Summary
Denne artikkelen beskriver en ny metode for å generere tumor antigen-spesifikke indusert pluripotent stilk cellen avledet tymusatrofi nybyggere (iTE) av en tre-dimensjonale (3D) tymusatrofi kultur system. iTE er en homogen undergruppe av T-celler nært knyttet til naive T-celler med kapasitet for spredning, minne formasjon, og tumor undertrykkelse.
Abstract
Arven etter pre-omorganisert T celle reseptorer (TCRs) og deres epigenetic foryngelse gjøre indusert pluripotent stilk cellen (iPSC)-avledet T celler en lovende kilde for adoptivforeldre T celle terapi (ACT). Men, klassisk in vitro metoder for å produsere generert T-celler fra iPSC resultere i enten medfødt-like eller uhelbredelig differensiert T-celler, som er phenotypically og funksjonelt skiller fra naive T-celler. Nylig, en roman tredimensjonale (3D) tymusatrofi kultur system ble utviklet for å generere en homogen undergruppe av CD8αβ+ antigen-spesifikke T-celler med en naiv t celle-lignende funksjonell fenotype, inkludert kapasitet for spredning, minne formasjon , og tumor undertrykkelse in vivo. Denne protokollen unngår avvikende utviklingsmessige skjebne, noe som åpner for generering av klinisk relevante iPSC-avledede T-celler, utpekt som iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE), samtidig som det gir et potent verktøy for å belyse de påfølgende funksjonene som er nødvendige for T celle modning etter tymusatrofi utvalg.
Introduction
Adoptiv T celle terapi (ACT) kan være en effektiv behandling for noen pasienter med avansert kreft. Dessverre, mange pasienter ikke opplever tumor regresjon, og overførte celler ikke klarer å vedvare etter infusjon. Dette kan skyldes kvaliteten på de tilført T-cellene. En ACT musemodell viste at i forhold til naiv eller mindre differensiert sentrale minnet T-celler, uhelbredelig differensiert Effektor celler er mindre potente på grunn av dårlig in vivo utholdenhet1, en observasjon også støttet av kliniske data2, 3i denne.
I et forsøk på å forbedre effekten av dagens Act, t celle-avledet indusert Pluripotent stamceller (t-IPSC) har blitt studert omfattende4,5. Når T-celler er omprogrammeres i T-iPSC og re-differensiert i T-celler, den omorganisert konfigurasjon av TCR gener er arvet av T-iPSC, og deretter re-differensiert T-celler. Derfor er kapasiteten til T-iPSC å gjennomgå ubegrenset in vitro ekspansjon tillater effektiv reproduksjon av umodne T celler bærer neoantigen-spesifikke T celle reseptorer (TCR) når slike celler er konstruert fra tumor antigen-spesifikke T-celler6 ,7. Men den presise metoden for differensiering av T-iPSC i modne T-celler, som ville tillate produksjon av kreft antigen-spesifikke T-celler med en mindre differensiert fenotype og bedre anti-tumor potens, gjenstår å belyst.
T-IPSC differensiering ansette co-kulturen i OP9 murine stromal celler over-uttrykker menneskelig hakk ligand DLL1 er en veletablert metode for å produsere T celler in vitro6,7. I mus og mennesker, kan dette co-kultur systemet konsekvent differensiere IPSC, og dermed recapitulating utviklingsmessige hendelser fra blastocyst scenen til umodne T Cell Lineage trinn6,7. Til tross for disse bioteknologisk fremskritt, den fysiologiske differensiering etter CD4+CD8+ Double positive (DP) scenen er fortsatt vanskelig å oppnå. En av grunnene er at in vivo CD4+CD8-og CD4-CD8+ singel positive (SP) T- celler er generert i thymus, et organ ansvarlig for modning og valg av T-celler som har utenlandsk antigen-spesifisitet, men ikke automatisk reaktivitet8. Disse selektive prosessene defineres som henholdsvis positive og negative valg. Men de fleste av de molekylære mekanismer som er nødvendig for å modne T celler i thymus er fortsatt ikke fullt ut forstått, noe som gjør det vanskelig å rekonstruere denne prosessen in vitro. I et forsøk på å overvinne denne fysiologiske hinderet, har flere grupper stimulert av TCR komplekse ved hjelp av anti-CD3 antistoffer eller Agonistiske peptider. Disse in vitro teknikker generere celle produkter som uttrykker nøkkel T celle markører, som CD3, CD8αβ, TCRαβ, og CD62L, mens du fortsatt beholde tumor antigen-spesifisitet. Dessverre, T-celler generert av disse extrathymic metoder utgjør en bred heterogene befolkning av celler preget av ufullstendige positive valg, medfødt-lignende funksjoner, TCR ikke-spesifikk drap, manglende evne til minne formasjon, og ikke-vedvarende anti-tumor effekter i vivo8,9,10,11. Disse unormalt har reist bekymring for at slike celler kan utløse en rekke bivirkninger, inkludert lymfom og både hud og bein unormalt, hvis det brukes for terapeutiske programmer12,13,14 .
For å gjenskape de fysiologiske signalene som mangler i gjeldende in vitro differensiering systemer, tumor antigen-spesifikke T-iPSC ble differensiert ved hjelp av en høstet thymus. Den klassiske fosterets thymus organ kultur (FTOC) system, som ble utviklet for å studere intra-tymusatrofi utvikling av T-celler, ble forbedret ved hjelp av en 3D-kultur system som vellykket produserte T-celler som fullførte tymusatrofi utdanning. Disse post-tymusatrofi T-celler, som ble utpekt som iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE), utstilt naiv-lignende egenskaper15. iTE viste spredning, minne formasjon, og tilstrekkelig anti-tumor effekter i en musemodell mot etablerte b16 melanom svulster. Denne artikkelen beskriver i detalj protokollen av denne romanen FTOC systemet ved hjelp av en 3D-kultur system (figur 1).
Protocol
Alle dyret eksperimenter ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer av National Cancer Institute (NCI) og utført i samsvar med NIH retningslinjer.
1. utarbeidelse av OP9/DLL1 celler for co-kultur med iPSC
- Kultur OP9/DLL1 celler i OP9 Media (α-minimum essensielle medium [α-MEM] + 20% ikke-varme deaktivert fosterets storfe serum [FBS] + 1x penicillin-Streptomycin + askorbinsyre [50 ng/mL] og mono-thioglycerol [100 nM]) ved 37 ° c. Når OP9/DLL1 cellene nå 80-95% confluency, vask en gang med 1x magnesium, kalsium, og fenol rød gratis fosfat bufret saltvann (heretter referert til som PBS).
- Tilsett 4 mL 0,05% Trypsin og ruge i 5 min ved 37 ° c. Deretter legger du til 4 mL OP9 Media, distansere celle laget ved pipettering å lage en enkelt celle suspensjon.
- Overfør celle fjæringen til et 50 mL konisk rør gjennom en celle sil på 100 μm. Sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c, aspirer supernatanten og resuspend i 12 mL OP9 medium.
- Plate 2 mL OP9/DLL1 celle fjæring på en ny 10 cm celle-kultur Petri parabolen og legge til ytterligere 8 mL OP9 Media. Gjenta passasje hver 2-3 dager.
Merk: Kvaliteten på FBS og kultur forholdene er avgjørende for å opprettholde utvidelsen av OP9/DLL1 celler uten å miste sin evne til å støtte iPSC differensiering. Derfor anbefales det å pre-evaluere mange FBS og passasje konsekvent på 80% confluency å hindre celle differensiering og senescence. Det er også viktig å gjøre nok frosset lager av OP9/DLL1 celler og tine et nytt lager hver 4-6 uker.
2. in vitro differensiering av iPSC i umodne T celler
-
På dag 0, begynner iPSC co-kultur på OP9/DLL1 confluent retter.
- Harvest iPSC som en enkelt celle suspensjon av trypsinization (5 min i 0,05% Trypsin ved 37 ° c), samle cellene, og sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Aspirer de supernatanten og resuspend cellene ved 1,0 x 105 IPSC per 10 ml av OP9 medier. Plate 1,0 x 105 IPSC på en confluent OP9/DLL1 10 cm rett.
Merk: OP9/DLL1 10 cm retter brukes til iPSC differensiering når de når 90-100% confluency. Forskjeller i confluency kan påvirke effektiviteten av iPSC differensiering.
- På dag 3, aspirer gamle medier og Erstatt med 10 mL fersk OP9 Media.
-
På dag 6, passasje celler.
- Vask hver 10 cm confluent OP9 rett med 10 mL PBS. Tilsett 3 mL 0,05% Trypsin per fat og ruge i 3 – 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Tilsett 4 mL OP9 Media og samle celler ved milde pipettering. Passere celler gjennom en 100 μm celle sil og sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten.
- Resuspend celler i 10 mL differensiering Media (OP9 Media med 5 ng/mL mus Flt3 ligand [FLT3L] og 5 ng/mL mus IL-7) og plate celle suspensjon på en ny 10 cm OP9/DLL1 confluent parabolen.
- På dag 9, aspirer gamle medier og erstatte med 10 mL fersk differensiering Media.
-
På dag 11 når cardiomyocytes er observert i iPSC kolonier, løsne mekanisk ikke-tilhenger celler ved pipettering og filtrere gjennom en 100 μm celle sil. Spin ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Aspirer supernatanten og resuspend i 24 mL differensiering Media. Plate iPSC i en confluent OP9/DLL1 6-brønn plate (4 mL/brønn).
-
På dag 15, samle alle ikke-tilhenger celler og filtrere gjennom en 40 μm celle sil.
- Spin ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Fortsett passaging ikke-tilhenger celler hver 3 – 4 dager ved å gjenta trinn 2.5.1.
3.3D Tymusatrofi organ kultur for å generere iTE
- Harvest mus fosterets tymusatrofi fliker og distribusjon av endogene lymfocytter ved deoxyguanosine (dGUO) behandling som tidligere beskrevet16.
- På dag 7 av dGUO behandling, ta fire nye 10 cm retter og fyll hver med 20 mL komplett Media (Rosswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-glutamin + 1x natrium pyruvat + 1x minimum viktig medium med ikke-essensielle aminosyrer (MEM-NEAA) + 1x penicillin-Streptomycin + [1:1000] 2-mercapto etanol).
- Overfør alle nitrocellulose membraner med tymusatrofi fliker til 1 10 cm rett. Løsne de enkelte fliker fra membranen med tang, slik at de kan senkes i Media. Kast membraner. Ruge for 1 time ved RT.
- Overfør tymusatrofi fliker til en ny 10 cm rett med komplett Media og ruge for 1 time ved RT. Gjenta dette trinnet 2 ganger til.
- Ved hjelp av tang, fikse tymusatrofi fliker til parabolen (en om gangen), og med den andre hånden gjør en 100-200 μm dypt snitt i sentrum og strekker halve diameteren på flippen for å lette T celle stamfar migrasjon inn i flik.
- Overfør tymusatrofi fliker til en ny 10 cm parabol fylt med fullstendig differensiering Media (komplett Media + 5 ng/mL mus IL-7 + 5 ng/mL mus FLT3L + 5 ng/mL SCF).
- Alternativt, hvis du bruker 3D kultur plater med lavere og øvre nivå rutenett, fylle begge rutenett med sterile PBS å hindre fordampning og tørking av hengende dråper.
- Overfør 30 μL av komplett Media som inneholder en dGuo-behandlet tymusatrofi flik fra trinn 3,6 i hver brønn av 3D kultur plate.
- Samle ikke-tilhenger T avstamning celler (iPSC-avledet umodne T-celler) fra OP9/DLL1 co-kultur (dager 16-21) (trinn 2.6.2) og resuspend ved 2-5 x 103 T avstamning celler per 20 μL Media.
- Tilsett 20 μL av T avstamning celle suspensjon til hver tymusatrofi flik i 3D kulturen plate. Ruge over natten ved 37 ° c med 5% CO2.
- Sett P200 Pipet til 30 μL og aspirer mediene etter pipettering flere ganger fra hver brønn for å fjerne alle cellene rundt tymusatrofi fliker. Kast medier og tilsett 30 μL av komplette medier. Gjenta denne prosedyren 5 – 7 ganger for å fjerne eventuelle ekstra umodne T-celler som ikke migrerer inn i fliker. Endre 25 – 30 μL av Media daglig etterpå.
- Bekreft dannelsen av en Halo av iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE) rundt fliker begynner på dag 4-5 av lys mikroskopi.
- Samle iTE daglig av pipettering media uten flik avbrudd. Bytt Media hver dag og fortsette samlingen opp til ca 12 dager.
- Høstet iTE-er er klare til bruk for molekylære analyser (figur 2, Figur 3, Figur 4og figur 5) eller in vivo transplantasjon.
4. utarbeidelse av antigen presentere celler (APC)
- Ofring en C57BL/6 musen av cervical forvridning og sted onto en laboratorium soaker mat idet beskrevet over.
- Fjern milten og plassere den på en 100 μm celle sil. Komprimere milten på sil ved hjelp av en 12 mL sprøyte stempel for å gjøre en enkelt celle suspensjon.
- Overfør celle fjæringen gjennom et sterilt 40 μm celle sil. Sentrifuger suspensjonen på 300 x g i 5 min ved 4 ° c til pellet cellene.
- Aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i 2 mL ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffer å utelukke røde blodlegemer (RBC). Ruge i 5 minutter ved RT.
- Slukke ACK lyse buffer ved å legge til 10 mL PBS. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Aspirer den supernatanten og resuspend celle pellet i 10 mL av komplette medier og overføre til en 10 cm steril Petri parabolen.
- Irradiate splenocytes med 3500 rad ved hjelp av en bestråling enhet (γ-stråling) for å hindre celle spredning.
- Umiddelbart returnere bestrålt celler til en 37 ° c inkubator og kultur over natten.
- Bruk bestrålt celler som APC eller fryse i cellen bankmann.
5. pulserende APC med antigen
- Count Live bestrålt APC ved hjelp av en Neubauer hemocytometer og trypan blå farge. Ruge APC med peptider (hgp100) eller nucleoprotein i 30 min ved 37 ° c.
- Vask APC to ganger med 10 mL PBS for å fjerne ekstra peptid.
- Count iTE og bland med APC i en 1:1 ratio i komplette medier med 100 IU IL-2 og 5 ng/mL IL-7. Alikvot 100 μL av blandingen av celler (total konsentrasjon: 1 x 106 celler/ml) i hver brønn av en ultra-lav vedlegg U bunnen 96 brønn plate og kultur for 48 h ved 37 ° c.
- Etter 48 h, Overfør celler til en ny plate ved hjelp av en flerkanals pipette og passasje hver 2-3 dager etterpå.
-
På dag 3, analysere cytokin sekresjon profil ved farging cellene med intracellulære antistoff og analysere ved flyt flowcytometri (Figur 3).
- Tilsett 0,67 μL/mL protein transport hemmer (f.eks. GolgiStop) og ruge ved 37 ° c i 6 timer for å øke intracellulære akkumulering av cytokiner. Vask med 10 mL PBS.
- Resuspend celler i 3 mL kulde (4 ° c) PBS og tilsett langsomt 1 mL kald 4% paraformaldehyde (PFA) løsning.
- Etter 10 min, spinn ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c, kast supernatanten og vask med 10 ml PBS.
- Resuspend celler i 1 mL PBS + 1% FBS + 0,1% ioniske overflateaktivt middel, og plasser i 4 ° c i 10 – 15 min.
- Legg til antistoffer, Beskytt prøver fra lys og plasser i 4 ° c i 30 minutter.
- Snurr ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c, kast supernatanten og vask med 10 ml PBS.
- Snurr ned celler ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c og resuspend celler i 1 ml PBS. Cellene er klare til å analyseres i en strømnings flowcytometer.
Representative Results
Co-kultivert fosterets thymuses var delt å analysere om iPSC-avledet T avstamning celler kan migrere inn i tymusatrofi fliker. Unseeded kontroll fliker hadde et vev arkitektur preget av en astrocytt-lignende tymusatrofi epitel Web17, utplassert av endogene CD3+ celler. På den annen side, tymusatrofi fliker seeded med iPSC-avledet umodne T-celler ble repopulated med CD3+ mononukleære celler, indikerer migrering av IPSC-avledet umodne T-celler i fliker (figur 2A).
T-celler som utvandret til og modnet innenfor tymusatrofi mikromiljøet senere egressed som iTE. For å teste sine fenotypiske karakterisering, flyt analytiske analyse av C57BL6 thymocytes, Pmel iPSC-avledet umodne T-celler (extrathymic), og celler som egressed fra tymusatrofi fliker (iTE) ble utført. Extrathymic T-celler på OP9/DLL1 viste CD4+CD8+ (DP) T celler og CD8αSP T celler uten uttrykk for den positive markering markør MHC-i, mens iTE hadde en klar befolkning på CD8αSP MHC-i+ T Cell fenotype, indikerer deres vellykket passasje gjennom positive valg før egressing fra tymusatrofi fliker. iTE konsekvent uttrykke MHC-I og CD62L, som er markører forbundet med høy proliferativ kompetanse, cytokin produksjon, perifere overlevelse, og lymfoide homing18,19,20. Denne fenotype er konsistent med m2 SP-thymocytes som er den mest modne bestanden av enkelt positive T-celler i thymus20, noe som tyder på at iTE har gått gjennom en normal tymusatrofi utviklingsmessige program (Figur 3). Å overvåke effektiviteten av iTE generasjon, celler som hadde egressed fra individuelle tymusatrofi fliker ble isolert. På dag 7, tymusatrofi fliker generert et gjennomsnitt på 1 x 103 Live CD8SP CD 45.1+ CD3+ iTE per dag (Figur 3B). En tilsvarende hastighet på iTE produksjon er observert fra dag 6 til dag 12 av 3D tymusatrofi co-kultur.
Antigen-avhengig aktivering og sekresjon av cytokiner ble analysert for å observere funksjonelle egenskaper thymically utdannet iPSC-avledet umodne T-celler. I nærvær av en irrelevant peptid (nucleoprotein), Pmel-iTE ikke løslate betydelige mengder av TNF-α, IL-2, eller IFN-γ. Når stimulert med beslektet peptid for Pmel T-celler (hgp100), Pmel-iTE sluppet robuste mengder TNF-α og IL-2, mens også produsere lave mengder IFN-γ (Figur 4), som indikerer at Thymically utdannet iTE kan gjenkjenne sine beslektet peptid og skiller effektor cytokiner med en profil som ligner på naturlige nylige tymusatrofi nybyggere (RTE).
For å undersøke transcriptional forskjellene mellom iPSC-avledet T avstamning celler differensiert på OP9/DLL1 med eller uten tymusatrofi utdanning (dvs. iTE versus extrathymic T-celler), RNA-SEQ analyse ble utført på disse to populasjoner og sammenlignet til at av DP T avstamning celler differensiert ved hjelp OP9/DLL1 (DP) og primære naiv CD8+ Pmel T celler. Uttrykket av 102 gener som spiller avgjørende roller i T Cell Ontogenese, thymocyte aktivisering, og hukommelse formasjon ble analysert15,20,21,22. En rektor komponent analyse av de fire studert populasjoner viste at extrathymically generert DP og CD8SP T-celler gruppert sammen, mens iTE gruppert nærmere naive T-celler (figur 5). Kollektivt disse dataene viser at iTE har en fenotype nærmere naiv T-celler enn do T avstamning celler generert av extrathymic metoder.
Figur 1 : Skjematisk oversikt over differensiering av IPSC til iTE bruker OP9/DLL1 og 3D tymusatrofi kultur. Protokollen omfatter tre separate differensiering trinn; (Venstre) fra IPSC celler til blodkreft avstamning celler på OP9/DLL1 (dag 0 til 6), (midten) fra blodkreft avstamning celler til UMODNE T celler på OP9/DLL1 med cytokiner (dag 6 til 16 – 21), og (høyre) fra umodne T-celler (dag 16-21) til iTE ved hjelp av en 3D tymusatrofi kultur system. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Immuno-Histochemistry av tymusatrofi fliker seeded med IPSC-avledet umodne T-celler. Topp: H & E farging av en tymusatrofi flik med og uten seeding av iPSC-avledet umodne T-celler. Fra andre topp til bunn: konfokalmikroskopi bilder av delt fliker beiset med DAPI (nucleus), CD3 (T-celle), og slå sammen. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : iTE viser en post-Tymusatrofi T celle fenotype. (A) FACS analyser av thymocytes, extrathymic T-celler (OP9/DLL1 co-kultur system) og Pmel-iTE. Levende celler var gated på congenic CD45+. CD8 SP populasjoner ble videre analysert for CD62L og MHC-I uttrykket. (B) gjennomsnittlig antall CD8SP CD 45.1 iTE produsert over natten per flik 7 dager etter pre-seeding. Data ble samlet inn fra 12 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : iTE produserer ulike cytokiner ved antigen-spesifikk stimulering. FACS analyser av intra-Cellular produksjon av cytokiner av iTE. iTE var co-kultivert med APCs pre-lastet med irrelevante (nucleoprotein) eller beslektet (hgp100) peptid i tre dager. Tallene vist i øvre høyre kvadranter indikere prosenter av iTE produsere cytokin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Hel-transcriptome analyse avslører et skifte i iTE genet uttrykk mot en NAIV CD8 + T celle program. Prinsippet komponent analyse (PCA) av RNA-SEQ data fra DP, extrathymic CD8 SP, iTE, og naive T celler. (Analyse av 102 gener knyttet til tymusatrofi differensiering ved hjelp av offentlig database GSE105110) 15. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Bruke T-iPSC å regenerere tumor antigen-spesifikke T-celler kan overvinne mange av dagens hindringer ACT ved å generere små celler med forbedret utholdenhet. Selv om flere metoder bruker OP9/DLL1 co-kultur systemet har blitt rapportert å generere CD8 SP celler6,7,10,13 som uttrykker CD8 molekyler og tumor antigen-spesifikke TCRs, global Gene uttrykks mønstre og funksjonell analyse viser at disse extrathymically generert CD8 SP-celler er forskjellige fra naive T-celler (Figur 4). Her beskriver vi et 3D tymusatrofi kultur system som kan generere iPSC-avledede tymusatrofi nybyggere (iTE) med høy troskap og homogenitet fra murine T-iPSC. iTE ligne naiv T-celler i globale genet uttrykk mønster og i funksjonalitet, for eksempel minne formasjon og in vivo anti-tumor effekt mot etablerte tumor15.
Den klassiske FTOC systemet er en måte å recapitulate tymusatrofi utvalg in vitro. Det har vært brukt for å studere intra-tymusatrofi utvikling av thymocytes23, og det er noen rapporter om FTOC brukes til å generere RTE24. FTOC-systemet har imidlertid flere begrensninger. For å håndtere mangelen på oksygen i en kunstig organ kultur, flere grupper har brukt enten en semi-tørr membran basert kultur23, eller høy oksygen nedsenking kultur systemer25. Men ingen aktuelle metoder kan stadig generere en homogen befolkning på post-tymusatrofi T-celler. For å overkomme begrensningene i det klassiske FTOC-systemet, utviklet vi et 3D-tymusatrofi kultur system som gir tekniske forbedringer i forhold til konvensjonelle metoder15. For eksempel, ved hjelp av vår 3D tymusatrofi kultur metode, maksimal oksygen utveksling og fravær av overflate-flik mekanisk stress holde tymusatrofi fliker i et mer fysiologisk miljø. I tillegg langsiktig kultur tillater eldre T-celler til utgående naturlig fra tymusatrofi fliker. Endelig sanntid observasjon og mikro-manipulasjon aktivere Media utveksling og en konstant samling av iTE uten fysisk forstyrrer tymusatrofi fliker. Således, det 3D tymusatrofi kulturen metoden skaffer betydelig teknisk forbedringer likeledes idet en allé å studere thymically valgt naiv T-celler det var ikke tidligere anvendelig.
Det er flere viktige punkter for den vellykkede generasjonen av iTE bruker denne 3D tymusatrofi kultur system. Kvaliteten på FBS og kultur forhold er avgjørende for å opprettholde utvidelsen av OP9/DLL1 celler uten å miste sin evne til å støtte iPSC differensiering. Derfor anbefaler vi forhånds evaluering av FBS mye samt gjennomgående passaging på 80% confluency for å hindre celle differensiering og senescence. I tillegg er en confluent OP9/DLL1 kultur kreves for in vitro differensiering av IPSC i umodne T-celler, som forskjeller i confluency kan påvirke deres effektivitet. Endelig er den embryonale alder av tymusatrofi fliker avgjørende for generering av iTE. Vi anbefaler å bruke E 14.5-15,5 tymusatrofi fliker.
Som med alle nye protokoller, denne metoden har begrensninger og er gjenstand for forbedring. Kulturen teknikken presenteres her genererer ca 1000 iTE per tymusatrofi flik per dag for en periode på to uker. Økt iTE-generering kan være mulig med ytterligere modifikasjoner, inkludert optimalisering av oksygen konsentrasjon, medie volum og type 3D-kultur plate. Addisjon eller flytting av cytokiner, likeledes idet endre inne cytokin konsentrasjonen, kunne også levere å forbedret iTE utbytte.
Gitt at 3D tymusatrofi kultur system som presenteres her kan generere tymusatrofi nybyggere i et helt ex vivo -system, kan denne teknikken brukes til en rekke immunologiske og adoptiv celle overføring forskningsprosjekter inkludert, men ikke begrenset til T celle differensiering, post-tymusatrofi T celle modning, og generering av antigen-spesifikke T-celler fra blodkreft stamfar eller stamceller. Selv om denne metoden ikke er direkte anvendelig på menneskelige prøver, iTE og 3D-tymusatrofi kultur system holder stort potensial for elucidating den molekylære mekanismer av positive og negative valg og kan forenkle opprettelsen av et kultur system som gjør generering av klinisk relevant tumor antigen-spesifikke naiv-lignende T-celler for ACT.
Disclosures
Forfattere Raul Vizcardo, Nicholas D. Klemen, og Nicholas P. Restifo er oppfinnere på ventende internasjonale patentsøknad PCT/US2017/65986, arkivert 13 desember 2017, med tittelen "metoder for å utarbeide en isolert eller renset befolkning på Tymusatrofi Emigrant Cells og metoder for behandling bruke samme. "
Acknowledgments
Vi takker Hiroshi Kawamoto og Kyoko Masuda for vennlig å gi OP9/DLL1 cellelinje. Vi takker Alan B. Hoofring og Erina Z. Han for grafisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av intramural forsknings program for det amerikanske National Cancer Institute (ZIA BC010763) og kreft Moonshot program for Center for Cell-based Therapy ved NCI, NIH. Verket ble også støttet av Milstein Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| 2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| MEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Cell Culture Vessels and others | |||
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12 mL Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
| Cell strainer 100 μm | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Cell strainer 40 μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
| Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
| Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
| Experimental Cell lines | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Experimental mouse models | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| Antibodies | |||
| Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
| Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
| Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
| Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
| Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
| Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
| Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
| Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
| Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
| Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
| Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
| Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
| Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
| Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
| Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |
References
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).
- Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P.
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
- Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).
- Themeli, M., et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).
- Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes. Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
- Serwold, T., et al. T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).
- Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution. Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Rosen, S. D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).
- Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection. Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).
- Best, J. A., et al. Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).
- Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).
- Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture. Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).
- Ueno, T., et al. Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus. Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).
- Watanabe, Y., Katsura, Y. Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration. European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).
