Summary
Målet med denne protokollen er å identifisere lymfatisk endothelial celle populasjoner i leveren bruker beskrevet markører. Vi benytter collagenase IV og DNase og en mild hakking av vev, kombinert med flowcytometri, for å identifisere forskjellige innbyggere lymfatisk endotelceller.
Abstract
Lymfekar finnes innenfor portalen triad leveren, og deres beskrevet funksjon er å fjerne interstitiell væske fra lever til lymfeknutene der mobilnettet rusk og antigener kan undersøkes. Vi er svært interessert i å forstå hvordan den lymfatiske blodkar kan være involvert i betennelser og immun celle funksjon i leveren. Men lite har blitt publisert etablering fordøyelsen protokoller for isolering av lymfatisk endotelceller (LECs) fra leveren eller spesifikke indikatorer som kan brukes til å evaluere lever LECs på per celle basis. Derfor optimalisert vi en metode for fordøyelsen og flekker av leveren for å vurdere LEC befolkningen i leveren. Vi er sikker på at metoden skissert her vil være nyttig for identifisering og isolering av LECs fra leveren og vil styrke vår forståelse av hvordan LECs reagerer på leveren microenvironment.
Introduction
Rollen lymfekar og LECs i leveren er ikke godt forstått. Mens lymfekar finnes innenfor portalen triaden av leveren1 og utvide under sykdom2, er lite forstått om funksjonen og fenotypen av LECs i leveren. Med oppdagelsen av indikatorer som finnes på LECs3, fyller betydningen av disse cellene i ulike vev nisjer i homeostase og sykdom en betydelig gap i vår forståelse. LECs spiller en viktig rolle i å opprettholde perifere toleranse lymfeknute og metastatisk svulster av samhandler direkte med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfeknute kan fremme beskyttende immunitet via deres samhandling med vandrende dendrittiske celler14,15,16. Derfor finnes det flere roller for LECs som kan være spesifikk for vev og interaksjoner som de er til stede. Imidlertid forstått lite om hvordan LECs sammen med immunceller i vev eller hvordan LECs fungerer i ulike organsystemer; Dermed kan evaluere LECs på per celle basis i leveren eller andre organer føre til fremskritt i hvordan LECs programmet vev-spesifikke immunitet. Mens mye av litteraturen som fokuserer på LECs i leveren bruker mikroskopi for å visualisere LECs bruke ett eller to markører og morfologi17, er svært lite gjort for å evaluere LECs på celle for celle basis med flowcytometri, men en studie vurdere forskjellene mellom leveren sinusformet endotelceller (LSECs) og LECs18. Å kunne analysere LEC populasjoner i leveren av flowcytometri tillater fordypning i LEC fenotypen under normale homeostase eller sykdom.
For å evaluere LECs av flowcytometri, er flere overflate markører nødvendig. LECs er vanligvis visualisert uttrykk for prospero-relaterte homeobox 1 (Prox-1), lymfatisk fartøy endothelial hyaluronan reseptor 1 (LYVE1) eller vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 3 (VEGFR3) bruker mikroskopi. Men i leveren er uttrykk for disse markørene ikke begrenset til LECs. Prox-1 er mye uttrykt av hepatocytter under leveren utvikling og regeneration skade19, og LYVE1 og VEGFR3 er uttrykt av leveren sinusformet endotelceller18. I lymfeknute, LECs identifiseres med flowcytometri som klynger av differensiering (CD) CD45, CD31 + og podoplanin + (PDPN)16. Men er denne tilnærmingen for minimal isolere LECs i leveren siden CD45 - CD31 + celler vil fange endotelceller, og den dominerende befolkningen vaskulær endotelial celler i leveren er LSECs. Dermed for andre markører å skille sjeldne LEC befolkningen fra rikelig LSEC befolkningen. Både CD16/32 (uttrykt av eldre LSECs18) og CD146 (en vanlig vaskulær endotelial celle markør som er hovedsakelig uttrykt i leveren sinusoids av leveren sinusformet endotelceller20 med liten eller ingen uttrykk av lymfatiske endotelceller21) var kandidat markører.
Derfor optimalisert vi en metode for å isolere og visualisere LECs i leveren bruker ovenfor markører, CD45, CD31, CD146, CD16/32, og PDPN for flowcytometri. Vi beskriver bruk av collagenase IV, DNase 1 og mekanisk separasjon for leveren vev fordøyelsen en enkeltcelle suspensjon. Vi beskriver også bruk av iodixanol tetthet gradert for isolering av ikke-parenchymal celler (NPC) og å eliminere mobilnettet rusk. Til slutt fastslå bruker flere indikatorer, vi den optimale flyt cytometri gating strategien for å identifisere LECs fra lever med PDPN som den dominerende markøren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Colorado Anschutz medisinsk Campus.
1. utarbeidelsen av materialet
- Lage en 5 mg/mL løsning av DNase I fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Gjøre en fordøyelsen blanding ved å legge til 5000 U/mL collagenase IV Klikk EHAA media.
- Varm fordøyelsen blanding ved 37 ° C i 30 min før bruk.
- Gjøre en isolasjon bufferen ved å legge 4,8% bovin serum albumin (BSA) og 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) til Hanks' balansert salt løsning (HBSS).
- Gjøre en røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer ved å legge 100 mM salmiakk, 10 mM KHCO3og 0,1 mM EDTA til destillert H2O.
2. forberedelse av en enkeltcelle suspensjon fra en mus lever
- Euthanize musen med CO2 og cervical forvridning.
- Spray ned musen med 70% etanol våt pelsen. Feste musen er føtter en disseksjon styret.
- Bruke disseksjon saks til å kutte huden ca 1 cm over anus, pass på å kutte gjennom huden (ca 1 mm). Rykk huden fra kroppen med tenner tang og sette saksen mellom huden og peritoneum. Åpne saksen å skille huden fra peritoneum, og deretter skjære huden fra innsnitt i nakken.
- Feste huden disseksjon styret bruker en pin under hver arm og over hver etappe. Løft peritoneal sac og kuttet oppover mot halsen. Grab lobes av leveren og kuttet rett under sternum.
Merk: Omsorg bør tas hvis noen av leveren skal brukes for immunohistochemistry (IHC). - Kuttet rundt leveren og fjerne leveren fra musen og plassere den i 4 mL Klikk EHAA medier.
- Ved hjelp av en skalpell, kuttet leveren i ~ 1 mm diameter stykker.
- Legge til 500 µL av fordøyelsen blandingen og 500 µL av DNase jeg (2 mg/mL) til leveren.
- Inkuber leveren i 30 min på 37 ° C. Etter 15 min, blande væsken bruker en 5 mL pipette.
- Etter 30 min med inkubering, overføre fordøyd utvalget gjennom en 100 µm sil slik konisk 50 mL.
- Skyv gjenværende bitene gjennom filteret med stempelet til en 1-mL sprøyte.
- Filteren vaskes med 5 mL av isolasjon buffer og skyv vevet gjennom silen med baksiden av en stempelet fra en 1 mL sprøyte. Gjenta dette til filteret vasket med 25 mL av isolasjon buffer.
- Sentrifuge cellene på 400 x g for 5 min. nøye Sug opp av nedbryting.
- Resuspend pellets med 4 mL RBC lyseringsbuffer. Inkuber cellene ved romtemperatur for 5 min.
- Vask cellene med 10 mL av isolasjon buffer og sentrifuge 400 x g for 5 min.
- Tell cellene i en hemocytometer å finne hele leveren greven.
- Resuspend celler i 5 mL av 20% iodixanol og lag dem med 1 mL av PBS.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 15 min uten en brems.
- Fjern laget mellom PBS og iodixanol og plassere dem gjennom 100 µm filter, i en ny 50 mL konisk tube.
- Vask cellene med 10 mL av isolasjon buffer og sentrifuge 400 x g for 5 min.
- Forkast nedbryting og resuspend cellene i 500 µL av PBS med 2% fosterets bovin serum (FBS).
3. strøm Cytometric analyse av enkeltceller fra lever
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og mikroskop, bruker trypan blå utelukkelse for å måle levedyktige cellers. Legge 10 µL av cellene til 10 µL av trypan blå og umiddelbart plassere dem på en hemocytometer og telle levende celler (ikke blå) under et mikroskop. Deretter beregne antall celler per mikroliter.
- Aliquot ca 5 millioner av gjenværende nonparenchymal cellene inn i en enkelt brønn av en 96-brønns plate.
- Sentrifuge cellene på 400 x g i 5 min.
- Forkaste nedbryting og resuspend cellene i 90 µL av PBS med 2% FBS.
- Legg til anti-CD45 (1:200), anti-CD146 (1:200), anti-CD31 (1:200) og PDPN (1:200) fortynnet i 10 µL av 10 x 2.4G2 eller anti-CD16/32 (1:200).
Merk: Ingen Fc blokk (2.4G2) brukte da anti-CD16/32-merket antistoff ble brukt. - For å avgjøre hvor positive og negative porter skal angis, Inkluder en fluorescens minus én (FMO) flekk for hver farge og en isotype kontroll antistoff.
- For å bestemme live versus døde celler, flekker med merketråd levedyktighet (f.eks spøkelse røde 780). Inkuber cellene på 4 ° C i 30 min.
- Vask cellene med 100 µL av PBS med 2% FBS.
- Bruk en liten aliquot celler for å justere laser og kompensasjon innstillingene på flyt-cytometer. Stain cellene med et antistoff hver individuelle fluorophore og uten noen antistoff.
Merk: Avhengig av flyt cytometer brukes, bør en kompensasjonsmatrise opprettes fjerne spectral overlapping. - Sett eksempel røret på cytometer sonden og samle og registrere alle hendelser.
4. dataanalyse
- Ser på side-scatter området vs fremover-scatter område, gate på "live" cellene basert på størrelse og detaljnivå og levedyktighet markør fargestoff.
- Deretter bruker CD45 briljante Violet 510 og CD31 PerCp Cy5.5, gate på CD45 - CD31 + cellene med isotype kontroller og FMO for å finne positive og negative populasjoner.
- Til slutt bruker CD146 v450 eller CD16/32 FITC og PDPN APC, ta CD146 - PDPN + eller CD16/32-PDPN + celler, igjen med isotype kontroller og FMO, for å finne positive og negative populasjoner. Disse cellene er i LECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studier analysere leveren lymfekar har primært brukes immunohistochemistry for å quantitate frekvensen og diameteren på lymfekar i leveren. Men tillater denne metoden ikke for evaluering av LECs på en celle-for-celle-basis eller uttrykk for flere indikatorer, cytokiner, chemokines eller transkripsjonsfaktorer. Derfor vi spurte om lever LECs kan være isolert fra leveren og vurdert flowcytometri. Tidligere arbeid isolere lymfeknute LECs ble utført ved hjelp av Liberase DL (collagenase i-II-og-dispase) og DNase 1 kombinert med mekanisk separasjon av lymfeknute vev med nåler14,16. Derfor den samme fordøyelse protokollen på leveren vev ble brukt, eller collagenase IV og DNase-1 ble brukt som beskrevet tidligere, immun celle isolering av leveren22 og fulgte fordøyelsen med en tetthet gradert separasjon (iodixanol) steg til Fjern hepatocytter og øke hyppigheten av andre celletyper i leveren (figur 1A). Etter leveren fordøyelsen og sentrifugering med tetthet gradient, cellene var farget med CD45, CD31, PDPN og CD16/32. CD16/32 har blitt beskrevet for å uttrykkes av eldre LSEC bestander, men ikke LEC bestander18. Dermed LECs var gated som CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + celler, mens LSECs var gated som CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + og PDPN-(figur 1A). Gates ble satt på levende celler (ghost røde negativ) og basert på isotype kontroller og FMO flekker (figur 1A). LYVE-1 APC LEC befolkningen var også bekreftet (figur 1B). Begge metoder tillatt visualisering av befolkningen LEC i leveren; men var flekker profilen til cellene visuelt bedre når du bruker collagenase IV og DNase 1 enn collagenase jeg-II-og-dispase (figur 1 c). Derfor ble alle fremtidige manipulasjoner utført med collagenase IV og DNase 1, som beskrevet i protokollen. I gjennomsnitt innhentet vi ca 1300 LECs per gram av leveren vev eller 2200 LECs per naiv leveren, denne fordøyelsen metoden.
Optimalisere gating strategi og kombinasjon av fluorophores og eliminere forurensning av LSECs, ble både CD16/32 og CD146 brukt. CD16/32 er Fc gamma reseptorer II og III og uttrykkes på eldre LSECs men ikke på LECs18. CD16/32 kan skille PDPN + CD16/32-cellene fra PDPN-CD16 / 32 + celler, spesielt når du bruker PDPN konjugert til APC eller PE og CD16/32 konjugert til FITC (figur 1A), men mindre godt når PDPN var konjugert til PE-Cy7 (figur 1 c). Uttrykk for CD16/32 finnes ikke på LECs, men finnes på LSECs. FC blokk bruker CD16/32 antistoffer til å minimere den Fc reseptor og nonantigen bestemte binding av immunglobuliner på Fc reseptorene. Siden CD16/32 ble brukt til å visualisere LSECs, ikke-spesifikk binding av immunglobuliner var høyere og CD146 var optimalisert som et alternativ til å måle LSECs. Derfor testet vi CD146 konjugert til V450, merketråd vaskulær endotelial celle uttrykt svært LSECs og andre vaskulær endotelceller20 men med lav til ingen uttrykk av LECs23. Vi først optimalisert farging av CD146 med FMO og isotype for både CD16/32 og CD146 (figur 2A). Hvis vi bare CD16 / 32 + celler eller CD16/32-cellene, CD16 / 32 + celler var alle CD146 + og PDPN - mens CD16/32-cellene var hovedsakelig CD146 - og PDPN- eller PDPN + (figur 2B). For å bekrefte denne flekker, ble FMO brukt. Fjerner PDPN fra flekken, forsvant befolkningen PDPN + (figur 2C). Interessant var det ingen CD146 + PDPN + celler, bekrefter at CD146 ikke er eller veldig ydmyk uttrykt ved PDPN + LECs. Derfor vi er overbevist om at en av disse markørene kan brukes til gate ut vaskulær endotelial celler i leveren.
For å ytterligere bekrefte at PDPN er en passende markør for LECs, var lever inndelinger fra mus farget med både PDPN (grønn) og F4/80 (brun) (figur 3A). Verken vaskulære endotelet eller makrofager uttrykt PDPN i murine leveren. Vi var også i stand til å skille cholangiocytes, som kan flekken positiv for PDPN, fra lymfekar, basert på forskjellige kjernefysiske strukturer av galle kanaler og cytokeratin 7 flekker (figur 3B, red: cytokeratin 7, grønn: PDPN). Siden flere markører brukes for flowcytometri, som CD31, ikke uttrykt av cholangiocytes24, vi er overbevist om at vi fjerner disse cellene fra analysen, og dermed bekrefter at celler fra lever som CD45-, CD31 +, CD146 Lo/neg, CD16/32-, og PDPN + er LECs. Til slutt for å gi bevis på at farget cellene er LECs, vi sortert denne populasjon av celler og brukt kvalitativ sanntid polymerasekjedereaksjons evaluere Vegfr3 og prox-1 uttrykkene. Både Vegfr3 og prox-1 ble evaluert, som disse transkripsjonene er uttrykt av andre celler i leveren,prox1 av hepatocytter og Vegfr3 av LSECS (blant annet), men ingen andre celler foruten LECs uttrykke både. Uttrykk for begge disse markørene var signifikant høyere i sorterte befolkningen enn i kulturperler murine macrophage cellen linje (RAW264.7) som uttrykker ikke normalt disse markørene men ligner i uttrykket kulturperler murine LECs (Figur 3 c ).
Figur 1 : Representant flyt cytometri analyse av collagenase jeg-II-dispase og collagenase IV-fordøyd murine leveren vev. (A) dette panelet viser gating strategien, fluorescens minus en flekker, og isotype kontroller for prosedyren. (B) dette panelet viser den LYVE-1 flekker av CD16/32-PDPN + celler. (C) dette panelet viser siste flyt cytometri porten etter fordøyer musen lever med enten collagenase jeg-II-dispase (f.eks, Liberase DL) eller collagenase IV og evaluere CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 der LECs er CD16/32- og PDPN +. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Identifikasjon av CD146 og PDPN som passer markører for leveren lymfatisk endotelceller. (A) dette panelet viser fluorescens minus ett og isotype kontroller for CD16/32 (venstre) og CD146 (høyre). (B) dette panelet viser gated CD16/32 positiv eller negativ celler bestemmes fra panelet A. Vist er CD146XPDPN fra begge populasjoner. (C) dette panelet viser fluorescens minus en for PDPN å vise at den flekker er fraværende når antistoffer er ikke lagt til. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Identifikasjon av PDPN + celler som lymfatisk endotelceller. (A) dette panelet viser representant immunohistochemistry fra mus lever med PDPN (blå/grønn) og F4/80 (brun). Den macrophage (MF) med lymfatisk fartøy (LV) og blodkar (BV) er merket. Skala bar = 100 µm. Formalin-fast parafin-embedded vev var deparaffinized for 20 min i xylen. Vev var hydrert vann gjennom en gradering av etanol og antigen henting ble utført med pH 6 antigen henting buffer i en trykkoker for 15 min. vev ble blokkert med 0,1% BSA og farget med anti-mus PDPN og anti-musen F4/80 1t på rommet temperatur. Anti-hamster IgG HRP og anti-kanin IgG HRP ble brukt som sekundær antistoffer. 3, 3-Diaminobenzidine (DAB) + og Vina grønne ble brukt til å oppdage F4/80 og PDPN, henholdsvis. Vev var counterstained med hematoxylin og fotografert på et mikroskop. (B) dette panelet viser samme eksperiment utført i kontrollpanelet , unntatt her, PDPN vises i grønt, cytokeratin 7 i rød og 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i blått. Skala bar = 100 µm. vev ble blokkert bruker 5% esel og 5% geit serum og farget med anti-musen PDPN (8.1.1) 1: 100 og anti-mus cytokeratin 7 1:200 1t ved romtemperatur. Anti-hamster IgG AF647 og anti-kanin IgG-PE ble brukt som sekundær antistoffer. Vev var counterstained med DAPI og fotografert. Skala bar = 100 µm. Den galle duct (BD) med lymfatisk fartøy (LV) og blodkar (BV) er merket. (C) dette panelet viser logg kaste endring i Vegfr3 og prox-1 uttrykk fra sorterte lever LECs basert på den flekker i protokollen (CD45 - CD31 +, CD146lo/negog PDPN +) sammenlignet med rå celler eller primære murine lymfeknute LECs. Sorterte celler ble sendt gjennom en Research-shredding kolonne, RNA ble hentet ved hjelp av en RNA utvinning pakke og cDNA ble laget med en omvendt transkripsjon kit. Transkripsjon overflod var normalisert til housekeeping genet, Gapdh, for hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelle betydningen av LECs i immun homeostase og regulering har nylig kommet til lys25. Mye av publiserte lymfatisk litteraturen fokuserer på huden og lymfeknuter; imidlertid lymfekar finnes i hele kroppen26 , og dermed vår forståelse av deres betydning i ulike organer er nødvendig. Her viser vi en metode der LECs i leveren kan studeres celle for celle for å forstå deres samtidige gjengivelsen av forskjellige overflate markører, cytokiner, chemokines og intracellulær proteiner som transkripsjonsfaktorer. Denne metoden vil være nyttig for framtidige studier for å vurdere fenotypen og funksjon av LECs i leveren i helse og sykdom.
En av hindrene for identifisering av LECs i leveren er deres relativt lav frekvens i forhold til andre celletyper. Hepatocytter utgjør rundt 80% av leveren og fjerne disse cellene med tetthet gradert (iodixanol) før kjører leveren på en flyt cytometer krever mindre tid, og dermed gir bedre levedyktighet. For å skille LYVE1 + LECs befolkning leveren fra LYVE1 + LSECs, brukte vi markører CD16/32 og CD146 funnet på LSECs og med lav til ingen uttrykk av LECs. Dette, kombinert med mangel eller lav uttrykk for PDPN av noen andre endothelial celle i leveren, tillatt valideringen av flowcytometri at befolkningen vi identifisert var LECs. Faktisk bekreftet nedstrøms transcriptional analyse at denne gating strategien produsert LECs (Figur 3 c).
Isolasjon av LECs fra lymfeknute er best gjort ved hjelp av collagenase jeg-II-og-dispase; Vi fant imidlertid at, mens denne metoden ekstra LECs fra leveren, en lever fordøyelsen protokoll som collagenase IV gir en bedre nedstrøms analyse ved hjelp av flowcytometri. Bruker en mekanisk forstyrrelse av leveren kan collagenase mer areal å bedre samhandle med ekstracellulær matrix-assosiert celler, som LECs, og bruke Klikk EHAA media uten FBS tillater fordøyelsen av leveren skje på bare 30 minutter. Denne redusert tiden opprettholder LEC levedyktighet for nedstrøms analyser som flowcytometri eller flyt sortering. Faktisk kunne vi gjenopprette nok levedyktig celler for å visualisere LECs ved flowcytometri og flyt sortering for nedstrøms transcriptional analyse.
Kombinert, separasjon av hepatocytter fra ikke-parenchymal cellene, bruk av collagenase type IV og avklaring og demonstrasjon av markører gjelder for LECs i leveren og markører gjelder for andre endothelial celle populasjoner, for eksempel CD16/32 og CD146, tillatt riktig identifikasjon av LECs i leveren. Disse metodene fylle en betydelig gap i litteraturen om hvordan LECs i leveren kan identifiseres av flowcytometri, spesielt siden leveren inneholder en rekke andre celler som uttrykker markører kjent for å være unik for LECs i lymfeknute (prox1 og vegfr3). Derfor vil disse metodene føre til nedstrøms studier om LEC leverfunksjon. I tillegg kan denne metoden endres for andre vev for å vurdere vev-spesifikke LEC markører og delsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke GI og leveren medfødte immunsystemet programmer for økonomisk støtte til dette prosjektet. B.A.J.T. er også finansiert av R01 AI121209.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y.
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).
