本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。
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本文内容
摘要
摘要
在肝脏中，淋巴管位于门管区，其已知功能是将肝内的组织液引流至淋巴结，在那里对细胞碎片和抗原进行监测。我们非常关注淋巴脉管系统在肝脏炎症及免疫细胞功能中可能发挥的作用。然而，目前关于分离肝脏淋巴管内皮细胞（LECs）的消化方案，或用于在单细胞水平评估肝脏 LECs 的特异性标志物的研究报道极少。因此，我们优化了一种用于肝脏消化和染色的方法，以评估肝脏中 LEC 群体。我们相信，本文所述方法将有助于识别和分离肝脏中的 LECs，并加深我们对 LECs 如何响应肝脏微环境的理解。
引言
肝内淋巴管及淋巴管内皮细胞（LECs）的作用尚不明确。尽管已发现淋巴管存在于肝脏门管区1，并在疾病过程中发生扩张2，但关于肝内 LECs 的功能及其表型特征仍知之甚少。随着主要表达于 LECs 上的标志物被发现3，这些细胞在不同组织微环境中的稳态与疾病状态下的重要性将填补我们认知中的一个重要空白。LECs 在淋巴结及转移性肿瘤中通过直接与 T 细胞相互作用，在维持外周耐受中发挥关键作用4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。淋巴结中的 LECs 还可通过与迁移性树突状细胞的相互作用促进保护性免疫应答
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方案
本文所述所有方法均已获得科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 材料的准备
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 mg/mL 的 DNase I 溶液。
- 将 5,000 U/mL 的胶原酶 IV 加入 Click’s EHAA 培养基中，制备消化液。
- 使用前将消化液在 37 °C 下预热 30 分钟。
- 在 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）中加入 4.8% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），制备分离缓冲液。
- 在蒸馏水（H2O）中加入 100 mM 氯化铵、10 mM KHCO3 和 0.1 mM EDTA，制备红细胞裂解缓冲液。
2. 小鼠肝脏单细胞悬液的制备
- 使用 CO2 和颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。
- 用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，使毛发湿润。将小鼠四肢用大头针固定于解剖板上。
- 使用解剖剪在肛门上方约 1 cm 处剪开皮肤，注意仅切穿皮肤层（约 1 mm 深....
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结果
目前对肝脏淋巴管的研究主要采用免疫组织化学方法来定量分析肝脏中淋巴管的数量和直径。然而，该方法无法在单细胞水平上评估淋巴管内皮细胞（LEC），也无法检测多种标志物、细胞因子、趋化因子或转录因子的表达。因此，我们探讨了是否可从肝脏中分离出LEC，并通过流式细胞术进行分析。既往分离淋巴结LEC的研究采用Liberase DL（胶原酶I-II-分散酶）联合DNase 1，并结合针头机械解离淋巴结组织的方法14,16。因此，本研究尝试在肝组织上使用相同的消化方案，或采用之前用于从肝脏中分离免疫细胞的胶原酶IV和DNase 1方案22，并在消化后加入密度梯度离心（碘克沙醇）步骤，以去除肝细胞并提高肝脏中其他细胞类型的相对比例（图1A）。肝脏组织经消化并使用密度梯度离心后，细胞使用CD45、CD31、PDPN和CD16/32进行染色。已有文献报道CD16/32在.......
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讨论
近年来，淋巴管内皮细胞（LECs）在免疫稳态与免疫调节中的整体重要性逐渐被揭示25。目前已发表的关于淋巴系统的文献大多集中于皮肤和淋巴结；然而，淋巴系统遍布全身26，因此我们有必要深入理解其在不同器官中的作用。本文介绍了一种可在单细胞水平上研究肝脏中淋巴管内皮细胞的方法，以更深入地了解这些细胞同时表达的不同表面标志物、细胞因子、趋化因子以及转录因子等细胞内蛋白的情况。该方法将有助于未来研究在健康与疾病状态下肝脏中淋巴管内皮细胞的表型与功能。
在肝脏中鉴定肝内淋巴管内皮细胞（LECs）的一个难点在于，与其他细胞类型相比，其频率相对较低。肝细胞约占肝脏细胞总数的80%，因此在对肝脏样本进行流式细胞术分析前，使用密度梯度（碘克沙醇）去除肝细胞可节省时间，从而获得更好的细胞活性。为了将肝脏中表达LYVE1的LECs与表达LYVE1的肝窦内皮细胞（LSECs）区分开来，我们利用了LSECs表达而LECs表达水平很低或不表达的标记物CD16/32和CD146。结合肝脏中其他内皮细胞几乎不表达或低表达.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢胃肠道与肝脏先天免疫项目对本研究的资金支持。B.A.J.T. 还获得了 R01 AI121209 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Clicks/EHAA 培养基 | Irvine Scientific | 9195 | |
| 胶原酶 IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | 脱氧核糖核酸酶 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | 密度梯度介质 |
| V450 抗小鼠 CD146（克隆 ME-9F1） | BD biosciences | 562232 | |
| FITC 抗小鼠 CD146（克隆 ME-9F1） | Biolegend | 134706 | 异硫氰酸荧光素（FITC） |
| Pacific Blue 抗小鼠 CD31（克隆 390） | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 抗小鼠 CD31（克隆 390） | Biolegend | 102420 | 多甲藻叶绿素蛋白-花青素 5.5（PerCP-Cy5.5） |
| APC 抗小鼠 PDPN（克隆 8.1.1） | Biolegend | 127410 | 别藻蓝蛋白（APC），podoplanin（PDPN） |
| APC/Cy7 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11） | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11） | Biolegend | 103138 | |
| FITC 抗小鼠 CD16/32（克隆 93） | Biolegend | 101306 | 异硫氰酸荧光素（FITC） |
| PerCp/Cy5.5 抗小鼠 CD16/32（克隆 93） | Biolegend | 101324 | 多甲藻叶绿素蛋白-花青素 5.5（PerCP-Cy5.5） |
| ghost red 780 活性染料 | TONBO biosciences | 3-0865-T100 | |
| APC 仓鼠 IgG（克隆 SHG-1） | Biolegend | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 大鼠 IgG2a（克隆 RTK2758） | Biolegend | 400531 | |
| FITC 大鼠 IgG2（克隆 eBR2a） | ebioscience | 1-4321-80 | |
| 抗小鼠 LYVE1（克隆 223322） | R&D systems | FAB2125A | |
| 抗小鼠细胞角蛋白（克隆 EPR17078） | abcam | ab181598 | |
| 抗小鼠 F4/80（克隆 Cl:A3-1） | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA（V 组分） | Fischer | BP1600-100 | 牛血清白蛋白（BSA） |
| 山羊血清 | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| 驴血清 | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | 乙二胺四乙酸（EDTA）—用于红细胞裂解缓冲液 |
| 氯化铵 | Fischer | A687-500 | 用于红细胞裂解缓冲液 |
| 碳酸氢钾 | Fischer | P184-500 | 用于红细胞裂解缓冲液 |
| 手术刀 | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm 细胞筛 | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | 本实验室/ATCC | ATCC HB-197 | FC 阻断剂，用于抑制非特异性结合至 Fc gamma 受体阳性细胞——由杂交瘤制备 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14185-052 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 孔板 | Corning | 3788 | |
| 6 孔板 | Corning | 3506 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Truline | TR2004 | |
| 15 mL 锥形离心管 | Falcon | 352196 | |
| 1 mL 移液枪头 | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL 移液枪头 | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL 移液枪头 | USA scientific | 1111-3700 | |
| 血清学 10 mL 移液管 | greiner bio-one | 607107 | |
| 血清学 5 mL 移液管 | greiner bio-one | 606107 | |
| 细胞培养箱 | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II 流式细胞仪 | BD biosciences | ||
| 临床离心机 | Beckman coulter | 型号 X-14R |
参考文献
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The ....
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