pourrait entraîner un épanchement pleural chez les rats. Nous présentons ici, comment faire un épanchement pleural chez le rat par instillation intratrachéale de PA/NPSi et comment isoler des nanoparticules dans l’épanchement pleural. Ce modèle peut être utile pour une étude plus approfondie de la nanotoxicologie et maladies de l’épanchement pleural.
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Protocol
L’étude de suivi des lignes directrices du Capital Medical University (Beijing, Chine P.R) pour le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation. Toutes les procédures ont été approuvées par l’Animal éthique Comité de Capital Medical University en Chine.
1. experimental préparations
NOTE : Acclimater les femelles rats Wistar exempts de micro-organismes pathogènes spécifiques (poids : 200 ± 10 g) aux environnements expérimentaux pendant une semaine avant l’administration (conditions environnementales : lumière / obscurité : 12h / 12h, température de 22 ± 2 ° C, humidité 50 ± 10 %).
- Utilisez un frais 10 mL de suspensions PA/NPSi (nanosilice Ø:20 ± 5 nm par polymérisation en émulsion in situ) dilué dans du sérum physiologique à des concentrations de 3,125 6,25 et 12,5 mg/mL, respectivement10. Avant administration, laisser agir les suspensions pendant 20-30 min puis vortexer pendant 10 min afin de prévenir l’agrégation des nanoparticules.
- Tout aussi diviser un total de 20 rats en quatre groupes : un groupe pour chaque concentration de PA/NPSi (0, 3,125, 6,25 et 12,5 mg/mL).
- Pour anesthésier les, placez les rats dans un récipient fermé avec 1,5 mL d’éther (99,5 %) ou tout autre protocole IACUC approuvé. Après 60-90 s de l’anesthésie, vérifier l’absence de réponse à la pédale réflexe. Veiller à ce que les rats respirent.
- Mettre le rat anesthésié au Conseil d’administration et fixer ses dents de devant avec une ligne stérilisée de nylon sur la carte aussi.
- Ouvrir la bouche et exposer sa fissure de glotte à l’aide d’une pince chirurgicale et la lentille frontale.
- Inculquer les rats avec 0,5 mL de suspension de la PA/NPSi au poumon de chaque rat pour un total de 1 mL à l’aide d’un fin tube avec une aiguille stérilisée émoussée dans la bronche bilatérale.
- Placez les rats sur une planche en plastique dans une position couchée et de laisser que les rats récupérer lentement en 5-10 min.
2. une échographie pour épanchement pleural
- Utiliser un système d’échographie avec un transducteur linéaire (fréquence : 8 MHz) pour examiner les rats sur 1, 3, 7 et 14 jours,10.
- Donner l’anesthésie (10 % d’hydrate de chloral, 0,35 mL/100 g, i.p.) aux rats et vérifier l’absence de réflexes pédales.
- Enlever les poils de l’abdomen à l’aide d’un rasoir électrique de la poitrine et le haut des rats. Placez ensuite le rat sur une plaque de montage en position couchée.
- Couvrir la peau avec le gel de l’enduit et ensuite placer le capteur sur l’espace intercostal et espace sous-costal pour détecter le liquide pleural.
Remarque : Afin de détecter avec précision l’effusion, les positions latérales droite et la gauche ont été choisies pour effectuer une échographie. - Mettre le rat sur une planche en plastique dans une position couchée après échographie et laissez que les rats récupérer lentement en 10 min.
3. poitrine Tomodensitométrie pour épanchement pleural
- Sur l’administration après des jours 7 et 14, anesthésier les rats avec 10 % d’hydrate de chloral (i.p). Considérez-le comme une profondeur suffisante de l’anesthésie quand le rat ne réagit pas à la pédale réflexes.
Remarque : Après l’administration jour 7 est le moment le plus approprié d’observer un épanchement pleural par tomodensitométrie. - Placez le rat sur une feuille de plastique dans une position couchée et puis analyser sa poitrine afin d’étudier un épanchement pleural en utilisant un 64 voies CT. Use les paramètres suivants : configuration de détecteur 64 x 0,625 mm, 120 kV (valeur crête) et 350 mAs.
4. la collecte d’isolation des nanoparticules dans l’épanchement pleural et épanchement pleural
- Après poitrine Tomodensitométrie des rats et sous anesthésie d’hydrate de chloral, vérifier le réflexe de pédale des rats, se raser les poils de l’abdomen à la poitrine et puis désinfecter la peau par l’iode.
- Amener les rats à la zone chirurgicale.
- Sous anesthésie, rapidement couper 1 à 1,5 cm de la peau et les muscles abdominaux à la xiphoïde le long de la ligne médiane avec la membrane intacte.
- Ouvrir la poitrine et inspecter les cavités pleurales bilatérales avec l’aide de la pince à épiler, surtout les angles phréniques costales bilatérales. Collecter 1 à 2 mL de l’épanchement pleural jaune clair avec une seringue stérile de 2 mL.
- Une fois fait, sacrifier les rats avec protocole IACUC approuvé.
- Centrifuger l’épanchement pleural dans un tube de 2 mL à 300 x g pendant 15 minutes afin d’isoler les nanoparticules.
- Utiliser une goutte de la couche supérieure qui est le liquide lumineux et d’observer sous un microscope(TEM,) électronique de transmission à une tension d’accélération de 60 à 80 kV.
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Representative Results
À l’aide d’une échographie thoracique, nous avons trouvé aucun des épanchements pleuraux jour 1 dans tous les groupes. Cependant, le jour 3, l’épanchement pleural est apparu dans les 6,25 et 12,5 mg/kg∙mL. L’épanchement était principalement dans l’angle phrénique droit costal, tandis que l’épanchement péricardique seulement présenté à 12,5 mg/kg∙mL groupe. En outre, le jour 7, tant un épanchement pleural (Video 1) et épanchement péricardique (Video 2) ont été détectés 6,25 mg/kg∙mL groupe (Figure 1). Épanchement pleural augmente lentement dans la mesure du jours 7 à 10 et ensuite diminue progressivement. Le jour 14, aucun épanchement pleural a été retrouvé plus mais avec le signe de l’adhérence de la plèvre dans tous les groupes. 10
7 et 14 jours, il n’y a aucun signe de l’épanchement pleural à 3,125 et 6,25 mg/kg∙mL groupes10. Toutefois, dans le groupe de 12,5 mg/kg∙mL, le balayage du coffre CT était anormal avec l’angle costo postérieure émoussé, qui fait allusion à une petite quantité d’un épanchement pleural (Figure 2a, b). Aucun signe le niveau du liquide ont été observées, ce qui a été expliqué en raison d’une quantité insuffisante d’eau.
Lors de la dissection de rats, nous avons observé des épanchements jaune ou incolores, 6,25 mg/kg∙mL et groupes de 12,5 mg/kg∙mL 3 et 7 jours. Les volumes d’un épanchement pleural varient de 1 à 1,8 mL dans chaque cavité pleurale 6,25 mg/kg∙mL et groupes de 12,5 mg/kg∙mL. Dans le groupe de 3,125 mg/kg∙mL, aucun liquide dans la cavité pleurale est apparu dans le processus complet expérimental.
Avec le TEM, les nanoparticules NPSi présenté individuellement et les groupes forment dans le liquide pleural drainé. Le diamètre moyen (Ø : 20 ± 5 nm) et la morphologie dans le liquide pleural sont conformes à la NPSi dans la suspension préparée. Les nanoparticules étaient pour la plupart bien dispersée et sphériques, et la taille moyenne d’une nanoparticule individuel a été ~ 20 ± 5 nm (Figure 3a, b).
Figure 1 : Des images représentatives d’un épanchement pleural par conclusions échographique au jour 7. (a, b) Images échographique d’un rat dans le groupe de 3,125 mg/kg∙mL avec aucun liquide dans les cavités pleurales et péricardiques. (c, d) Images échographique d’un rat dans le groupe de 6,25 mg/kg∙mL avec apparent d’épanchement pleural et épanchement péricardique. (e, f) Images échographique d’un rat dans le groupe de 12,5 mg/kg∙mL avec beaucoup plus de fluide dans les cavités pleurales et péricardiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Les images représentant des images de CT thoraciques chez le rat. CT l’image d’un rat dans le groupe de 3,125 mg/kg∙mL sans épanchement pleural (un) et une image de CT d’un rat dans le groupe de 12,5 mg/kg∙mL avec un résultat négatif de liquide libre mais l’angle émoussé costo postérieure dans la cavité pleurale (b). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Nanoparticules de silice en suspension de polyacrylate/nanosilice et l’épanchement pleural d’un rat. (un) des nanoparticules de silice en polyacrylate/silice nanocomposite. (b) des nanoparticules de silice dans un épanchement pleural un rat avec clusters ou formulaire individuel. Echelle : 200 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1. L’épanchement pleural chez un rat dans le groupe de 6,25 mg/kg∙mL. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2. L’épanchement péricardique chez le rat dans le groupe de 6,25 mg/kg∙mL. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
L’échographie est l’outil le plus commode pour la détermination des maladies pulmonaires, en raison de son excellente sensibilité au fluide libre dans la cavité pleurale11. C’est parce que l’échographie peut détecter immédiatement le contraste d’impédance acoustique de l’air et des fluides dans les poumons12. En outre, l’échographie est plus souple dans le modèle d’un petit animal que CT. Néanmoins, l’air dans les poumons reflète l’onde sonore et empêché d’observer les changements intrapulmonaires après instillation de nanoparticules. Par conséquent, nous avons combiné poitrine CT scan et l’échographie pulmonaire pour étudier les changements intrapulmonaires et le liquide pleural.
Après avoir exploré les données d’imagerie, nous avons constaté que les résultats de l’imagerie est remarquable. Tout d’abord, notre modèle a démontré que le PA/NPSi, a en effet induit la toxicité inhabituelle, qui s’est manifestée comme la plèvre et l’épanchement péricardique au stade précoce dans le modèle de rat. Deuxièmement, ce modèle reproduit avec succès l’apparition et le développement des épanchements de polyserous humaine ; dans le même temps, ces processus ont été observés chez nos patients, qui présentent un épanchement pleural et péricardique, fibrose pulmonaire et granulome8,9. Par conséquent, ces faits implicitement que la membrane séreuse telles que la membrane pleurale ou la membrane péricardique figure parmi les cibles de la blessure de PA/NPSi, qui était similaire à celle provoquée par l’amiante. La chronologie des épanchements polyserous était aussi significative, tel que conclu par nos résultats.
Quant à la conception de notre modèle, l’instillation intratrachéale était l’étape critique. Cette méthode fait en sorte que la toxicité des nanoparticules pénétré dans l’organisme à travers la trachée, qui différait de la précédente étude13. Toutefois, les inconvénients de cette méthode sont les suivants : le PA/NPSi a instillé dans bronche bilatérale par le tube fin, nécessitant des compétences hautement expérimentales pour empêcher les dommages mécaniques à la trachée et la toux due à l’irritation. Ainsi, le point critique a été la bonne profondeur d’instillation intratrachéale. Pendant ce temps, maintenir une anesthésie appropriée a été essentielle à l’exécution de l’étape ci-dessus.
L’utilisation de nanoparticules, les particules fines pour les fins de la recherche sont ramasser de plus en plus l’attention. Plus le diamètre des particules fines, il est plus difficile pour les protéger. En revanche, le nano-silice d’un diamètre de 20 ± 5 nm requis en effet une méthode de préparation de haute technologie pour préparer cette étude, a provoqué une augmentation en difficulté avec la réduction du diamètre. Ainsi, l’un des avantages de notre technique était le diamètre de la nano-silice, qui était plus petite que la précédente étude13,14. Un autre avantage de cette étude était que nous avons induit la nanoparticule via trachéale plutôt que la peau ou la circulation13,15,16. Par exemple, l’exposition par voie intraveineuse nous entravée dans l’enquête sur l’organe cible, ce qui était difficile à distinguer de la lésion de l’organe cible, déclenché par les dégâts primaires ou secondaires. Par conséquent, à notre avis, l’instillation intratrachéale sera la meilleure façon d’étudier la toxicité des nanoparticules des poumons dans le futur à venir. Par ailleurs, le dosage des nanoparticules était inférieur à la précédente étude13, qui a présenté un rapport coût / efficacité plus élevée.
En ce qui concerne la plèvre et l’épanchement péricardique induite par le PA/NPSi, la réaction d’inflammation et de la production du système réactives de l’oxygène (ROS) serait la cause de cela. Nous l’a expliqué comme suit : tout d’abord, le nanosilice une augmentation des concentrations de ROS, induit la production inflammatoire, provoqué une dépolarisation mitochondrique et réduit les niveaux de glutathion fois in vivo et in vitro5,6. Deuxièmement, l’inflammation et la production de ROS a augmenté le liquide interstitiel dans le poumon ou la perméabilité des capillaires pleurales, qui a favorisé la formation d’un épanchement pleural à la fin. Par ailleurs, l’altération potentielle de drainage lymphatique pleural pourrait également être impliquée dans l’accumulation du liquide pleural. Avec plus d’accumulation de liquide pleural, avait augmenté la pression oncotique, qui finalement induite par la déposition de PA/NPSi dans les cavités pleurales. Ce résultat est conforme à nos précédentes expérimentations animales et signalé les patients8,10.
Pour l’épanchement pleural, lui-même, il était répandu dans la clinique. Néanmoins, beaucoup de maladies respiratoires ou systémique pourrait provoquer un épanchement pleural. Donc, la construction d’un modèle animal profiterait l’étude étiologique de l’épanchement pleural. L’étude précédente avaient noté la toxicité pulmonaire de nanosilice13,17. Cependant, les modèles précédents d’épanchement pleural signalés concernaient principalement les facteurs biologiques plutôt que des nanoparticules18,19. Par conséquent, la posologie de nanoparticules restait une question ouverte. Notre modèle a démontré qu’épanchement pleural a eu lieu le lendemain 3 PA/NPSi concentration de 6,25 mg/kg∙mL a été administré par instillation intratrachéale et a culminé sur jours 7-10. En outre, avec l’augmentation des concentrations de PA/NPSi, l’épanchement pleural produit plus et plus vite. En outre, notre modèle d’un épanchement pleural par rapport aux modèles biologiques18,19, était efficace et contrôlable par puits. Pour résumer, notre modèle serait bénéfique pour les futures études de maladies d’un épanchement pleural, ainsi que pour une étude plus approfondie de la nanotoxicité en particulier.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La présente étude et la production de cet article ont été financés par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant 81773373, 81172614 et 81441089 Grant). Nous remercions m. Jin Yan et Dr Pan Yujie, du ministère des situations d’urgence, hôpital Chaoyang de Beijing et le Dr Qu Peng du département de médecine par ultrasons, hôpital Chaoyang de Beijing pour aider à la production vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
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